Cyclins/DNA多参数流式细胞术分析细胞增殖*
作者：龚建平 韦伟 舒丹 陶德定
单位：同济医科大学附属同济医院分子医学中心,武汉 430030
关键词：细胞增殖；流式细胞术；细胞周期素
同济医科大学学报990301 摘要 应用Cyclins/DNA双参数流式细胞术，分析有丝分裂原刺激后的正常人外周血T淋巴细胞的细胞增殖(特别是G1期细胞增殖)，同时与Ki-67/DNA双参数法进行比较。结果表明，Cyclins/DNA法比Ki-67/DNA法早20 h发现增殖的淋巴细胞，有丝分裂原刺激后48 h，Cyclins/DNA法又比Ki-67/DNA法多检出20%的增殖淋巴细胞。结论：Cyclins/DNA双参数流式细胞术分析细胞增殖具可行性、实用性、科学性和全面性。
Cell Proliferation Analysis by Cyclins/DNA Multiparameter
, 百拇医药
Flow Cytometry
Gong Jianping, WeiWei, ShuDan et al
Molecular Medicine Center, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract The mitogen stimulated normal human T lymphocytes proliferation (especially G1 phase proliferation) was analyzed by using a developed cyclins/DNA multiparameter flow cytometry and Ki-67/DNA multiparameter method. The results showed that the developed method detected proliferated T lymphocytes 20 earlier than Ki-67 method, and 20 % more proliferated cells than Ki-67 method at 48 h after mitogen stimulation. It was concluded that cyclins/DNA multiparameter folw cytometry is more practicable, reasonable and easy for cell proliferation analysis in contrast to the previous methods, especially for cell proliferation in early G1
, 百拇医药
Key words cell proliferation; flow cytometrycy; Cycling
细胞增殖是一种基本的生物活动，无论在生物体的生理性过程还是病理性过程中，都起着至关重要的作用，使得细胞增殖的分析理论与方法，成为细胞生物学及其多个相关领域研究的战略性关键。迄今为止，几乎所有的细胞增殖分析方法，包括有丝分裂计数(Mitotic counts)和DNA合成(32P nuclear incorporation autoradiographs)都建立在细胞周期的理论上。70年代后，建立的细胞增殖流式细胞术分析方法均不能囊括实际所有的增殖细胞，抑或没有直接的生物学基础而缺憾。1993年以来，一系列Cyclins/DNA流式细胞术分析方法形成，为新的、更科学的细胞增殖分析理论与方法奠定了基础。本研究应用Cyclins/DNA双参数流式细胞术分析方法，对正常人外周血淋巴细胞增殖进行分析，并与上述方法(特别是Ki-67/ DNA双参数法)对比，证明了Cyclins/DNA双参数流式细胞术分析细胞增殖的可行性、科学性和优越性。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
细胞：抽取人外周血，应用梯度密度离心分离淋巴细胞(PBL)。PBS洗涤2次，用含有10 ml/L胎牛血清、抗生素(青霉素10万U/L和链霉素100 mg/L)和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中悬浮培养，细胞密度约106/ml。培养液中的淋巴细胞应用终浓度为10 μg/ml的有丝分裂原植物血凝素(PHA)刺激生长、分裂。
1.2 方法
1.2.1 DNA含量分析：培养细胞收获后，用800 ml/L冷乙醇固定，置于-20 ℃冰箱过夜。固定细胞用PBS洗涤2次，随后孵育于PC缓冲液40 μl中30 min[1]。洗涤细胞，用10 mg/L PI和1.0 g/L RNase A(Sigma公司)，室温染色20 min。
, 百拇医药
