人体胃癌及癌旁细胞p21ras的表达与核型、DNA倍体关系的研究
作者：王昭 陈春莲
单位：同济医科大学基础医学院病理学教研室，武汉 430030 王昭；同济医科大学附属同济医院病理科，武汉 430030 陈春莲
关键词：胃肿瘤；癌旁异型增殖；原癌基因蛋白质P21(RAS)；细胞核形态计量参数；DNA倍体
同济医科大学学报990314
摘要 检测27例胃癌组织及癌旁异型增殖和癌外正常粘膜3组中p21ras表达、细胞核形态参数和DNA倍体分布类型。结果发现，异型增殖组织中p21ras阳性率最高。6种细胞核形态计量参数在3组之间的差异有极显著意义(P<0.01)，且回代正确率高达91.38%，这可能对胃癌和异型增殖的诊断具有意义。在27例胃癌组织中 ，胃癌细胞p21ras表达水平随着DNA倍体成倍增加而逐渐下降。而且胃癌细胞p21ras表达水平又明显低于异型增殖细胞。提示p21ras过度表达主要出现在细胞表型发生明显转化之间。
, 百拇医药
Study on the Relationship between Expression of p21ras,Nuclear
Features and DNA Ploidy in Gastric Carcinoma and Adjacent Dysplasia
Wang Zhao1,
Chen Chunlian2
1 Depatrtment of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
2 Department of Pathology, Tongji Hospital, Tongji Medical Univesity, Wuhan 430030
, http://www.100md.com
Abstract The expression of p21ras, and the nuclear morphometric parameters and DNA ploidy distribution pattem in three groups of tissues including gastric carcinoma, adjacent displasia and normal mucosa from 27 cases of gastric carcinoma were examined. The results showed that the positive ratio of p21ras expression was the highest in dysplasia. There was a very significant difference in the six nuclear morphometric parameters among the three groups (P<0.01) with the correct regressive rate of discriminant analysis being 91.38%, which may have diagnostic significance for gastric carcinoma and dysplasia. In 27 cases of gastric carcinoma, the expression level of p21ras in gastric carcinoma was obviously lower than in dysplasia, suggesting that the overexpression of p21ras in gastric carcinoma might be initiated before the transformation of cytophenotype.
, http://www.100md.com
Key words gastric carcinoma; stomach neoplasms; proto-oncogene protein p21(ras); image analysis, computer-assisted; DNA ploidies
原癌基因ras的表达产物p21ras参与细胞增殖和分化的调节，其过度表达则会引起肿瘤发生[1，2]，而肿瘤细胞核的形态、DNA倍体类型是反映肿瘤生物学行为的重要标志[3]。
1 材料与方法
1.1 材料
随机选取1993～1994年同济医科大学附属同济医院及协和医院的27例胃癌切除标本，除切取癌组织外，其中22例取癌旁异型增殖组织，9例取癌外(距癌组织8 cm以上)正常胃粘膜组织。
, http://www.100md.com
1.2 切片制备
标本用福尔马林液固定，石蜡包埋，作厚度为4 μm的连续切片，分别作HE染色、Feulgen染色及抗p21ras抗体的LSAB法免疫组织化学染色。
1.3 p21ras的免疫组织化学检测
抗p21ras单克隆抗体NCC-RAC-0011，LSAB试剂盒为丹麦DAKO公司生产。每张免疫组织化学切片均用LSAB法进行染色(抗体稀释度为1∶20)，同时设有阳性及阴性对照。
1.4 核形、DNA倍体测量方法
用德国KONTRON公司生产的IBAS全自动图像分析系统测量Feulgen染色切片中细胞核各种形态变量参数及DNA相对含量(倍体数)。
, http://www.100md.com
1.5 统计学方法
对不同数据分别进行χ2检验、方差分析及多元判别分析。
2 结果
2.1 p21ras表达水平
