急性白血病多药耐药基因MDR1表达及临床意义
作者：孟繁军 罗兵 曲彦 李广伦 宋玉华
单位：孟繁军 李广伦 青岛医学院附属医院血液科(青岛 266003)；罗兵 青岛医学院微生物学教教研室；曲彦 青岛市市立医院ICU；宋玉华 青岛医学院附属医院肿瘤科
关键词：白血病；抗药性；基因表达；聚合酶链反应
青岛医学院学报990310 【摘要】 ①目的 探讨急性白血病(AL)多药耐药基因MDR1的表达及临床意义。②方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，对77例AL病人及10例正常人MDR1基因表达进行检测。③结果 77例AL病人MDR1阳性率为64.9%(50/77),其平均表达水平为0.26±0.19，与对照组比较,差异无显著性(χ2=0.094，t=1.548，P>0.05)；复发组和临床耐药组表达水平明显高于初治组和完全缓解组(t=2.49，2.44，P<0.05)。④结论AL的临床耐药和复发与MDR1的过度表达有关。
, 百拇医药
中国图书馆分类法分类号 R733.7
EXRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF MULTIDRUG RESISTANCE GENE (MDR1)IN ACUTE LEUKEMIAS
Meng Fanjun, Luo Bing, Qu Yan, et al
Department of Hematology, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To study the expression and clinical significance of multidrug resistance(MDR1) in acute leuke-mia. Methods The expression of MDR1 gene in 77 cases of AL patients and 10 cases of control group was detected with semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results The positive expression rate (64.9%) and mean expression level (0.26±0.19) of MDR1 in AL patients had no significant difference (χ2=0.094, t=1.548,P>0.05,retspectively),compared with those of control group. The expression levels of MDR1 gene in relapse and clinical drug-resistant groups were obviously higher than that in early-treated and CR groups (t=2.49，2.26, P<0.05, respectively). Conclusion The clinical drug-resistance and relapse of AL may be related to the overexpression of MDR1 gene.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 leukemia; drug resistance; gene expression; polymerase chain reaction
多药耐药(MDR)的产生是导致白血病(AL)化疗失败的重要原因之一，目前已证实MDR基因的过度表达是白血病形成MDR原因。为探讨MDR1基因在AL病人中的表达及其临床意义，我们检测了77例病人的MDR1基因，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 病例选择
AL病人77例,男41例,女36例;年龄2～66岁，平均24.84岁。其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)43例，急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)34例。初治43例(ALL23例，ANLL20例)，复发11例(ALL4例,ANLL7例)，临床耐药12例(ALL4例，ANLL8例)，完全缓解11例(均为ALL)。所有病人临床诊断均符合FAB标准。对照组10例为健康献血员。
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1.2 单个核细胞的制备
无菌条件下取病人骨髓2～3mL,正常对照组取外周血5mL,肝素抗凝(1mL加肝素25u)，用Hank液以1∶3(V∶V)的比例稀释，缓慢注入盛有Ficoll液的无菌试管内，以2 000r/min离心20min，吸出单个核细胞层，再用Hank液洗涤2次。最后加入适量的RPMI1640培养液，调整细胞数至2.5×109/L，其中部分用于提取RNA，部分用于体外药物敏感实验。
1.3 基因检测
1.3.1 RNA制备 将AL骨髓液制成单个细胞悬液,细胞总RNA提取采用并硫氰酸胍一步法〔1〕,紫外分光光度计定量。
1.3.2 cDNA合成 取1μg细胞总RNA,采用逆转录试剂盒(Promega公司产品)提供的标准条件进行逆转录反应,所获cDNA用作PCR反应模板。
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1.3.3 PCR引物合成 MDR1引物及其内参照引物——β2-微球蛋白(β2-MG)合成参照文献〔2〕的方法,MDR1扩增片段长度为157bp,β2-MG扩增产物长度为114bp.
1.3.4 PCR扩增 PCR反应体系为30μL,包括逆转录产物(cDNA)3μL,10×buffer 3μL,dNTP 0.2mmol/L,MgCl2 1.5mmol/L,2对引物各0.5μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,PCR反应条件为95℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s，连续35个循环，最后72℃延伸5min.
