细胞凋亡流式细胞仪分析方法的比较及选择*
作者：韦伟 龚建平 裘法祖
单位：同济医科大学附属同济医院分子医学中心,武汉 430030
关键词：细胞凋亡；定量分析；流式细胞术
同济医科大学学报990302 摘要 以凋亡诱导剂喜树碱影响下的HL-60细胞为检测对象，对以流式细胞仪为基础建立的3种细胞凋亡定量分析方法，进行了敏感性和特异性比较，结果： 3种方法对凋亡均有定性和定量作用，均能同时提供细胞周期方面的信息。加入喜树碱(CAM)120 min后，低分子量 DNA抽提后荧光染料(PI)染色法(Sub-G1法)和TdT 酶探测DNA 断端方法(TdT法)均可检测到凋亡细胞；而DNA变性后Y啶橙染色法(AO法)在加入CAM 100 min后，就能够证实细胞凋亡的存在。TdT法所显示的检测结果最清晰、直观。Sub-G1法操作最简便、迅速，费用最低。结论： AO法敏感性好；TdT法更适合于细胞凋亡的细胞周期特异性分析； Sub-G1法最具实用性。
, http://www.100md.com
Selection and Comparison of Flow Cytomytry Methods for Cell
Apoptosis Quantitative Analysis
WeiWei, GongJianping, QiuFazu
Molecular Medicine, Tongji Hospital， Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract HL-60 cells influenced by CAM capable of inducing apoptosis were used as subjects.For detecting the sensitivity and specificity of the methods developed on the basis of flow cytometry (FCM), comparisons were made of the three methods for cell apoptosis quantitative analysis. It was found that All the three methods proved to be qualitatively and quantitatively effective for analyzing cell apoptosis and informative as to the effect of cell cycle.However,there were differences in specificity and sensitivity for three methods. Of the three methods,the method of DNA denaturation and staining with AO(AO method) proved to be of the highest sensitivity. The method of TdT for detecting DNA strand breaks (TdT method) had an advantage in the analysis of apoptosis cell cycle specificity.The fittest for practical use among the three methods proved to be the method based on the extration of low MW DNA and staining with PI(Sub-G1 method) because of its simplicity, quick responsiveness,low cost,objectivity in reflecting changes related to apoptosis and cell cycle.
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Key words cell apoptosis； quantitative analysis; flow cytometry
外科细胞分子生物学的主要内容是细胞增殖和细胞凋亡[1]，对两者的深入探讨，必然涉及到定量分析和细胞周期方面的分析研究。我们对利用流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)定量检测和分析细胞凋亡的3种常用方法，进行了若干方面的比较，以求对各种方法的检测性能及适用范围有进一步的了解。
1 材料与方法
1.1 检测样本
①HL-60细胞株，以 104～105/ml 密度悬浮培养于RPMI 1640中(含100 ml/L胎牛血清)24 h。②新鲜喜树碱(Camptothecin,CAM，Sigma公司)原液，以二甲亚砜(DMSO)和培养液稀释，使细胞在含 0.15 μmol/L的CAM培养液中生长3 h。对照组加入相同体积的DMSO。③每20 min取10 ml细胞悬液作为检测样本。
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1.2 检测方法