1.2.2 PCNA免疫细胞化学标记：培养细胞收获后，置于500 μl裂解缓冲液(5.0 g/L Triton X-100; 0.2 mg/L EDTA; 10 g/L BSA)冰上15 min，加入冰甲醇3 ml，置于-20 ℃ 10 min，PBS 和10 g/L BSA 5 ml，离心、洗涤各1次后，与10 g/L BSA稀释的鼠抗人PCNA单克隆抗体(在0.1 ml体积中，每5×105细胞与0.25 μg抗体反应)孵育30 min，再用10 g/L BSA 5 ml离心、洗涤，加入标有FITC羊抗鼠IgG抗体(Sigma公司)(用10 g/L BSA以1∶40的比例稀释)，在室温下孵育30 min。洗涤细胞，用10 mg/L PI和1.0 g/L RNase A，室温染色20 min。
1.2.3 BrdUrd/DNA双参数法：培养细胞与10～50 μmol/L BrdUrd(Sigma公司)在37 ℃孵育30 min，置于紫外光(Foto UV 300 Analytical DNA transilluminator)下照射5 min后用800 g/L冷乙醇固定，置于-20 ℃冰箱过夜。固定细胞用PBS洗涤2次，采用末端标记法[2](TdT法)标记掺入的BrdUrd，标记后洗涤细胞，用10 mg/L PI和1.0 g/L RNase A，室温染色20 min。
, 百拇医药
1.2.4 RNA/DNA Acridine Orange染色法(AO法)：取200 μl细胞悬液，加入0.4 ml冰冷的试剂A(含1.0 g/L Triton X-100，0.08 mol/L HCl和0.15 mol/L NaCl)，于冰上静置15 min，然后加入1.2 ml冰冷的试剂B(在PC缓冲液中，含Acridine Orange 6 mg/L，1 mmol/L EDTA-Na和0.15 mol/L NaCl)，暗室放置2～10 min[3]。
1.2.5 Ki-67/DNA 和Cyclins/DNA双参数法：细胞收获后，用800 ml/L冷乙醇固定，于-20 ℃冰箱过夜。固定细胞用PBS洗涤2次，2.5 g/L Triton X-100在冰上处理5 min。以PBS洗涤2次，加入用10 g/L BSA稀释的鼠抗人Cyclin B1、E单克隆抗体(在100 μl体积中，每5 × 105细胞与0.25 μg抗体反应)，或鼠抗人Ki-67单克隆抗体(在100 μl体积中，每5 × 105细胞与0.25 μg抗体反应)，在4 ℃孵育过夜。次日细胞用PBS洗涤，加入标有FITC羊抗鼠IgG抗体(Sigma公司)(用10 g/L BSA以1∶40的比例稀释)，在室温下孵育30 min。再次洗涤细胞后，用10 mg/L PI和1.0 g/L Rnase A，室温染色20 min。抗体特异性同质对照采用同质特异性抗体，鼠抗人IgG单克隆抗体(Sigma公司)[4，5]。
, 百拇医药
1.2.6 流式细胞术分析：经上述处理的细胞，荧光标记成功后，应用FACSort流式细胞仪(Becton Dickson，美国)检测。经488 nm激光激发，被标记细胞发射的红色(PI)和绿色(FITC)荧光同时、分别被FACSort流式细胞仪的标准透镜接收。应用Cellquest软件(Becton Dickson，美国)，对上述所测细胞的双参数荧光强度、任一细胞群体的平均荧光强度进行分析。
2 结果
图1所示，为PBL经PHA刺激后48 h，细胞进入细胞周期后，增殖状态淋巴细胞的DNA含量直方图(a)、BrdUrd/DNA假三维图(b)、PCNA/DNA假三维图(c)、RNA/DNA假三维图(d)、Ki-67/DNA假三维图(e)、Cyclins/DNA假三维图(f)。当PHA刺激PBL48 h后，淋巴细胞完全进入细胞周期循环。此刻的DNA含量直方图(图1a)所能显示的细胞增殖部分，是图中S、G2 /M期细胞，对于G0/G1期细胞无法判断其是否为增殖细胞，而且，S期与G0/G1期、G2 /M期在DNA含量直方图上部分重叠，影响S期的客观分析。BrdUrd/DNA 或PCNA/DNA双参数流式细胞术(图1b、c)明显克服了DNA含量法的不足，独立地显示了S期细胞，但仍旧不能识别处于G0/G1期的增殖细胞。RNA/DNA双参数法(AO法，图1d)可以分辨处于G0/G1期的增殖细胞，但由于实验条件苛刻(强酸试剂损害流式细胞仪样品管)和缺乏直接的生物学基础而受到限制。从而使Ki-67/DNA双参数流式细胞术分析方法成为目前分析细胞增殖的较先进方法。然而，Ki-67作为细胞增殖相关抗原的生物学基础至今不明，而其所能分析G1期增殖细胞的科学性和真实性，并未得到证实。图2所示，为PBL经PHA刺激后0、18、24、38、48 h，淋巴细胞从G0期进入细胞分裂周期过程中，应用DNA含量法(a)、Ki-67/DNA(b)和Cyclins/ DNA(c)双参数法，分析细胞增殖的对比研究。如图所示，PHA刺激后PBL开始细胞增殖，DNA含量法在刺激后38 h才能看出细胞增殖(图2a)；Ki-67/DNA双参数法(图2b)在刺激后24 h似乎可见很少的增殖细胞，直至刺激后38 h才能看出明显的细胞增殖。而应用Cyclin E + B1/ DNA(图1f、图2c)双参数法，在PHA刺激后18 h即可明显分辨出处于G1期的增殖细胞，应用Cyclin D则更早(PHA刺激后4 h)[5]。
, 百拇医药
