荧光微量检测细胞内DNA与蛋白质含量*
作者：王炜 廖国宁 季金林 雷景迈 何善述
单位：同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030
关键词：荧光光度测定法；DNA微量测定；蛋白质；细胞增殖
同济医科大学学报990330摘要 应用荧光试剂(33258 Hoechst)微量测定细胞内DNA含量，应用荧光胺(Fluorescamine)微量测定细胞内蛋白质含量。结果：荧光试剂与DNA的A-T碱基形成复合物后，其激发波长(EX)由320 nm移至350 nm，发射波长(EM)由480 nm移至460 nm，且荧光强度大为增强。荧光胺与蛋白质反应生成强荧光化合物，在EX 390 nm，EM 475 nm条件下最低检测限为0.5 μg/μl。该法操作简便，微量快速，重复性好。可用于荧光微量测定DNA与蛋白质含量，还可用于观察细胞的增殖。
Microfluorometric Determination of Intracellular DNA and Protein
, 百拇医药
Content and Its Application
Wang Wei, Liao Guoning, Ji Jinlin Lei Jingmai et al
Department of Biochemistry,School of Basic Medical Sciences,Tongji MedicalUniversity, Wuhan 430030
Abstract A microfluorometric method is described for the determination of intracellular DNA content with 33258 Hoechst fluorochrome as well as the determination of intracellular protein content with fluorescamine. The results showed that the fluorochrome reagent presented maximal excitation and emission at 320 nm and 480 nm, respectively. When the fluorochrome reagent reacted with DNA samples,these values were shifted to 350 nm and 460 nm, respectively, and the fluorescence intensity of the compound was greatly enhanced upon binding to the A-T-rich regions of DNA. The reaction of fluorescamine with the protein formed fluorescence compound. At maximal excitation 390 nm and emission 475 nm was capable of accurately quantitating as little as 0.5 μg/μl protein. Microfluorometric determination was a simple and rapid method, and had a good reproducibility. It could be used to determine intracellular DNA and protein content and to observe cell proliferation.
, 百拇医药
Key words fluorimetry detection; DNA microassay; protein microassay; cell proliferation
在细胞水平研究中，经常要了解细胞的存活与增殖情况。常用的检测方法为活细胞计数法和同位素掺入法(如3H-TdR掺入法)。前者因直接计数细胞，操作繁琐，结果易受主观因素影响；后者要使用放射性同位素，易污染环境，且需特殊检测仪器。我们在研究肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖中，根据文献[1,2]，应用荧光试剂(33258 Hoechst)检测PASMC内DNA含量；用荧光胺(Fluorescamine，Fluram)检测PASMC内蛋白质含量。此法可代替细胞计数和3 H-TdR掺入法，可作为研究某些细胞因子促细胞增殖效应的指标。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 检测DNA的试剂：荧光试剂(33258 Hoechst)购自Sigma公司，用双蒸水配成1.5×10-4 mol/L，临用前用SSC溶液(0.154 mol/L氯化钠-0.015 mol/L柠檬酸三钠，pH 7.0)稀释5倍，贮于冰箱，4 ℃可保存2周。胸腺DNA标准品：购自Sigma公司的胸腺DNA溶于SSC溶液(1 g/L)。
1.1.2 检测蛋白质的试剂：荧光胺(Fluorescamine，Fluram)购自Sigma公司，用丙酮配成300 mg/L，贮于冰箱至少可稳定12周。标准蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司，溶于0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，pH 8.0，其浓度为500 mg/L。