1.2.1 低分子量DNA抽提后荧光染料(PI)染色法(Sub-G1法)：①收集细胞-20 ℃、700 ml/L乙醇 固定，并于-20 ℃放置24～ 48 h；② 检测前，PBS洗涤过程中，根据细胞计数板或试管刻度，将样本细胞数调至约 5×106/ml；③洗涤后加入由0.05 mol/L 磷酸钠(9份)和25 mmol/L枸橼酸(1份)组成的PC缓冲液(pH 7.8，Sigma公司)50 μl，室温下放置15 min；④ 加PBS 0.5 ml，碘化丙啶(PI)50 μl(100 μg/ml，Sigma公司)和RNase A 10 μl(5 μg/ml，Sigma公司)于室温下、暗处放置 30 min；⑤ 流式细胞仪检测。
1.2.2 TdT酶探测DNA断端方法(TdT法)：①收集细胞以10 ml/L甲醛(pH 7.4)固定，并置于冰上15 min,再用700 ml/L冰冻乙醇固定，置于-20 ℃，24 ～48 h。② 检测前，将样本细胞调至5×106/ml。洗涤后,加入50 μl混合液〔10 μl反应缓冲液， 2.0 μl BrdUTP原液(Sigma公司)，0.5 μl含TdT酶的缓冲液(2.5 U/μl,Boehringer Mannheim公司)，5 μl氯化钴溶液，33.5 μl双蒸水〕，37 ℃，孵育40 min。③ 加入1.5 ml由1 ml/L Triton X-100和5 g/L 胎牛血清白蛋白组成的洗液，洗涤后再加入100 μl结合有抗BrdUrd 单抗的FITC溶液(BD公司，USA)，室温下孵育30 min。余同Sub-G1法④～⑤。
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1.2.3 DNA变性后丫啶橙(AO)染色法: ①～②同Sub-G1法之①～②；③ 加RNaseA 5μl，PBS 1 ml，室温下孵育30 min；④PBS洗涤后,加入0.1 mol/L HCl 0.5 ml，室温下放置30 min；⑤ PBS洗涤后，加入pH为2.6，由0.2 mol/L 磷酸钠(1份)和0.1 mol/L枸橼酸(9份)组成的PC缓冲液2 ml，内含A O 6 μg/ml(Polysciences公司)，室温下操作；⑥ 流式细胞仪检测。
1.2.4 DNA凝胶电泳：具体操作见文献[2]。
1.2.5 流式细胞仪检测：应用FACSort流式细胞仪(B D公司，USA)测定细胞荧光。Sub-G1法，PI标记的细胞之荧光经FCM 定量检测。AO与单链和双螺旋DNA相互作用后，分别发出红色和绿色荧光，被 FCM 分开定量。TdT法，被 PI(DNA)和 FITC(BrdUTP)标记的细胞，分别发出红色和绿色荧光，由 FCM 分别定量。 Sub-G1法以 CELL Quest软件分析， 后两者以LYSISⅡ软件分析。
, 百拇医药
检测结果采用方差分析进行统计学处理。
2 结果
结果见表1～2。表1为 HL-60细胞与CAM接触后的不同时间点,3种方法检测到的细胞凋亡情况。120 min时，Sub-G1法不足10%，TdT法不足5%，而AO法已达15.2%,且在100 min时，AO法显示出8.3%的结果时，Sub-G1法和TdT法仍是0%。
表2为 HL-60细胞与CAM接触后的不同时间,3种方法检测到的S期细胞变化情况。将加入CAM前检测到的S期细胞值定为100%。在100 min出现细胞凋亡后，AO法检测到的S期细胞降至90.1%，而Sub-G1法 和TdT法显示的S期细胞仍多于100%。从140 min开始，TdT法检测到的S期细胞与Sub-G1和AO两法所检测结果有显著性差异(P<0.01)。160 min，后两法检测到的S期细胞数已降至10%，但TdT法在180 min时，S期细胞仍高达18.4%。
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图1为 HL-60细胞与CAM接触后不同时间点的DNA Ladder显示情况。140 min后可见较清晰的DNA Ladder。
图1 DNA凝胶电泳检测结果
表1 三种方法检测的凋亡细胞百分率(
±s) 方法
n
与CAM接触时间(min)
0
80
100
, http://www.100md.com
120
140
160
180
Sub-G1法
6
0
0
0
9.1±0.31
20.8±1.33
32.1±1.77
33.5±1.27
, 百拇医药
TdT法
6
0
0
0
3.7±0.63
18.9±0.94
31.7±1.37
37.4±1.23
AO法
6
2.2±0.26
3.1±0.29
, 百拇医药
8.3±0.25
15.2±0.32
22.6±2.78
28.0±2.96
34.7±1.89
表2 三种方法检测的S期细胞百分率(±s) 方法
n
与CAM接触时间(min)
0
80
100
, 百拇医药
120
140
160
180
Sub-G1法
6
100
109.1±1.26
105.0±1.54
89.8±2.34
38.5±2.45
10.9±1.75
, http://www.100md.com 7.5±0.39
TdT法
6
100
118.2±1.91
111.5±2.02
99.6±2.55
58.4±2.20
22.3±2.90
18.4±2.03
AO法
6
, http://www.100md.com 100
122.3±2.09
90.1±1.77
69.0±2.49
15.7±1.48
10.1±0.97
6.0±0.58
3 讨论