应用Cellquest软件分析图2b和c，绘成图3。由此可见，Cyclins/ DNA双参数法分析淋巴细胞增殖与Ki-67/DNA双参数法相比，前者能提前20余小时分辨出增殖的淋巴细胞；当细胞完全进入细胞周期后(指刺激后48 h左右)，Cyclins/ DNA法又比Ki-67/DNA法多检出近20%的增殖淋巴细胞。
图1 流式细胞术分析细胞增殖的主要方法
图2 三种分析方法对比研究不同时间点细胞增殖状态
3 讨论
Cyclins/ DNA双参数流式细胞术可以用作细胞增殖的分析，当细胞未进入S期时，可应用Cyclin E和(或)Cyclin D作为细胞增殖的标志[5]，而当细胞进入S期后，则可应用Cyclin B1和Cyclin E作为细胞增殖的标志；该方法与目前较为常用的DNA含量法、较为先进的Ki-67/ DNA双参数流式细胞术相比，更为完整地显示出细胞增殖部分，更为敏感地检出早期的细胞增殖部分，同时该方法也具备更充分的细胞生物学基础和意义。特别是Cyclins/ DNA法与Ki-67/ DNA法对比中，我们发现，当细胞进入G1期近20 h，Ki-67/ DNA方法尚不能分辨出增殖细胞，而Cyclins/ DNA方法则可以分辨出50%的细胞已进入增殖状态；当细胞完全进入细胞周期后，Cyclins/ DNA方法又仅比Ki-67/ DNA方
, 百拇医药
图3 PHA刺激后不同时间点增殖细胞比率曲线图
法多检出20%的增殖细胞，这一差别，可能是因为Ki-67多表达于有丝分裂后G1期细胞(post-mitosis G1 cells)，而迟表达于来自G0期的G1期细胞(G0 to G1 cells)所致。另外，该方法在增加细胞增殖分析的敏感性、全面性的同时，又不损害流式细胞仪的样品管，因而更具实用性。因此，Cyclins/ DNA双参数流式细胞术对于细胞生物学研究中的细胞增殖分析，具有显而易见的实用价值和科学性，并可能发现以往应用经典方法所不能发现的客观事实，揭示新的科学规律。
虽然，我们在培养细胞证明了Cyclins/ DNA双参数流式细胞术可以用作细胞增殖的分析，但在临床标本是否可以应用该方法作为细胞增殖的主要分析方法，尚有待实践证明。不过已经有人应用蛋白质分析方法(如Western Blot)，将Cyclin用作细胞增殖的标志[6]，既为本方法的科学性提供了佐证，又为该方法的临床应用提供了可行性的线索，只是未能定量化，因此该方法除了应用于细胞生物学研究外，还具备临床应用的前景。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目(No.39670365, 39725027, 39730270),卫生部基金资助项目
作者简介:龚建平，男，1958年生，教授
参考文献
1 Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z. A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometry. Anal Biochem, 1994,218: 314
2 Gong J, Li X, Darzynkiewicz Z. Different patterns of apoptosis of HL-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin. J Cell Physiol, 1993,157: 263
, http://www.100md.com
3 Darzynkiewicz Z, Traganos F, Sharpless T et al. Lymphocyte stimulation: a rapid multiparameter analysis. Proc Natl Acad Sci USA,1976, 73: 2881
4 Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z. Simultaneous analysis of cell cycle kinetics at two different DNA ploidy levels based on DNA content and cyclin B measurement. Cancer Res, 1993,53: 5096
5 Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z. Staurosporine blocks cell progression through G1 between the cyclin D and cyclin E restriction points. Cancer Res, 1994,54: 3136
6 Dutta A, Chandra R, Lettr L M et al. Cyclins as markers of tumor proliferation: Immunocytochemical studies in breast cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,5386