1.3.5 PCR产物定量 取12μL扩增产物在含EB 20g/L的琼脂糖凝胶中电泳，80V，1h，紫外透射仪下照相，于LKB激光密度扫描仪上扫描底片，计算曲线下峰面积作为PCR产物的含量。
, http://www.100md.com 1.3.6 临床耐药诊断标准 参照文献〔3〕。
1.4 统计学方法
应用t检验、F检验、直接概率法和χ2检验。
2 结果
2.1 AL病人MDR1基因的表达
77例AL病人中MDR1阳性表达50例,其平均表达水平为0.26±0.19,对照组10例中有6例表达阳性,其平均表达水平为0.14±0.08，两者的阳性率比较,差异无显著性(χ2=0.094,P>0.05)；平均表达水平比较差异亦无显著性(t=1.548,P>0.05)。不同类型、病期AL病人MDR1基因表达结果见表1.初治组与复发组比较，完全缓解组与临床耐药组比较，MDR1的表达差异均有显著意义(t=2.49,2.26,P<0.05);不同FAB型ANLL病人MDR1的阳性表达率及平均表达水平差异无显著性(F=2.16,P>0.05)。见表2.
, 百拇医药
表1 不同类型及不同病期AL病人MDR1表达结果 组别
n
阳性率(%)
表达范围
MDR1/β2-MG
对照组
10
60.00( 6/10)
0.09～0.29
0.14±0.08
ALL组
43
, 百拇医药
58.14(25/43)
0.03～0.45
0.21±0.14
ANLL组
34
73.33(25/34)
0.01～0.84
0.30±0.23
初治组
43
62.79(27/43)
0.01～0.61
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0.20±0.15△
复发组
11
63.64( 7/11)
0.11～0.73
0.38±0.24*
临床耐药组
12
83.33(10/12)
0.03～0.84
0.37±0.22*
, 百拇医药
完全缓解组
11
54.55( 6/11)
0.07～0.43
0.15±0.11△
与对照组比较,*t=2.54,2.44,P<0.05;与复发组、临床耐药组比较,△t=2.49, 2.26,P<0.05
表2 不同类型ANLL的MDR1阳性表达率及表达水平 分型
n
阳性例数
MDR1/β2-MG
, 百拇医药
M1
3
2
0.38±0.10
M2
14
9
0.26±0.21
M3
7
6
0.25±0.26
, 百拇医药
M4
4
3
0.32±0.28
M5
3
2
0.37±0.13
慢粒急变
3
3
0.40±0.38
组间比较，F=2.16,P>0.05
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2.2 MDR1基因表达与临床特征的关系
本组77例AL病人中，男、女性病人MDR1基因阳性表达率分别为60.98%(25/41)，69.44%(25/36)，其阳性表达均值分别为0.23±0.17和0.27±0.20；儿童(年龄≤14岁)36例，其MDR1阳性表达率为58.33%(21/36)，平均表达水平0.20±0.13;成人(年龄>14岁)41例，其MDR1基因阳性表达率为70.73%(29/41)，平均表达水平为0.30±0.22.诊断时白细胞计数>25×109/L者27例，白细胞计数<25×109/L者16例，其MDR1基因阳性率分别为55.56%(15/27)和56.25%(9/16)，其阳性表达均值分别为0.24±0.16和0.28±0.19.初诊时肝脾大≥5cm者13例，有7例MDR1阳性(53.85%)，其MDR1平均水平为0.27±0.15;肝脾大<5cm或无肿大者30例，有18例MDR1阳性(60.00%)，其表达均值为0.23±0.16.经统计学处理，各组之间差异无显著性(t=1.21,P>0.05)，表明MDR1基因表达与年龄、性别、初诊时白细胞计数及肝脾大程度无关。
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2.3 MDR1基因表达与AL预后的关系
54例初治和复发病人至少应用1种MDR相关药物进行治疗,MDR1表达阳性病人产生耐药的比率(46.88%)高于MDR1阴性者(23.53%),但二者差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
白血病化疗失败的主要原因是病人的白血病细胞出现MDR.MDR是指肿瘤细胞同时对多种结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生耐药，MDR1基因的过度表达是其形成的主要原因之一。MDR1基因编码的糖蛋白(P-gp)，可利用细胞膜ATP能量与化疗药物结合，将化疗药物泵出细胞外，从而使细胞内药物浓度降低，产生耐药。本研究中77例急性白血病病人MDR1阳性表达率为69.94%(50/77)，初治组、复发组、临床耐药组及完全缓解组均存在MDR1的阳性表达，但各组MDR1阳性率差异无显著性。Pieker〔4〕等报道初治ANLL的MDR1基因表达阳性率为71%，本文结果与之一致。由此可知初治AL病人中存在原发性MDR基因的表达，推测与部分白血病病人的原发耐药有关。本组结果还表明，复发组MDR1表达均值明显高于初治组，且显著高于正常对照组；临床耐药组MDR1表达均值显著高于完全缓解组，提示复发状态及临床耐药的白血病病人有较高水平的MDR1表达，而在初治组和完全缓解组白血病中则较低。据此我们推测白血病病人的化疗效果及预后与其MDR1基因的表达水平有关,与Hart等〔5〕的结果相似。
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本组12例检测时临床状态为化疗耐药的AL病人中有10例(83.33%)系MDR1阳性表达者，而MDR1检测阴性者仅有2例(16.67%),表明AL化疗耐药的发生主要与MDR1的高表达有关。同时我们对49例初治和复发急性白血病病人的临床随访显示，有46.88%的MDR1阳性病人产生耐药，高于MDR1阴性者(23.53%)。研究过程中我们动态观察5例MDR1表达值>0.6的白血病病人，发现其首次复发时的MDR1表达值均较初治时明显升高，有2例病人于复发后死亡，另外3例再次复发时MDR1的表达水平较首次复发时无明显升高。上述结果可能是由于少量表达MDR1的细胞克隆，经过化疗的筛选成为优势克隆而大量增殖，表达较高水平的MDR1，导致白血病的复发或临床耐药。