细胞凋亡(Apoptosis,Ap)过程中，有许多形态、代谢、生化和分子方面的特异事件发生[3]，并成为研究细胞凋亡技术和方法的原理。
3.1 细胞凋亡模型
, 百拇医药 HL-60细胞是目前研究细胞凋亡较常用的细胞株[4]，本实验选用的凋亡诱导剂CAM，是拓扑酶I的抑制剂，它启动的细胞凋亡主要表现为对S 期细胞的影响[5]。
3.2 Sub-G1法
该方法实际上是检测细胞的DNA含量。 凋亡细胞内的核酸内切酶激活后，切割DNA，使细胞内存在着分子量不等的DNA片段。 经乙醇固定的凋亡细胞， 低分子量DNA可从凋亡细胞中被抽提出。之后，再以PI 对细胞染色时，PI只能与仍存于凋亡细胞胞核中不完整的、高分子量的DNA片段结合。因此，FCM检测凋亡细胞的DNA含量，低于G0/G1细胞的DNA含量，在DNA直方图中，凋亡细胞就表现为G0/G1期细胞峰前的亚二倍体峰(Sub-G1峰)(图2)[2,3]。在处理样本过程中，加用磷酸盐-枸橼酸缓冲液，可使凋亡细胞内的低分子量DNA抽提更充分， 避免了凋亡与非凋亡细胞群大量存在的同时，相互间出现重叠。
, 百拇医药
3.3 TdT法
凋亡细胞内的DNA被激活的核酸内切酶切割后，断点处存在着大量的3'-OH末端，在末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucletydil Transferase,TdT)作用下，BrdUTP结合至3'-OH末端[6]。再加入结合有抗BrdUrd的FITC以及PI进行双重标记染色 ， 经FCM检测，可区分出凋亡细胞(FITC，绿色荧光)和非凋亡细胞[7]。之所以样本先用甲醛处理，再以乙醇固定，是为了防止降解的DNA 从凋亡细胞中抽提出。
图3中,横、纵坐标分别为PI(DNA含量)和FITC的荧光强度。图中未见S期细胞，因其被诱导发生凋亡，“转移”至“Ap”处。从图3看，TdT法对凋亡细胞的细胞周期特异性，表达明显而直观。
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图3 TdT法检测结果示意图
3.4 AO法
AO是一种异染性染料。当其掺入双链DNA 时发绿色荧光[3]，与单链DNA缩合一起时发红色荧光。加入盐酸，使DNA发生部分变性。因凋亡细胞存在的DNA断点，使DNA螺旋结构稳定性下降， 则凋亡细胞对变性的敏感性增加[8]，产生大量单链DNA片段，经FCM 检测可区分出凋亡(红色荧光)与非凋亡细胞群(绿色荧光)。 图4为AO法检测结果，横、纵坐标分别为αt值〔αt=红色荧光/(红色荧光+绿色荧光)〕和总的荧光强度。凋亡细胞的αt值明显高于非凋亡细胞。
图4 AO法检测结果示意图
, 百拇医药
3.5 三种检测方法的比较
AO法是从DNA变性敏感性方面来鉴别凋亡细胞，不需要DNA断点的存在，不同于Sub-G1法和TdT法是基于核酸内切酶造成的DNA断裂。凋亡细胞DNA 对变性敏感性的增加，据认为是组蛋白水解所致，而组蛋白水解又先于DNA断裂的发生。综上所述，并结合表1和表2结果，我们认为AO法为三种检测方法中最敏感者。但由于M期细胞以及坏死细胞中的DNA对变性也非常敏感，相互存在时，彼此间可发生重叠。此外，由于AO法的重复性差，以及AO这一结合化学物质易造成FCM 细胞悬液提取管腐蚀、堵塞，而使其推广受到限制。 TdT法显示的检测结果内容最清晰、直观，尤其是细胞周期的变化信息。TdT法的敏感性和特异性均不如预料的好，加之其费用昂贵、操作复杂， 也同样面临着不易推广这一问题。 相对而言，Sub-G1法不仅对凋亡细胞检测时的敏感性较好，定量分析准确，能提供凋亡细胞的细胞周期特异性信息，而且其操作简便、迅速、费用低，易于推广，所以最具实用价值。
, 百拇医药 本实验还表明，与CAM孵育140 min后的HL-60细胞才能观察到较为清晰的 DNA Ladder，说明凋亡细胞只有超过一定比例后，才可显现出DNA Ladder(图1)。
(部分实验完成于美国Darzynkiewicz实验室)
* 国家自然科学基金资助项目(No.39670365，39725027，39730270)
作者简介:韦伟，男，1963年生，主治医生。现址：深圳市中心医院，深圳 518036
参考文献
1 龚建平,吴在德,裘法祖.外科细胞分子生物学.中华实验外科杂志, 1997，14(2):1
2 Gong J,Traganos F, Darzynkiewicz Z. A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometry.Anal Biochem,1994,218:314
, 百拇医药
3 Darzynkiewicz Z,Bruno S,Bino G D et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.Cytometry,1992，13:795
4 Wyllie A H. Apoptosis and the regulation of cell numbers in normal and neoplastic tissues: An overview.Cancer Metast Rev,1992,11:95
5 Gong J,Li X， Darzynkiewicz Z. Different patterns of apoptosis of HL-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin. J Cell Physiol,1993，157:263