(1998-12-05 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院分子医学中心,武汉 430030
关键词：细胞增殖；流式细胞术；细胞周期素
同济医科大学学报990301 摘要 应用Cyclins/DNA双参数流式细胞术，分析有丝分裂原刺激后的正常人外周血T淋巴细胞的细胞增殖(特别是G1期细胞增殖)，同时与Ki-67/DNA双参数法进行比较。结果表明，Cyclins/DNA法比Ki-67/DNA法早20 h发现增殖的淋巴细胞，有丝分裂原刺激后48 h，Cyclins/DNA法又比Ki-67/DNA法多检出20%的增殖淋巴细胞。结论：Cyclins/DNA双参数流式细胞术分析细胞增殖具可行性、实用性、科学性和全面性。
Cell Proliferation Analysis by Cyclins/DNA Multiparameter
, 百拇医药
Flow Cytometry
Gong Jianping, WeiWei, ShuDan et al
Molecular Medicine Center, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract The mitogen stimulated normal human T lymphocytes proliferation (especially G1 phase proliferation) was analyzed by using a developed cyclins/DNA multiparameter flow cytometry and Ki-67/DNA multiparameter method. The results showed that the developed method detected proliferated T lymphocytes 20 earlier than Ki-67 method, and 20 % more proliferated cells than Ki-67 method at 48 h after mitogen stimulation. It was concluded that cyclins/DNA multiparameter folw cytometry is more practicable, reasonable and easy for cell proliferation analysis in contrast to the previous methods, especially for cell proliferation in early G1
, 百拇医药
Key words cell proliferation; flow cytometrycy; Cycling
细胞增殖是一种基本的生物活动，无论在生物体的生理性过程还是病理性过程中，都起着至关重要的作用，使得细胞增殖的分析理论与方法，成为细胞生物学及其多个相关领域研究的战略性关键。迄今为止，几乎所有的细胞增殖分析方法，包括有丝分裂计数(Mitotic counts)和DNA合成(32P nuclear incorporation autoradiographs)都建立在细胞周期的理论上。70年代后，建立的细胞增殖流式细胞术分析方法均不能囊括实际所有的增殖细胞，抑或没有直接的生物学基础而缺憾。1993年以来，一系列Cyclins/DNA流式细胞术分析方法形成，为新的、更科学的细胞增殖分析理论与方法奠定了基础。本研究应用Cyclins/DNA双参数流式细胞术分析方法，对正常人外周血淋巴细胞增殖进行分析，并与上述方法(特别是Ki-67/ DNA双参数法)对比，证明了Cyclins/DNA双参数流式细胞术分析细胞增殖的可行性、科学性和优越性。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
细胞：抽取人外周血，应用梯度密度离心分离淋巴细胞(PBL)。PBS洗涤2次，用含有10 ml/L胎牛血清、抗生素(青霉素10万U/L和链霉素100 mg/L)和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中悬浮培养，细胞密度约106/ml。培养液中的淋巴细胞应用终浓度为10 μg/ml的有丝分裂原植物血凝素(PHA)刺激生长、分裂。
1.2 方法
1.2.1 DNA含量分析：培养细胞收获后，用800 ml/L冷乙醇固定，置于-20 ℃冰箱过夜。固定细胞用PBS洗涤2次，随后孵育于PC缓冲液40 μl中30 min[1]。洗涤细胞，用10 mg/L PI和1.0 g/L RNase A(Sigma公司)，室温染色20 min。
, 百拇医药