p21ras免疫组织化学染色切片中不着色者为染色阴性(-)，细胞浆内和(或)细胞膜上出现棕黄色颗粒者为染色阳性(图1)。癌组织、癌旁异型增殖和正常胃粘膜细胞p21ras表达阳性率分别为55.6%、59.1%及11.1%，经χ2检验，各组间差异有显著性意义(P<0.05)。
图1 胃粘膜不典型增生组织p21rasLSAB染色 ×400倍
, http://www.100md.com
2.2 DNA含量和DNA倍体分布类型
根据Feulgen染色切片(图2)DNA含量的直方图形式，将58个标本分为以下3种DNA倍体分布类型[4]。Ⅰ型：在二倍体或近二倍体区域内有一明确峰值；Ⅱ型：主要峰值位于四倍体或近四倍体部位；Ⅲ型：呈多峰形式或广泛弥散分布但无明显峰值出现。胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜DNA倍体分布类型见表1。
图2 胃癌细胞Feulgen染色 ×400倍
表1 胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜DNA倍体分布类型 DNA倍体
分布类型
胃癌
, 百拇医药 癌旁
异型增殖
正常
胃粘膜
合计
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
合计
6(22.2)
9(33.3)
12(44.5)
27
, 百拇医药
6(27.3)
13(59.1)
3(13.6)
22
7(77.8)
2(22.2)
0
9
19
24
15
58
( )内为%； χ2=16.77 P<0.01
, 百拇医药
2.3 细胞核的形态测量
胃癌细胞、癌旁异型增殖细胞和正常胃粘膜细胞6种形态参数变量的分析结果见表2。细胞核的6种形态参数进行多元判别分析时，细胞核的周长、面积、平均直径、凹凸度被列入判别函数，胃癌、癌旁异型增殖、正常胃粘膜的回代正确率达91.38%(表3)。表2 胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜细胞核各形态参数的单因素方差分析(
±s) 组 别
面积(μm2)
周长(μm)
平均直径(μm)
长轴(μm)
短轴(μm)
, 百拇医药
凸凹度(μm)
胃 癌
癌旁异型增殖
正常胃粘膜
46.28±10.95**
28.08±5.91**
21.52±2.77**
28.91±4.72**
23.97±2.61**
20.48±1.65**
, 百拇医药
8.74±1.46**
6.24±0.53**
4.78±0.33*
11.01
9.12
6.17
±1.92
±0.65
±0.47
6.05
4.33
, 百拇医药
3.55
±0.09
±0.43
±0.23
1.19±0.09**
1.12±0.06*
1.05±0.02**
各参数不同组别之间进行比较 *P<0.05 **P<0.01 2.4 胃癌细胞的p21ras表达、DNA倍体和核形的关系
27例胃癌p21ras表达与DNA倍体分布类型的关系见表4；将27例胃癌的6种核形态参数，以其平均值分为2组，分别比较它们与p21ras表达之间的关系(表5)。经卡方检验发现，胃癌细胞p21ras表达与各种形态参数之间并无明显相关性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
表3 胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜细胞形态参数的多元回归判别分析 原组别
回代组别
合计
胃癌
癌旁异
型增殖
正常胃
粘膜
胃癌
癌旁异型增殖
正常胃粘膜
24
, http://www.100md.com 2
0
3
20
0
0
0
9
27
22
9
表4 胃癌p21ras表达与DNA倍体分布类型的关系 p21ras表达
DNA倍体分布类型
, http://www.100md.com
合计
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
阳性
阴性
合计
阳性率(%)
5
1
6
83.3
6
3
, 百拇医药
9
66.7
4
8
12
33.3
15
12
27
55.6
表5 胃癌p21ras表达与细胞核形态参数的关系 参 数
p21ras表达
, 百拇医药
χ2
P值
阳性
阴性
面积(μm2)
≤46.28>46.28
11
4
5
7
2.77
>0.05
周长(μm2)
, 百拇医药
≤28.91
>28.91
10
5
5
7
1.69
>0.05
平均直径(μm2)
≤8.74
>8.74
7
8
, http://www.100md.com
9
3
2.23
>0.05
长轴(μm2)
≤11.01
>11.01
11
4
7
5
0.68
>0.05
, http://www.100md.com
短轴(μm2)
≤6.05
>6.05
7
8
8
4
1.08
>0.05
凹凸度
≤1.19
>7.19
9
, http://www.100md.com
6
4
8
1.90
>0.05
3 讨论