, http://www.100md.com
6 Li X,Traganos F,Melamed M R et al.A single-step procedure for labeling DNA strand breaks with fluorescein- or BODIPY-conjugated deoxynucleotidine:Detection of apoptosis and bromodeoxyuridine incorporation. Cytometry,1995，20:172
7 Gorczyca W,Gong J,Darzynkiewicz Z et al. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick transla tion assays.Cancer Res,1993,52:1945
8 Darzynkiewicz Z. Acid-induced denaturation of DNA in situ as a probe of chromatin structure. Meth Cell Biol,1994,41:527
(1998-12-08 收稿), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属同济医院分子医学中心,武汉 430030
关键词：细胞凋亡；定量分析；流式细胞术
同济医科大学学报990302 摘要 以凋亡诱导剂喜树碱影响下的HL-60细胞为检测对象，对以流式细胞仪为基础建立的3种细胞凋亡定量分析方法，进行了敏感性和特异性比较，结果： 3种方法对凋亡均有定性和定量作用，均能同时提供细胞周期方面的信息。加入喜树碱(CAM)120 min后，低分子量 DNA抽提后荧光染料(PI)染色法(Sub-G1法)和TdT 酶探测DNA 断端方法(TdT法)均可检测到凋亡细胞；而DNA变性后Y啶橙染色法(AO法)在加入CAM 100 min后，就能够证实细胞凋亡的存在。TdT法所显示的检测结果最清晰、直观。Sub-G1法操作最简便、迅速，费用最低。结论： AO法敏感性好；TdT法更适合于细胞凋亡的细胞周期特异性分析； Sub-G1法最具实用性。
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Selection and Comparison of Flow Cytomytry Methods for Cell
Apoptosis Quantitative Analysis
WeiWei, GongJianping, QiuFazu
Molecular Medicine, Tongji Hospital， Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract HL-60 cells influenced by CAM capable of inducing apoptosis were used as subjects.For detecting the sensitivity and specificity of the methods developed on the basis of flow cytometry (FCM), comparisons were made of the three methods for cell apoptosis quantitative analysis. It was found that All the three methods proved to be qualitatively and quantitatively effective for analyzing cell apoptosis and informative as to the effect of cell cycle.However,there were differences in specificity and sensitivity for three methods. Of the three methods,the method of DNA denaturation and staining with AO(AO method) proved to be of the highest sensitivity. The method of TdT for detecting DNA strand breaks (TdT method) had an advantage in the analysis of apoptosis cell cycle specificity.The fittest for practical use among the three methods proved to be the method based on the extration of low MW DNA and staining with PI(Sub-G1 method) because of its simplicity, quick responsiveness,low cost,objectivity in reflecting changes related to apoptosis and cell cycle.