1.2.2 PCNA免疫细胞化学标记：培养细胞收获后，置于500 μl裂解缓冲液(5.0 g/L Triton X-100; 0.2 mg/L EDTA; 10 g/L BSA)冰上15 min，加入冰甲醇3 ml，置于-20 ℃ 10 min，PBS 和10 g/L BSA 5 ml，离心、洗涤各1次后，与10 g/L BSA稀释的鼠抗人PCNA单克隆抗体(在0.1 ml体积中，每5×105细胞与0.25 μg抗体反应)孵育30 min，再用10 g/L BSA 5 ml离心、洗涤，加入标有FITC羊抗鼠IgG抗体(Sigma公司)(用10 g/L BSA以1∶40的比例稀释)，在室温下孵育30 min。洗涤细胞，用10 mg/L PI和1.0 g/L RNase A，室温染色20 min。
1.2.3 BrdUrd/DNA双参数法：培养细胞与10～50 μmol/L BrdUrd(Sigma公司)在37 ℃孵育30 min，置于紫外光(Foto UV 300 Analytical DNA transilluminator)下照射5 min后用800 g/L冷乙醇固定，置于-20 ℃冰箱过夜。固定细胞用PBS洗涤2次，采用末端标记法[2](TdT法)标记掺入的BrdUrd，标记后洗涤细胞，用10 mg/L PI和1.0 g/L RNase A，室温染色20 min。
, 百拇医药
1.2.4 RNA/DNA Acridine Orange染色法(AO法)：取200 μl细胞悬液，加入0.4 ml冰冷的试剂A(含1.0 g/L Triton X-100，0.08 mol/L HCl和0.15 mol/L NaCl)，于冰上静置15 min，然后加入1.2 ml冰冷的试剂B(在PC缓冲液中，含Acridine Orange 6 mg/L，1 mmol/L EDTA-Na和0.15 mol/L NaCl)，暗室放置2～10 min[3]。
1.2.5 Ki-67/DNA 和Cyclins/DNA双参数法：细胞收获后，用800 ml/L冷乙醇固定，于-20 ℃冰箱过夜。固定细胞用PBS洗涤2次，2.5 g/L Triton X-100在冰上处理5 min。以PBS洗涤2次，加入用10 g/L BSA稀释的鼠抗人Cyclin B1、E单克隆抗体(在100 μl体积中，每5 × 105细胞与0.25 μg抗体反应)，或鼠抗人Ki-67单克隆抗体(在100 μl体积中，每5 × 105细胞与0.25 μg抗体反应)，在4 ℃孵育过夜。次日细胞用PBS洗涤，加入标有FITC羊抗鼠IgG抗体(Sigma公司)(用10 g/L BSA以1∶40的比例稀释)，在室温下孵育30 min。再次洗涤细胞后，用10 mg/L PI和1.0 g/L Rnase A，室温染色20 min。抗体特异性同质对照采用同质特异性抗体，鼠抗人IgG单克隆抗体(Sigma公司)[4，5]。
, 百拇医药
1.2.6 流式细胞术分析：经上述处理的细胞，荧光标记成功后，应用FACSort流式细胞仪(Becton Dickson，美国)检测。经488 nm激光激发，被标记细胞发射的红色(PI)和绿色(FITC)荧光同时、分别被FACSort流式细胞仪的标准透镜接收。应用Cellquest软件(Becton Dickson，美国)，对上述所测细胞的双参数荧光强度、任一细胞群体的平均荧光强度进行分析。
2 结果
图1所示，为PBL经PHA刺激后48 h，细胞进入细胞周期后，增殖状态淋巴细胞的DNA含量直方图(a)、BrdUrd/DNA假三维图(b)、PCNA/DNA假三维图(c)、RNA/DNA假三维图(d)、Ki-67/DNA假三维图(e)、Cyclins/DNA假三维图(f)。当PHA刺激PBL48 h后，淋巴细胞完全进入细胞周期循环。此刻的DNA含量直方图(图1a)所能显示的细胞增殖部分，是图中S、G2 /M期细胞，对于G0/G1期细胞无法判断其是否为增殖细胞，而且，S期与G0/G1期、G2 /M期在DNA含量直方图上部分重叠，影响S期的客观分析。BrdUrd/DNA 或PCNA/DNA双参数流式细胞术(图1b、c)明显克服了DNA含量法的不足，独立地显示了S期细胞，但仍旧不能识别处于G0/G1期的增殖细胞。RNA/DNA双参数法(AO法，图1d)可以分辨处于G0/G1期的增殖细胞，但由于实验条件苛刻(强酸试剂损害流式细胞仪样品管)和缺乏直接的生物学基础而受到限制。从而使Ki-67/DNA双参数流式细胞术分析方法成为目前分析细胞增殖的较先进方法。然而，Ki-67作为细胞增殖相关抗原的生物学基础至今不明，而其所能分析G1期增殖细胞的科学性和真实性，并未得到证实。图2所示，为PBL经PHA刺激后0、18、24、38、48 h，淋巴细胞从G0期进入细胞分裂周期过程中，应用DNA含量法(a)、Ki-67/DNA(b)和Cyclins/ DNA(c)双参数法，分析细胞增殖的对比研究。如图所示，PHA刺激后PBL开始细胞增殖，DNA含量法在刺激后38 h才能看出细胞增殖(图2a)；Ki-67/DNA双参数法(图2b)在刺激后24 h似乎可见很少的增殖细胞，直至刺激后38 h才能看出明显的细胞增殖。而应用Cyclin E + B1/ DNA(图1f、图2c)双参数法，在PHA刺激后18 h即可明显分辨出处于G1期的增殖细胞，应用Cyclin D则更早(PHA刺激后4 h)[5]。
, 百拇医药