1.1.3 仪器：日立850型荧光分光光度计。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 DNA测定：将本课题组培养的猪肺动脉平滑肌细胞，先吸尽96孔培养板中培养液，用磷酸盐缓冲液洗2次，再加入0.1 mol/L NaOH 150 μl破细胞，然后吸入EP管中，贮于-20 ℃待测或立即测定；即吸取细胞液20 μl，用0.1 mol/L KH2PO4调至pH 7.0，再用SSC液补足至200 μl，然后加入荧光试剂100 μl，混匀，暗处放置10 min，以激发波长(EX)350 nm，发射波长(EM)460 nm读取荧光读数。
1.2.2 蛋白质测定：将本课题组培养的猪肺动脉平滑肌细胞，先吸尽96孔培养板中培养液，用磷酸盐缓冲液洗2次，各孔加入10 g/L SDS 100 μl溶解细胞并转至EP管中，再加重蒸水至1.5 ml，10 000 r/min，离心10 min，取上清液用Na2HPO4调pH至7.0，贮于-20 ℃待测或立即测定；即吸取蛋白质提取液100 μl，加0.05 mol/L，pH 8.0的PBS 100 μl、荧光胺试剂100 μl后立即混匀(必须在10 s内混匀，否则影响荧光胺与蛋白质产生荧光化合物的反应)。在反应后5～30 min内读取荧光读数。
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2 结果
2.1 细胞内DNA的检测
2.1.1 游离荧光试剂以及荧光试剂-DNA复合物的EX和EM曲线：从附表可见，游离荧光试剂的EX和EM分别为320 nm和480 nm；当其与DNA的A-T碱基形成复合物后，其EX和EM分别移至
附表 游离荧光试剂及荧光试剂-DNA复合
物在各种EX、EM的荧光读数 EX荧光读数
EM荧光读数
波长
(nm)
游离荧
光试剂
, http://www.100md.com
荧光试剂
与DNA
复合物
波长
(nm)
游离荧
光试剂
荧光试剂
与DNA
复合物
300
13.38
44.70
, 百拇医药
410
3.812
32.72
310
16.89
50.82
420
3.249
50.17
320
19.18
66.01
430
, 百拇医药
3.950
68.95
330
17.95
82.43
440
4.668
82.70
340
13.89
91.89
450
5.530
, http://www.100md.com
90.86
350
9.412
92.76
460
6.131
92.34
360
6.284
76.96
470
6.645
87.51
, http://www.100md.com
370
3.889
53.58
480
6.820
78.64
380
2.219
29.27
490
6.799
67.82
390
, http://www.100md.com
1.094
12.29
500
6.592
57.11
400
1.001
4.790
510
6.039
46.68
350 nm和460 nm，并且荧光强度大为增强。
, 百拇医药
2.1.2 标准胸腺DNA的线性关系：标准胸腺DNA在30 μg/μl范围内呈良好的线性关系(r=0.9945)；最低检测限为0.5 μg/μl。其变异系数为3.4%(n= 20)。
2.1.3 不同细胞数与FI的关系：细胞数在0.1×104～2.4×104范围内与FI呈正相关，线性关系良好(r = 0.9921)。并与MTT法[4]进行对比，二者均显示良好的线性关系。比色液在室温(10～25 ℃)放置(不需放于暗处)40 min对结果没有影响。
2.2 细胞内蛋白质的检测
2.2.1 标准曲线的线性关系： BSA在50 μg/μl范围内与FI呈良好的线性关系(r= 0.9989)；最低检测限为0.5 μg/μl。其变异系数为3.0%(n=20)。
, 百拇医药 2.2.2 不同细胞数与FI的关系： 细胞数在0.1×104～2.4×104范围内与FI呈正相关，线性关系良好。在pH 8～9时，荧光胺与蛋白质反应生成强荧光物质；因此，本法选用0.05 mol/L，pH 8.0 PBS具有较大的缓冲容量，使反应体系稳定维持在pH 8～9。3 讨论
常用于生物组织中DNA定量测定的方法有紫外分光法、二苯胺显色法及无机磷测定法等，但这些方法需要样品量大，而且蛋白质和RNA对其干扰大，故用于测定细胞内的微量DNA就不够灵敏。本文根据文献报道，应用荧光试剂(33258 Hoechst)微量测定细胞内DNA含量，其原理是荧光试剂与DNA的A-T碱基形成复合物后，其发射波长改变，荧光强度增加；而且混杂一定量的蛋白质和RNA对测定结果的干扰极微；其细胞用量约为1×104。而且将本法与目前常用的细胞存活、增殖的指标——MTT法进行了比较，二者均具有良好的线性关系。
常用于蛋白质定量测定的方法不少，如凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法及紫外光谱吸收法等，但由于这些方法的灵敏度较低，所需样品量大，操作过程较繁杂等原因不宜用来检测培养细胞内的蛋白质含量。本文根据文献报道，应用荧光胺检测细胞内蛋白质含量，其原理是荧光胺与蛋白质的伯氨基(primary amine)反应生成强荧光化合物，其最大EX为390 nm，最大EM为475 nm。该法操作简便，快速，重复性好。