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Key words cell apoptosis； quantitative analysis; flow cytometry
外科细胞分子生物学的主要内容是细胞增殖和细胞凋亡[1]，对两者的深入探讨，必然涉及到定量分析和细胞周期方面的分析研究。我们对利用流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)定量检测和分析细胞凋亡的3种常用方法，进行了若干方面的比较，以求对各种方法的检测性能及适用范围有进一步的了解。
1 材料与方法
1.1 检测样本
①HL-60细胞株，以 104～105/ml 密度悬浮培养于RPMI 1640中(含100 ml/L胎牛血清)24 h。②新鲜喜树碱(Camptothecin,CAM，Sigma公司)原液，以二甲亚砜(DMSO)和培养液稀释，使细胞在含 0.15 μmol/L的CAM培养液中生长3 h。对照组加入相同体积的DMSO。③每20 min取10 ml细胞悬液作为检测样本。
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1.2 检测方法
1.2.1 低分子量DNA抽提后荧光染料(PI)染色法(Sub-G1法)：①收集细胞-20 ℃、700 ml/L乙醇 固定，并于-20 ℃放置24～ 48 h；② 检测前，PBS洗涤过程中，根据细胞计数板或试管刻度，将样本细胞数调至约 5×106/ml；③洗涤后加入由0.05 mol/L 磷酸钠(9份)和25 mmol/L枸橼酸(1份)组成的PC缓冲液(pH 7.8，Sigma公司)50 μl，室温下放置15 min；④ 加PBS 0.5 ml，碘化丙啶(PI)50 μl(100 μg/ml，Sigma公司)和RNase A 10 μl(5 μg/ml，Sigma公司)于室温下、暗处放置 30 min；⑤ 流式细胞仪检测。
1.2.2 TdT酶探测DNA断端方法(TdT法)：①收集细胞以10 ml/L甲醛(pH 7.4)固定，并置于冰上15 min,再用700 ml/L冰冻乙醇固定，置于-20 ℃，24 ～48 h。② 检测前，将样本细胞调至5×106/ml。洗涤后,加入50 μl混合液〔10 μl反应缓冲液， 2.0 μl BrdUTP原液(Sigma公司)，0.5 μl含TdT酶的缓冲液(2.5 U/μl,Boehringer Mannheim公司)，5 μl氯化钴溶液，33.5 μl双蒸水〕，37 ℃，孵育40 min。③ 加入1.5 ml由1 ml/L Triton X-100和5 g/L 胎牛血清白蛋白组成的洗液，洗涤后再加入100 μl结合有抗BrdUrd 单抗的FITC溶液(BD公司，USA)，室温下孵育30 min。余同Sub-G1法④～⑤。
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1.2.3 DNA变性后丫啶橙(AO)染色法: ①～②同Sub-G1法之①～②；③ 加RNaseA 5μl，PBS 1 ml，室温下孵育30 min；④PBS洗涤后,加入0.1 mol/L HCl 0.5 ml，室温下放置30 min；⑤ PBS洗涤后，加入pH为2.6，由0.2 mol/L 磷酸钠(1份)和0.1 mol/L枸橼酸(9份)组成的PC缓冲液2 ml，内含A O 6 μg/ml(Polysciences公司)，室温下操作；⑥ 流式细胞仪检测。
1.2.4 DNA凝胶电泳：具体操作见文献[2]。
1.2.5 流式细胞仪检测：应用FACSort流式细胞仪(B D公司，USA)测定细胞荧光。Sub-G1法，PI标记的细胞之荧光经FCM 定量检测。AO与单链和双螺旋DNA相互作用后，分别发出红色和绿色荧光，被 FCM 分开定量。TdT法，被 PI(DNA)和 FITC(BrdUTP)标记的细胞，分别发出红色和绿色荧光，由 FCM 分别定量。 Sub-G1法以 CELL Quest软件分析， 后两者以LYSISⅡ软件分析。