应用Cellquest软件分析图2b和c，绘成图3。由此可见，Cyclins/ DNA双参数法分析淋巴细胞增殖与Ki-67/DNA双参数法相比，前者能提前20余小时分辨出增殖的淋巴细胞；当细胞完全进入细胞周期后(指刺激后48 h左右)，Cyclins/ DNA法又比Ki-67/DNA法多检出近20%的增殖淋巴细胞。
图1 流式细胞术分析细胞增殖的主要方法
图2 三种分析方法对比研究不同时间点细胞增殖状态
3 讨论
Cyclins/ DNA双参数流式细胞术可以用作细胞增殖的分析，当细胞未进入S期时，可应用Cyclin E和(或)Cyclin D作为细胞增殖的标志[5]，而当细胞进入S期后，则可应用Cyclin B1和Cyclin E作为细胞增殖的标志；该方法与目前较为常用的DNA含量法、较为先进的Ki-67/ DNA双参数流式细胞术相比，更为完整地显示出细胞增殖部分，更为敏感地检出早期的细胞增殖部分，同时该方法也具备更充分的细胞生物学基础和意义。特别是Cyclins/ DNA法与Ki-67/ DNA法对比中，我们发现，当细胞进入G1期近20 h，Ki-67/ DNA方法尚不能分辨出增殖细胞，而Cyclins/ DNA方法则可以分辨出50%的细胞已进入增殖状态；当细胞完全进入细胞周期后，Cyclins/ DNA方法又仅比Ki-67/ DNA方
, 百拇医药
图3 PHA刺激后不同时间点增殖细胞比率曲线图
法多检出20%的增殖细胞，这一差别，可能是因为Ki-67多表达于有丝分裂后G1期细胞(post-mitosis G1 cells)，而迟表达于来自G0期的G1期细胞(G0 to G1 cells)所致。另外，该方法在增加细胞增殖分析的敏感性、全面性的同时，又不损害流式细胞仪的样品管，因而更具实用性。因此，Cyclins/ DNA双参数流式细胞术对于细胞生物学研究中的细胞增殖分析，具有显而易见的实用价值和科学性，并可能发现以往应用经典方法所不能发现的客观事实，揭示新的科学规律。
虽然，我们在培养细胞证明了Cyclins/ DNA双参数流式细胞术可以用作细胞增殖的分析，但在临床标本是否可以应用该方法作为细胞增殖的主要分析方法，尚有待实践证明。不过已经有人应用蛋白质分析方法(如Western Blot)，将Cyclin用作细胞增殖的标志[6]，既为本方法的科学性提供了佐证，又为该方法的临床应用提供了可行性的线索，只是未能定量化，因此该方法除了应用于细胞生物学研究外，还具备临床应用的前景。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目(No.39670365, 39725027, 39730270),卫生部基金资助项目
作者简介:龚建平，男，1958年生，教授
参考文献
1 Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z. A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometry. Anal Biochem, 1994,218: 314
2 Gong J, Li X, Darzynkiewicz Z. Different patterns of apoptosis of HL-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin. J Cell Physiol, 1993,157: 263
, http://www.100md.com
3 Darzynkiewicz Z, Traganos F, Sharpless T et al. Lymphocyte stimulation: a rapid multiparameter analysis. Proc Natl Acad Sci USA,1976, 73: 2881
4 Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z. Simultaneous analysis of cell cycle kinetics at two different DNA ploidy levels based on DNA content and cyclin B measurement. Cancer Res, 1993,53: 5096
5 Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z. Staurosporine blocks cell progression through G1 between the cyclin D and cyclin E restriction points. Cancer Res, 1994,54: 3136
6 Dutta A, Chandra R, Lettr L M et al. Cyclins as markers of tumor proliferation: Immunocytochemical studies in breast cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,5386
(1998-12-05 收稿), 百拇医药