, 百拇医药
本课题组在研究多胺[3]及PDGF(血小板源性生长因子)促猪PASMC增殖的实验中，应用本法测定细胞内DNA含量，并用MTT法同时测定在不同剂量的PDGF对猪PASMC的增殖效应，二者均能作为观察细胞增殖的指标。此法可代替细胞计数和3 H-TdR掺入法，可作为研究某些细胞因子促细胞增殖效应的指标。
作者简介：* 国家自然科学基金资助项目(No.39270295) 王 炜，男，1943年生，副教授
参考文献
1 Cesarone C F,Bolognesi C, Santi L. Improved microfluorometric DNA determination in biological material using 33258 Hoechst. Anal Biochem,1979,100:188
, 百拇医药
2 Bohlen P ,Stein S,Dairman W et al. Fluorometric assay of proteins in the nanogram range. Arch Biochem Biophys,1973,155:213
3 廖国宁，雷景迈，何善述.多胺在低氧内皮细胞条件培养基促猪肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用. 同济医科大学学报，1998，27(4):249
4 朱文清，金慰芳，张丽丽等.MTT法分析培养成骨细胞的存活和增殖能力. 上海医科大学学报，1995，22(4):254
(1998-10-21 收稿), http://www.100md.com
单位：同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030
关键词：荧光光度测定法；DNA微量测定；蛋白质；细胞增殖
同济医科大学学报990330摘要 应用荧光试剂(33258 Hoechst)微量测定细胞内DNA含量，应用荧光胺(Fluorescamine)微量测定细胞内蛋白质含量。结果：荧光试剂与DNA的A-T碱基形成复合物后，其激发波长(EX)由320 nm移至350 nm，发射波长(EM)由480 nm移至460 nm，且荧光强度大为增强。荧光胺与蛋白质反应生成强荧光化合物，在EX 390 nm，EM 475 nm条件下最低检测限为0.5 μg/μl。该法操作简便，微量快速，重复性好。可用于荧光微量测定DNA与蛋白质含量，还可用于观察细胞的增殖。
Microfluorometric Determination of Intracellular DNA and Protein
, 百拇医药
Content and Its Application
Wang Wei, Liao Guoning, Ji Jinlin Lei Jingmai et al
Department of Biochemistry,School of Basic Medical Sciences,Tongji MedicalUniversity, Wuhan 430030
Abstract A microfluorometric method is described for the determination of intracellular DNA content with 33258 Hoechst fluorochrome as well as the determination of intracellular protein content with fluorescamine. The results showed that the fluorochrome reagent presented maximal excitation and emission at 320 nm and 480 nm, respectively. When the fluorochrome reagent reacted with DNA samples,these values were shifted to 350 nm and 460 nm, respectively, and the fluorescence intensity of the compound was greatly enhanced upon binding to the A-T-rich regions of DNA. The reaction of fluorescamine with the protein formed fluorescence compound. At maximal excitation 390 nm and emission 475 nm was capable of accurately quantitating as little as 0.5 μg/μl protein. Microfluorometric determination was a simple and rapid method, and had a good reproducibility. It could be used to determine intracellular DNA and protein content and to observe cell proliferation.