本文结果还表明，AL病人MDR1基因阳性表达率及表达均值与病人年龄、性别白细胞计数、肝脾大以及白血病FAB分型等临床诸多参数无关，与文献结果一致〔5，6〕。
本文为青岛市科委资助课题(批准号：9585G17019)
, http://www.100md.com
参考文献
1 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phonel-chloroform extraction. Anul Biochem,1987,162:156
2 Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR(multidrug resistance) gene expression in human tumor by polymerase chain reaction. Proc Natal Acad Sci USA,1990,87:7160
3 Hiddemann W, Buchner T. Treatment strategies in acute myeloid leukemia(AML). Blut,1990,60:163
, http://www.100md.com
4 Picker R, Wallner J, Geissler K, et al. MDR1 gene expression and treatment outcome in acute myeloid leukemia.J Natl Cancer Inst, 1991,83:708
5 Hart SM, Ganeshugguru K, Hoffbrand AV,et al. Expression of multidrug resistance-associated protein (MRP) in acute leuke-mia. Leukemia, 1994, 8:2163
6 Zhou DC, Zittoun R, Marie JP. Expression of multidrug resistance-associated protein(MRP) gene in acute myeloid leukemia and correlation with expression of multidrug resistance(MDR1)gene. Leukemia,1995,9:528
(1999-03-09收稿 1999-07-10修回), http://www.100md.com
单位：孟繁军 李广伦 青岛医学院附属医院血液科(青岛 266003)；罗兵 青岛医学院微生物学教教研室；曲彦 青岛市市立医院ICU；宋玉华 青岛医学院附属医院肿瘤科
关键词：白血病；抗药性；基因表达；聚合酶链反应
青岛医学院学报990310 【摘要】 ①目的 探讨急性白血病(AL)多药耐药基因MDR1的表达及临床意义。②方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，对77例AL病人及10例正常人MDR1基因表达进行检测。③结果 77例AL病人MDR1阳性率为64.9%(50/77),其平均表达水平为0.26±0.19，与对照组比较,差异无显著性(χ2=0.094，t=1.548，P>0.05)；复发组和临床耐药组表达水平明显高于初治组和完全缓解组(t=2.49，2.44，P<0.05)。④结论AL的临床耐药和复发与MDR1的过度表达有关。
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中国图书馆分类法分类号 R733.7
EXRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF MULTIDRUG RESISTANCE GENE (MDR1)IN ACUTE LEUKEMIAS
Meng Fanjun, Luo Bing, Qu Yan, et al
Department of Hematology, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To study the expression and clinical significance of multidrug resistance(MDR1) in acute leuke-mia. Methods The expression of MDR1 gene in 77 cases of AL patients and 10 cases of control group was detected with semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results The positive expression rate (64.9%) and mean expression level (0.26±0.19) of MDR1 in AL patients had no significant difference (χ2=0.094, t=1.548,P>0.05,retspectively),compared with those of control group. The expression levels of MDR1 gene in relapse and clinical drug-resistant groups were obviously higher than that in early-treated and CR groups (t=2.49，2.26, P<0.05, respectively). Conclusion The clinical drug-resistance and relapse of AL may be related to the overexpression of MDR1 gene.