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检测结果采用方差分析进行统计学处理。
2 结果
结果见表1～2。表1为 HL-60细胞与CAM接触后的不同时间点,3种方法检测到的细胞凋亡情况。120 min时，Sub-G1法不足10%，TdT法不足5%，而AO法已达15.2%,且在100 min时，AO法显示出8.3%的结果时，Sub-G1法和TdT法仍是0%。
表2为 HL-60细胞与CAM接触后的不同时间,3种方法检测到的S期细胞变化情况。将加入CAM前检测到的S期细胞值定为100%。在100 min出现细胞凋亡后，AO法检测到的S期细胞降至90.1%，而Sub-G1法 和TdT法显示的S期细胞仍多于100%。从140 min开始，TdT法检测到的S期细胞与Sub-G1和AO两法所检测结果有显著性差异(P<0.01)。160 min，后两法检测到的S期细胞数已降至10%，但TdT法在180 min时，S期细胞仍高达18.4%。
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图1为 HL-60细胞与CAM接触后不同时间点的DNA Ladder显示情况。140 min后可见较清晰的DNA Ladder。
图1 DNA凝胶电泳检测结果
表1 三种方法检测的凋亡细胞百分率(
±s) 方法n
与CAM接触时间(min)
0
80
100
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120
140
160
180
Sub-G1法
6
0
0
0
9.1±0.31
20.8±1.33
32.1±1.77
33.5±1.27
, 百拇医药
TdT法
6
0
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3.7±0.63
18.9±0.94
31.7±1.37
37.4±1.23
AO法
6
2.2±0.26
3.1±0.29
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8.3±0.25
15.2±0.32
22.6±2.78
28.0±2.96
34.7±1.89
表2 三种方法检测的S期细胞百分率(
±s) 方法n
与CAM接触时间(min)
0
80
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120
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Sub-G1法
6
100
109.1±1.26
105.0±1.54
89.8±2.34
38.5±2.45
10.9±1.75
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TdT法
6
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118.2±1.91
111.5±2.02
99.6±2.55
58.4±2.20
22.3±2.90
18.4±2.03
AO法
6
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122.3±2.09
90.1±1.77
69.0±2.49
15.7±1.48
10.1±0.97
6.0±0.58
3 讨论
细胞凋亡(Apoptosis,Ap)过程中，有许多形态、代谢、生化和分子方面的特异事件发生[3]，并成为研究细胞凋亡技术和方法的原理。
3.1 细胞凋亡模型
, 百拇医药 HL-60细胞是目前研究细胞凋亡较常用的细胞株[4]，本实验选用的凋亡诱导剂CAM，是拓扑酶I的抑制剂，它启动的细胞凋亡主要表现为对S 期细胞的影响[5]。
3.2 Sub-G1法