本实验发现，胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜细胞均有p21ras表达，但以癌旁异型增殖细胞表达水平为最高，与文献报道一致[5，6]，这提示p21ras过度表达主要出现在细胞表型发生明显转化之间。正常胃粘膜DNA倍体分布类型以Ⅰ型为主，癌旁异型增殖以Ⅱ型为主；而胃癌组织则以Ⅲ型为主。表明在胃粘膜上皮癌变过程中，DNA含量在不断增加，倍体分布的类型也有明显区别(P<0.01)。而且细胞核的形态参数均在逐渐增大，尤其是面积、周长、平均直径、凹凸度的差别极为明显(P<0.01)。多元判别分析结果表明：胃癌、癌旁异 型增殖及正常胃粘膜三组的回代正确率高达91.38%。似可作为诊断胃粘膜异型增殖和胃癌的形态学依据，文献上也有类似报告[7]。
, 百拇医药
在27例胃癌组织中，DNA倍体分布类型Ⅰ型者p21ras阳性率最高，Ⅱ型次之，Ⅲ型最低。表明胃癌细胞p21ras表达水平随着DNA含量的不断增多而逐渐下降。原癌基因ras的活化和过度表达主要出现在DNA倍体分布类型为Ⅰ型和Ⅱ型的癌组织(即DNA含量尚未出现成倍增加时)，当癌细胞DNA含量成倍增加时(Ⅲ型为主)，p21ras表达水平则明显下降。同样情况也见于膀胱癌。Czerniak发现癌前病变p21ras表达水平比早期胃癌要高[8]。而且在癌细胞中，p21ras的表达水平又随着倍体成倍增加而逐渐下降。因而可以认为，在细胞表型转化过程中，p21ras的过度表达对启动表型的转化至关重要，但对维持已转化了的表型特征则无作用。
胃癌细胞p21ras的过度表达与细胞核各种形态参数的关系，经χ2检验表明两者之间并无明显相关性(P>0.05)。说明p21ras表达水平与细胞核形态无直接关联，只与DNA含量有一定关联。Hamiton对46例胃癌标本的核形与DNA含量分析后，认为细胞核的大小与DNA含量并无显著相关性，而可能与细胞增殖周期、异染色质含量的变化及常染质的转录活动相关[3]。
, http://www.100md.com
作者简介:王昭，男，1968年生，硕士研究生 现址：首都医科大学附属北京友谊医院血液科，北京 100050
作者单位:同济医科大学基础医学院病理学教研室，武汉 430030
参考文献
1 Pronk G J, Miyatake S L, Tashiro K et al. The role of p21ras in receptor typrosine kinase signalling. Biochem Biophys Acta, 1994, 1198:131
2 Delue J, Finstud C, Guarini A et al. Abnormal regulation of mammalian p21ras contributes to malignant tumor growth in von recking hausen (type Ⅰ) neurofibromatosis. Cell, 1992,69:265
, 百拇医药
3 Hamilton P, Lewis C J, Neild T O et al. Morphometry of gastric carcinoma; its association with patient survival, tumor stage, and DNA ploidy. J Pathol, 1992, 168:201
4 Van V R, Bussel J B, Pharn L C et al. Image cytometry determination of ploidy level, proliferative activity, and nuclear size in series of 314 transitional bladder cell carcinoma. Hum Pathol, 1995, 26:3
5 Carneiro F, Teller R I, Lecllr P et al. Immunohistochemical analysis of ras oncogene p21 product in human gastric carcinomas and their adjacent mucosas. Pathol Res Pract, 1992,188:263
, http://www.100md.com
6 Karayiannis M, Holt C A, Lilly F et al. Expression of the ras oncoprotein in gastric carcinoma and adjacent mucosa. Anticancer Res, 1989, 6:1505
7 Rubin E M, Salter R, Donald E K et al. Comparative image cytometric DNA ploidy of liver cell dysplasia and hepatocellular carcinoma. Med Pathol, 1994,7:677
8 Czerniak B, Gurrido F, Mickey R et al. Expression of ras oncogene p21 protein in early gastric carcinoma and adjacent gastric epithelia. Cancer, 1989, 64:1467
(1997-03-28 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院病理学教研室，武汉 430030 王昭；同济医科大学附属同济医院病理科，武汉 430030 陈春莲