, 百拇医药
Key words fluorimetry detection; DNA microassay; protein microassay; cell proliferation
在细胞水平研究中，经常要了解细胞的存活与增殖情况。常用的检测方法为活细胞计数法和同位素掺入法(如3H-TdR掺入法)。前者因直接计数细胞，操作繁琐，结果易受主观因素影响；后者要使用放射性同位素，易污染环境，且需特殊检测仪器。我们在研究肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖中，根据文献[1,2]，应用荧光试剂(33258 Hoechst)检测PASMC内DNA含量；用荧光胺(Fluorescamine，Fluram)检测PASMC内蛋白质含量。此法可代替细胞计数和3 H-TdR掺入法，可作为研究某些细胞因子促细胞增殖效应的指标。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 检测DNA的试剂：荧光试剂(33258 Hoechst)购自Sigma公司，用双蒸水配成1.5×10-4 mol/L，临用前用SSC溶液(0.154 mol/L氯化钠-0.015 mol/L柠檬酸三钠，pH 7.0)稀释5倍，贮于冰箱，4 ℃可保存2周。胸腺DNA标准品：购自Sigma公司的胸腺DNA溶于SSC溶液(1 g/L)。
1.1.2 检测蛋白质的试剂：荧光胺(Fluorescamine，Fluram)购自Sigma公司，用丙酮配成300 mg/L，贮于冰箱至少可稳定12周。标准蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司，溶于0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，pH 8.0，其浓度为500 mg/L。
1.1.3 仪器：日立850型荧光分光光度计。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 DNA测定：将本课题组培养的猪肺动脉平滑肌细胞，先吸尽96孔培养板中培养液，用磷酸盐缓冲液洗2次，再加入0.1 mol/L NaOH 150 μl破细胞，然后吸入EP管中，贮于-20 ℃待测或立即测定；即吸取细胞液20 μl，用0.1 mol/L KH2PO4调至pH 7.0，再用SSC液补足至200 μl，然后加入荧光试剂100 μl，混匀，暗处放置10 min，以激发波长(EX)350 nm，发射波长(EM)460 nm读取荧光读数。
1.2.2 蛋白质测定：将本课题组培养的猪肺动脉平滑肌细胞，先吸尽96孔培养板中培养液，用磷酸盐缓冲液洗2次，各孔加入10 g/L SDS 100 μl溶解细胞并转至EP管中，再加重蒸水至1.5 ml，10 000 r/min，离心10 min，取上清液用Na2HPO4调pH至7.0，贮于-20 ℃待测或立即测定；即吸取蛋白质提取液100 μl，加0.05 mol/L，pH 8.0的PBS 100 μl、荧光胺试剂100 μl后立即混匀(必须在10 s内混匀，否则影响荧光胺与蛋白质产生荧光化合物的反应)。在反应后5～30 min内读取荧光读数。
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2 结果
2.1 细胞内DNA的检测
2.1.1 游离荧光试剂以及荧光试剂-DNA复合物的EX和EM曲线：从附表可见，游离荧光试剂的EX和EM分别为320 nm和480 nm；当其与DNA的A-T碱基形成复合物后，其EX和EM分别移至
附表 游离荧光试剂及荧光试剂-DNA复合
物在各种EX、EM的荧光读数 EX荧光读数
EM荧光读数
波长
(nm)
游离荧
光试剂
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荧光试剂
与DNA
复合物
波长
(nm)
游离荧
光试剂
荧光试剂
与DNA
复合物
300
13.38
44.70
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410
3.812
32.72
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16.89
50.82
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3.950
68.95
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90.86
350
9.412
92.76
460
6.131
92.34
360
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76.96
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6.645