该方法实际上是检测细胞的DNA含量。 凋亡细胞内的核酸内切酶激活后，切割DNA，使细胞内存在着分子量不等的DNA片段。 经乙醇固定的凋亡细胞， 低分子量DNA可从凋亡细胞中被抽提出。之后，再以PI 对细胞染色时，PI只能与仍存于凋亡细胞胞核中不完整的、高分子量的DNA片段结合。因此，FCM检测凋亡细胞的DNA含量，低于G0/G1细胞的DNA含量，在DNA直方图中，凋亡细胞就表现为G0/G1期细胞峰前的亚二倍体峰(Sub-G1峰)(图2)[2,3]。在处理样本过程中，加用磷酸盐-枸橼酸缓冲液，可使凋亡细胞内的低分子量DNA抽提更充分， 避免了凋亡与非凋亡细胞群大量存在的同时，相互间出现重叠。
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3.3 TdT法
凋亡细胞内的DNA被激活的核酸内切酶切割后，断点处存在着大量的3'-OH末端，在末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucletydil Transferase,TdT)作用下，BrdUTP结合至3'-OH末端[6]。再加入结合有抗BrdUrd的FITC以及PI进行双重标记染色 ， 经FCM检测，可区分出凋亡细胞(FITC，绿色荧光)和非凋亡细胞[7]。之所以样本先用甲醛处理，再以乙醇固定，是为了防止降解的DNA 从凋亡细胞中抽提出。
图3中,横、纵坐标分别为PI(DNA含量)和FITC的荧光强度。图中未见S期细胞，因其被诱导发生凋亡，“转移”至“Ap”处。从图3看，TdT法对凋亡细胞的细胞周期特异性，表达明显而直观。
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图3 TdT法检测结果示意图
3.4 AO法
AO是一种异染性染料。当其掺入双链DNA 时发绿色荧光[3]，与单链DNA缩合一起时发红色荧光。加入盐酸，使DNA发生部分变性。因凋亡细胞存在的DNA断点，使DNA螺旋结构稳定性下降， 则凋亡细胞对变性的敏感性增加[8]，产生大量单链DNA片段，经FCM 检测可区分出凋亡(红色荧光)与非凋亡细胞群(绿色荧光)。 图4为AO法检测结果，横、纵坐标分别为αt值〔αt=红色荧光/(红色荧光+绿色荧光)〕和总的荧光强度。凋亡细胞的αt值明显高于非凋亡细胞。
图4 AO法检测结果示意图
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3.5 三种检测方法的比较
AO法是从DNA变性敏感性方面来鉴别凋亡细胞，不需要DNA断点的存在，不同于Sub-G1法和TdT法是基于核酸内切酶造成的DNA断裂。凋亡细胞DNA 对变性敏感性的增加，据认为是组蛋白水解所致，而组蛋白水解又先于DNA断裂的发生。综上所述，并结合表1和表2结果，我们认为AO法为三种检测方法中最敏感者。但由于M期细胞以及坏死细胞中的DNA对变性也非常敏感，相互存在时，彼此间可发生重叠。此外，由于AO法的重复性差，以及AO这一结合化学物质易造成FCM 细胞悬液提取管腐蚀、堵塞，而使其推广受到限制。 TdT法显示的检测结果内容最清晰、直观，尤其是细胞周期的变化信息。TdT法的敏感性和特异性均不如预料的好，加之其费用昂贵、操作复杂， 也同样面临着不易推广这一问题。 相对而言，Sub-G1法不仅对凋亡细胞检测时的敏感性较好，定量分析准确，能提供凋亡细胞的细胞周期特异性信息，而且其操作简便、迅速、费用低，易于推广，所以最具实用价值。
, 百拇医药 本实验还表明，与CAM孵育140 min后的HL-60细胞才能观察到较为清晰的 DNA Ladder，说明凋亡细胞只有超过一定比例后，才可显现出DNA Ladder(图1)。
(部分实验完成于美国Darzynkiewicz实验室)
* 国家自然科学基金资助项目(No.39670365，39725027，39730270)
作者简介:韦伟，男，1963年生，主治医生。现址：深圳市中心医院，深圳 518036
参考文献
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(1998-12-08 收稿), http://www.100md.com