关键词：胃肿瘤；癌旁异型增殖；原癌基因蛋白质P21(RAS)；细胞核形态计量参数；DNA倍体
同济医科大学学报990314
摘要 检测27例胃癌组织及癌旁异型增殖和癌外正常粘膜3组中p21ras表达、细胞核形态参数和DNA倍体分布类型。结果发现，异型增殖组织中p21ras阳性率最高。6种细胞核形态计量参数在3组之间的差异有极显著意义(P<0.01)，且回代正确率高达91.38%，这可能对胃癌和异型增殖的诊断具有意义。在27例胃癌组织中 ，胃癌细胞p21ras表达水平随着DNA倍体成倍增加而逐渐下降。而且胃癌细胞p21ras表达水平又明显低于异型增殖细胞。提示p21ras过度表达主要出现在细胞表型发生明显转化之间。
, 百拇医药
Study on the Relationship between Expression of p21ras,Nuclear
Features and DNA Ploidy in Gastric Carcinoma and Adjacent Dysplasia
Wang Zhao1,
Chen Chunlian21 Depatrtment of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
2 Department of Pathology, Tongji Hospital, Tongji Medical Univesity, Wuhan 430030
, http://www.100md.com
Abstract The expression of p21ras, and the nuclear morphometric parameters and DNA ploidy distribution pattem in three groups of tissues including gastric carcinoma, adjacent displasia and normal mucosa from 27 cases of gastric carcinoma were examined. The results showed that the positive ratio of p21ras expression was the highest in dysplasia. There was a very significant difference in the six nuclear morphometric parameters among the three groups (P<0.01) with the correct regressive rate of discriminant analysis being 91.38%, which may have diagnostic significance for gastric carcinoma and dysplasia. In 27 cases of gastric carcinoma, the expression level of p21ras in gastric carcinoma was obviously lower than in dysplasia, suggesting that the overexpression of p21ras in gastric carcinoma might be initiated before the transformation of cytophenotype.
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Key words gastric carcinoma; stomach neoplasms; proto-oncogene protein p21(ras); image analysis, computer-assisted; DNA ploidies
原癌基因ras的表达产物p21ras参与细胞增殖和分化的调节，其过度表达则会引起肿瘤发生[1，2]，而肿瘤细胞核的形态、DNA倍体类型是反映肿瘤生物学行为的重要标志[3]。
1 材料与方法
1.1 材料
随机选取1993～1994年同济医科大学附属同济医院及协和医院的27例胃癌切除标本，除切取癌组织外，其中22例取癌旁异型增殖组织，9例取癌外(距癌组织8 cm以上)正常胃粘膜组织。
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1.2 切片制备
标本用福尔马林液固定，石蜡包埋，作厚度为4 μm的连续切片，分别作HE染色、Feulgen染色及抗p21ras抗体的LSAB法免疫组织化学染色。
1.3 p21ras的免疫组织化学检测
抗p21ras单克隆抗体NCC-RAC-0011，LSAB试剂盒为丹麦DAKO公司生产。每张免疫组织化学切片均用LSAB法进行染色(抗体稀释度为1∶20)，同时设有阳性及阴性对照。
1.4 核形、DNA倍体测量方法
用德国KONTRON公司生产的IBAS全自动图像分析系统测量Feulgen染色切片中细胞核各种形态变量参数及DNA相对含量(倍体数)。
, http://www.100md.com
1.5 统计学方法
对不同数据分别进行χ2检验、方差分析及多元判别分析。
2 结果
2.1 p21ras表达水平