87.51
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370
3.889
53.58
480
6.820
78.64
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2.219
29.27
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6.799
67.82
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1.094
12.29
500
6.592
57.11
400
1.001
4.790
510
6.039
46.68
350 nm和460 nm，并且荧光强度大为增强。
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2.1.2 标准胸腺DNA的线性关系：标准胸腺DNA在30 μg/μl范围内呈良好的线性关系(r=0.9945)；最低检测限为0.5 μg/μl。其变异系数为3.4%(n= 20)。
2.1.3 不同细胞数与FI的关系：细胞数在0.1×104～2.4×104范围内与FI呈正相关，线性关系良好(r = 0.9921)。并与MTT法[4]进行对比，二者均显示良好的线性关系。比色液在室温(10～25 ℃)放置(不需放于暗处)40 min对结果没有影响。
2.2 细胞内蛋白质的检测
2.2.1 标准曲线的线性关系： BSA在50 μg/μl范围内与FI呈良好的线性关系(r= 0.9989)；最低检测限为0.5 μg/μl。其变异系数为3.0%(n=20)。
, 百拇医药 2.2.2 不同细胞数与FI的关系： 细胞数在0.1×104～2.4×104范围内与FI呈正相关，线性关系良好。在pH 8～9时，荧光胺与蛋白质反应生成强荧光物质；因此，本法选用0.05 mol/L，pH 8.0 PBS具有较大的缓冲容量，使反应体系稳定维持在pH 8～9。3 讨论
常用于生物组织中DNA定量测定的方法有紫外分光法、二苯胺显色法及无机磷测定法等，但这些方法需要样品量大，而且蛋白质和RNA对其干扰大，故用于测定细胞内的微量DNA就不够灵敏。本文根据文献报道，应用荧光试剂(33258 Hoechst)微量测定细胞内DNA含量，其原理是荧光试剂与DNA的A-T碱基形成复合物后，其发射波长改变，荧光强度增加；而且混杂一定量的蛋白质和RNA对测定结果的干扰极微；其细胞用量约为1×104。而且将本法与目前常用的细胞存活、增殖的指标——MTT法进行了比较，二者均具有良好的线性关系。
常用于蛋白质定量测定的方法不少，如凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法及紫外光谱吸收法等，但由于这些方法的灵敏度较低，所需样品量大，操作过程较繁杂等原因不宜用来检测培养细胞内的蛋白质含量。本文根据文献报道，应用荧光胺检测细胞内蛋白质含量，其原理是荧光胺与蛋白质的伯氨基(primary amine)反应生成强荧光化合物，其最大EX为390 nm，最大EM为475 nm。该法操作简便，快速，重复性好。
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本课题组在研究多胺[3]及PDGF(血小板源性生长因子)促猪PASMC增殖的实验中，应用本法测定细胞内DNA含量，并用MTT法同时测定在不同剂量的PDGF对猪PASMC的增殖效应，二者均能作为观察细胞增殖的指标。此法可代替细胞计数和3 H-TdR掺入法，可作为研究某些细胞因子促细胞增殖效应的指标。
作者简介：* 国家自然科学基金资助项目(No.39270295) 王 炜，男，1943年生，副教授
参考文献
1 Cesarone C F,Bolognesi C, Santi L. Improved microfluorometric DNA determination in biological material using 33258 Hoechst. Anal Biochem,1979,100:188
, 百拇医药
2 Bohlen P ,Stein S,Dairman W et al. Fluorometric assay of proteins in the nanogram range. Arch Biochem Biophys,1973,155:213
3 廖国宁，雷景迈，何善述.多胺在低氧内皮细胞条件培养基促猪肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用. 同济医科大学学报，1998，27(4):249
4 朱文清，金慰芳，张丽丽等.MTT法分析培养成骨细胞的存活和增殖能力. 上海医科大学学报，1995，22(4):254
(1998-10-21 收稿), http://www.100md.com