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【KEY WORDS】 leukemia; drug resistance; gene expression; polymerase chain reaction
多药耐药(MDR)的产生是导致白血病(AL)化疗失败的重要原因之一，目前已证实MDR基因的过度表达是白血病形成MDR原因。为探讨MDR1基因在AL病人中的表达及其临床意义，我们检测了77例病人的MDR1基因，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 病例选择
AL病人77例,男41例,女36例;年龄2～66岁，平均24.84岁。其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)43例，急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)34例。初治43例(ALL23例，ANLL20例)，复发11例(ALL4例,ANLL7例)，临床耐药12例(ALL4例，ANLL8例)，完全缓解11例(均为ALL)。所有病人临床诊断均符合FAB标准。对照组10例为健康献血员。
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1.2 单个核细胞的制备
无菌条件下取病人骨髓2～3mL,正常对照组取外周血5mL,肝素抗凝(1mL加肝素25u)，用Hank液以1∶3(V∶V)的比例稀释，缓慢注入盛有Ficoll液的无菌试管内，以2 000r/min离心20min，吸出单个核细胞层，再用Hank液洗涤2次。最后加入适量的RPMI1640培养液，调整细胞数至2.5×109/L，其中部分用于提取RNA，部分用于体外药物敏感实验。
1.3 基因检测
1.3.1 RNA制备 将AL骨髓液制成单个细胞悬液,细胞总RNA提取采用并硫氰酸胍一步法〔1〕,紫外分光光度计定量。
1.3.2 cDNA合成 取1μg细胞总RNA,采用逆转录试剂盒(Promega公司产品)提供的标准条件进行逆转录反应,所获cDNA用作PCR反应模板。
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1.3.3 PCR引物合成 MDR1引物及其内参照引物——β2-微球蛋白(β2-MG)合成参照文献〔2〕的方法,MDR1扩增片段长度为157bp,β2-MG扩增产物长度为114bp.
1.3.4 PCR扩增 PCR反应体系为30μL,包括逆转录产物(cDNA)3μL,10×buffer 3μL,dNTP 0.2mmol/L,MgCl2 1.5mmol/L,2对引物各0.5μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,PCR反应条件为95℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s，连续35个循环，最后72℃延伸5min.
1.3.5 PCR产物定量 取12μL扩增产物在含EB 20g/L的琼脂糖凝胶中电泳，80V，1h，紫外透射仪下照相，于LKB激光密度扫描仪上扫描底片，计算曲线下峰面积作为PCR产物的含量。
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1.4 统计学方法
应用t检验、F检验、直接概率法和χ2检验。
2 结果
2.1 AL病人MDR1基因的表达
77例AL病人中MDR1阳性表达50例,其平均表达水平为0.26±0.19,对照组10例中有6例表达阳性,其平均表达水平为0.14±0.08，两者的阳性率比较,差异无显著性(χ2=0.094,P>0.05)；平均表达水平比较差异亦无显著性(t=1.548,P>0.05)。不同类型、病期AL病人MDR1基因表达结果见表1.初治组与复发组比较，完全缓解组与临床耐药组比较，MDR1的表达差异均有显著意义(t=2.49,2.26,P<0.05);不同FAB型ANLL病人MDR1的阳性表达率及平均表达水平差异无显著性(F=2.16,P>0.05)。见表2.
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表1 不同类型及不同病期AL病人MDR1表达结果 组别
n
阳性率(%)
表达范围
MDR1/β2-MG
对照组
10
60.00( 6/10)
0.09～0.29
0.14±0.08
ALL组
43
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58.14(25/43)
0.03～0.45
0.21±0.14
ANLL组
34
73.33(25/34)
0.01～0.84
0.30±0.23
初治组
43
62.79(27/43)
0.01～0.61
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0.20±0.15△
复发组
11
63.64( 7/11)
0.11～0.73
0.38±0.24*
临床耐药组
12
83.33(10/12)
0.03～0.84
0.37±0.22*
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完全缓解组
11
54.55( 6/11)
0.07～0.43
0.15±0.11△
与对照组比较,*t=2.54,2.44,P<0.05;与复发组、临床耐药组比较,△t=2.49, 2.26,P<0.05
表2 不同类型ANLL的MDR1阳性表达率及表达水平 分型
n
阳性例数
MDR1/β2-MG
, 百拇医药
M1
3
2
0.38±0.10
M2
14
9
0.26±0.21
M3
7
6
0.25±0.26
, 百拇医药
M4
4
3
0.32±0.28
M5
3
2
0.37±0.13
慢粒急变
3
3
0.40±0.38
组间比较，F=2.16,P>0.05
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2.2 MDR1基因表达与临床特征的关系