p21ras免疫组织化学染色切片中不着色者为染色阴性(-)，细胞浆内和(或)细胞膜上出现棕黄色颗粒者为染色阳性(图1)。癌组织、癌旁异型增殖和正常胃粘膜细胞p21ras表达阳性率分别为55.6%、59.1%及11.1%，经χ2检验，各组间差异有显著性意义(P<0.05)。
图1 胃粘膜不典型增生组织p21rasLSAB染色 ×400倍
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2.2 DNA含量和DNA倍体分布类型
根据Feulgen染色切片(图2)DNA含量的直方图形式，将58个标本分为以下3种DNA倍体分布类型[4]。Ⅰ型：在二倍体或近二倍体区域内有一明确峰值；Ⅱ型：主要峰值位于四倍体或近四倍体部位；Ⅲ型：呈多峰形式或广泛弥散分布但无明显峰值出现。胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜DNA倍体分布类型见表1。
图2 胃癌细胞Feulgen染色 ×400倍
表1 胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜DNA倍体分布类型 DNA倍体
分布类型
胃癌
, 百拇医药 癌旁
异型增殖
正常
胃粘膜
合计
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
合计
6(22.2)
9(33.3)
12(44.5)
27
, 百拇医药
6(27.3)
13(59.1)
3(13.6)
22
7(77.8)
2(22.2)
0
9
19
24
15
58
( )内为%； χ2=16.77 P<0.01
, 百拇医药
2.3 细胞核的形态测量
胃癌细胞、癌旁异型增殖细胞和正常胃粘膜细胞6种形态参数变量的分析结果见表2。细胞核的6种形态参数进行多元判别分析时，细胞核的周长、面积、平均直径、凹凸度被列入判别函数，胃癌、癌旁异型增殖、正常胃粘膜的回代正确率达91.38%(表3)。表2 胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜细胞核各形态参数的单因素方差分析(
±s) 组 别面积(μm2)
周长(μm)
平均直径(μm)
长轴(μm)
短轴(μm)
, 百拇医药
凸凹度(μm)
胃 癌
癌旁异型增殖
正常胃粘膜
46.28±10.95**
28.08±5.91**
21.52±2.77**
28.91±4.72**
23.97±2.61**
20.48±1.65**
, 百拇医药
8.74±1.46**
6.24±0.53**
4.78±0.33*
11.01
9.12
6.17
±1.92
±0.65
±0.47
6.05
4.33
, 百拇医药
3.55
±0.09
±0.43
±0.23
1.19±0.09**
1.12±0.06*
1.05±0.02**
各参数不同组别之间进行比较 *P<0.05 **P<0.01 2.4 胃癌细胞的p21ras表达、DNA倍体和核形的关系
27例胃癌p21ras表达与DNA倍体分布类型的关系见表4；将27例胃癌的6种核形态参数，以其平均值分为2组，分别比较它们与p21ras表达之间的关系(表5)。经卡方检验发现，胃癌细胞p21ras表达与各种形态参数之间并无明显相关性(P>0.05)。
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表3 胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜细胞形态参数的多元回归判别分析 原组别
回代组别
合计
胃癌
癌旁异
型增殖
正常胃
粘膜
胃癌
癌旁异型增殖
正常胃粘膜
24
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20
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9
27
22
9
表4 胃癌p21ras表达与DNA倍体分布类型的关系 p21ras表达
DNA倍体分布类型
, http://www.100md.com
合计
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
阳性
阴性
合计
阳性率(%)
5
1
6
83.3
6
3
, 百拇医药
9
66.7
4
8
12
33.3
15
12
27
55.6
表5 胃癌p21ras表达与细胞核形态参数的关系 参 数
p21ras表达
, 百拇医药
χ2
P值
阳性
阴性
面积(μm2)
≤46.28>46.28
11
4
5
7
2.77
>0.05
周长(μm2)
, 百拇医药
≤28.91
>28.91
10
5
5
7
1.69
>0.05
平均直径(μm2)
≤8.74
>8.74
7
8
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9
3
2.23
>0.05
长轴(μm2)
≤11.01
>11.01
11
4
7
5
0.68
>0.05
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短轴(μm2)
≤6.05
>6.05
7
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8
4
1.08
>0.05
凹凸度
≤1.19
>7.19
9