本组77例AL病人中，男、女性病人MDR1基因阳性表达率分别为60.98%(25/41)，69.44%(25/36)，其阳性表达均值分别为0.23±0.17和0.27±0.20；儿童(年龄≤14岁)36例，其MDR1阳性表达率为58.33%(21/36)，平均表达水平0.20±0.13;成人(年龄>14岁)41例，其MDR1基因阳性表达率为70.73%(29/41)，平均表达水平为0.30±0.22.诊断时白细胞计数>25×109/L者27例，白细胞计数<25×109/L者16例，其MDR1基因阳性率分别为55.56%(15/27)和56.25%(9/16)，其阳性表达均值分别为0.24±0.16和0.28±0.19.初诊时肝脾大≥5cm者13例，有7例MDR1阳性(53.85%)，其MDR1平均水平为0.27±0.15;肝脾大<5cm或无肿大者30例，有18例MDR1阳性(60.00%)，其表达均值为0.23±0.16.经统计学处理，各组之间差异无显著性(t=1.21,P>0.05)，表明MDR1基因表达与年龄、性别、初诊时白细胞计数及肝脾大程度无关。
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2.3 MDR1基因表达与AL预后的关系
54例初治和复发病人至少应用1种MDR相关药物进行治疗,MDR1表达阳性病人产生耐药的比率(46.88%)高于MDR1阴性者(23.53%),但二者差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
白血病化疗失败的主要原因是病人的白血病细胞出现MDR.MDR是指肿瘤细胞同时对多种结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生耐药，MDR1基因的过度表达是其形成的主要原因之一。MDR1基因编码的糖蛋白(P-gp)，可利用细胞膜ATP能量与化疗药物结合，将化疗药物泵出细胞外，从而使细胞内药物浓度降低，产生耐药。本研究中77例急性白血病病人MDR1阳性表达率为69.94%(50/77)，初治组、复发组、临床耐药组及完全缓解组均存在MDR1的阳性表达，但各组MDR1阳性率差异无显著性。Pieker〔4〕等报道初治ANLL的MDR1基因表达阳性率为71%，本文结果与之一致。由此可知初治AL病人中存在原发性MDR基因的表达，推测与部分白血病病人的原发耐药有关。本组结果还表明，复发组MDR1表达均值明显高于初治组，且显著高于正常对照组；临床耐药组MDR1表达均值显著高于完全缓解组，提示复发状态及临床耐药的白血病病人有较高水平的MDR1表达，而在初治组和完全缓解组白血病中则较低。据此我们推测白血病病人的化疗效果及预后与其MDR1基因的表达水平有关,与Hart等〔5〕的结果相似。
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本组12例检测时临床状态为化疗耐药的AL病人中有10例(83.33%)系MDR1阳性表达者，而MDR1检测阴性者仅有2例(16.67%),表明AL化疗耐药的发生主要与MDR1的高表达有关。同时我们对49例初治和复发急性白血病病人的临床随访显示，有46.88%的MDR1阳性病人产生耐药，高于MDR1阴性者(23.53%)。研究过程中我们动态观察5例MDR1表达值>0.6的白血病病人，发现其首次复发时的MDR1表达值均较初治时明显升高，有2例病人于复发后死亡，另外3例再次复发时MDR1的表达水平较首次复发时无明显升高。上述结果可能是由于少量表达MDR1的细胞克隆，经过化疗的筛选成为优势克隆而大量增殖，表达较高水平的MDR1，导致白血病的复发或临床耐药。
本文结果还表明，AL病人MDR1基因阳性表达率及表达均值与病人年龄、性别白细胞计数、肝脾大以及白血病FAB分型等临床诸多参数无关，与文献结果一致〔5，6〕。
本文为青岛市科委资助课题(批准号：9585G17019)
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参考文献
1 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phonel-chloroform extraction. Anul Biochem,1987,162:156
2 Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR(multidrug resistance) gene expression in human tumor by polymerase chain reaction. Proc Natal Acad Sci USA,1990,87:7160
3 Hiddemann W, Buchner T. Treatment strategies in acute myeloid leukemia(AML). Blut,1990,60:163
, http://www.100md.com
4 Picker R, Wallner J, Geissler K, et al. MDR1 gene expression and treatment outcome in acute myeloid leukemia.J Natl Cancer Inst, 1991,83:708
5 Hart SM, Ganeshugguru K, Hoffbrand AV,et al. Expression of multidrug resistance-associated protein (MRP) in acute leuke-mia. Leukemia, 1994, 8:2163
6 Zhou DC, Zittoun R, Marie JP. Expression of multidrug resistance-associated protein(MRP) gene in acute myeloid leukemia and correlation with expression of multidrug resistance(MDR1)gene. Leukemia,1995,9:528
(1999-03-09收稿 1999-07-10修回), http://www.100md.com