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6
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8
1.90
>0.05
3 讨论
本实验发现，胃癌、癌旁异型增殖和正常胃粘膜细胞均有p21ras表达，但以癌旁异型增殖细胞表达水平为最高，与文献报道一致[5，6]，这提示p21ras过度表达主要出现在细胞表型发生明显转化之间。正常胃粘膜DNA倍体分布类型以Ⅰ型为主，癌旁异型增殖以Ⅱ型为主；而胃癌组织则以Ⅲ型为主。表明在胃粘膜上皮癌变过程中，DNA含量在不断增加，倍体分布的类型也有明显区别(P<0.01)。而且细胞核的形态参数均在逐渐增大，尤其是面积、周长、平均直径、凹凸度的差别极为明显(P<0.01)。多元判别分析结果表明：胃癌、癌旁异 型增殖及正常胃粘膜三组的回代正确率高达91.38%。似可作为诊断胃粘膜异型增殖和胃癌的形态学依据，文献上也有类似报告[7]。
, 百拇医药
在27例胃癌组织中，DNA倍体分布类型Ⅰ型者p21ras阳性率最高，Ⅱ型次之，Ⅲ型最低。表明胃癌细胞p21ras表达水平随着DNA含量的不断增多而逐渐下降。原癌基因ras的活化和过度表达主要出现在DNA倍体分布类型为Ⅰ型和Ⅱ型的癌组织(即DNA含量尚未出现成倍增加时)，当癌细胞DNA含量成倍增加时(Ⅲ型为主)，p21ras表达水平则明显下降。同样情况也见于膀胱癌。Czerniak发现癌前病变p21ras表达水平比早期胃癌要高[8]。而且在癌细胞中，p21ras的表达水平又随着倍体成倍增加而逐渐下降。因而可以认为，在细胞表型转化过程中，p21ras的过度表达对启动表型的转化至关重要，但对维持已转化了的表型特征则无作用。
胃癌细胞p21ras的过度表达与细胞核各种形态参数的关系，经χ2检验表明两者之间并无明显相关性(P>0.05)。说明p21ras表达水平与细胞核形态无直接关联，只与DNA含量有一定关联。Hamiton对46例胃癌标本的核形与DNA含量分析后，认为细胞核的大小与DNA含量并无显著相关性，而可能与细胞增殖周期、异染色质含量的变化及常染质的转录活动相关[3]。
, http://www.100md.com
作者简介:王昭，男，1968年生，硕士研究生 现址：首都医科大学附属北京友谊医院血液科，北京 100050
作者单位:同济医科大学基础医学院病理学教研室，武汉 430030
参考文献
1 Pronk G J, Miyatake S L, Tashiro K et al. The role of p21ras in receptor typrosine kinase signalling. Biochem Biophys Acta, 1994, 1198:131
2 Delue J, Finstud C, Guarini A et al. Abnormal regulation of mammalian p21ras contributes to malignant tumor growth in von recking hausen (type Ⅰ) neurofibromatosis. Cell, 1992,69:265
, 百拇医药
3 Hamilton P, Lewis C J, Neild T O et al. Morphometry of gastric carcinoma; its association with patient survival, tumor stage, and DNA ploidy. J Pathol, 1992, 168:201
4 Van V R, Bussel J B, Pharn L C et al. Image cytometry determination of ploidy level, proliferative activity, and nuclear size in series of 314 transitional bladder cell carcinoma. Hum Pathol, 1995, 26:3
5 Carneiro F, Teller R I, Lecllr P et al. Immunohistochemical analysis of ras oncogene p21 product in human gastric carcinomas and their adjacent mucosas. Pathol Res Pract, 1992,188:263
, http://www.100md.com
6 Karayiannis M, Holt C A, Lilly F et al. Expression of the ras oncoprotein in gastric carcinoma and adjacent mucosa. Anticancer Res, 1989, 6:1505
7 Rubin E M, Salter R, Donald E K et al. Comparative image cytometric DNA ploidy of liver cell dysplasia and hepatocellular carcinoma. Med Pathol, 1994,7:677
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(1997-03-28 收稿), 百拇医药