大鼠体内植入生物材料对CH50及免疫球蛋白的影响*
作者：朱明华 曾 怡 蒋 丽 黄聘和 吴增树
单位：四川省生物医学材料监测中心，成都 610041
关键词：生物材料；体内植入；免疫球蛋白；CH50值
生物医学工程学杂志990304 摘要 PES、YP及SR三种生物材料植入大鼠皮下后7、14、30、60、90 d，采用Beckman ICS免疫分析系统和标准的总补体量测定方法(CH50法)分析测定血清中免疫球蛋白含量及CH50变化。结果表明YP和SR材料植入动物IgG、IgA明显高于对照组，CH50值明显低于对照组动物，PES材料与对照组相比无明显差异。
Effects on the Amount of Total Hemolytic Complement Levles(CH50)
, 百拇医药
and Immunoglobulin in Serum Induced by the Implantation
of Biomaterials into Rats
Zhu Minghua Zeng Yi Jiang Li Huang Pinghe Wu Zengshu
(Biomedical Material Test Centre of Sichuan, Chengdu 610041)
Abstract Three kinds of biomaterials, PES, YP and SR, were implanted into the subcutaneous tissue of rats and stayed there for 7,14,30,60 and 90 days.Then using the immunity assaying system(Beckman, ICS) and the standard method of measuring the value of total hemolytic complement levels(CH50), we determined the values of immunoglobulin and CH50 in serum of rats. The results showed the amounts of IgG and IgA of rats with the implanted YP and SR materials were significantly higher than those of the control groups, and their value of CH50 was significantly lower than that of the control group. There was no significant difference between the PES group and the control group.
, 百拇医药
Key words Biomaterial Implantation in vivo Immunoglobulin CH50
1 引 言
随着科学技术的向前发展，生物材料已广泛用于医学各领域，我国近10年以来发展很快[1，2]。但由于化学成分、各种添加剂及未聚合的单体与组织长期接触中可能会引起各种反应，除局部一般炎性反应、坏死及肿瘤形成外[3，4]，机体免疫反应十分引人关注。据报道应用硅树脂做妇女乳房修补，可引起自体免疫结缔组织疾病症状，如系统性红斑狼疮[5，6]、硬皮病[7]、斯耶格伦综合症[8]，或者更多的非特异性表现，认为是一种“人佐剂疾病”[9，10]，取出这些修补物后症状可迅速消失。说明了机体产生的抗原抗体反应可激活补体，从而引起补体系统一系列变化，因此某些生物材料体内植入可改变机体的免疫功能。
, http://www.100md.com
我们在大鼠体内植入生物材料，长期动态观察生物材料组织接触后动物血清中的CH50及免疫球蛋白的变化，进一步评价植入物对机体的免疫反应，从不同角度探讨生物材料免疫反应状况，为评价植入材料对机体的免疫反应提供依据。
2 材 料
2.1 生物材料
聚醚砜(PES)、牦牛心包(YP)、硅橡胶(SR)分别由四川大学生物材料及生物技术研究所提供及市售产品。
2.2 实验动物
(1)SD大鼠80只，雌雄各半，健康未经任何试验，体重150～200 g，动物1级，由四川省抗菌素研究所提供。
(2)实验前将动物随机分为四组：三种生物材料各为一组，一组空白对照。每组20只，观察两周，实验整个过程按标准饲养条件喂养。
, 百拇医药
2.3 实验仪器
(1)美国BECKMAN公司免疫化学分析仪(型号：ICS Analyzer Ⅱ)及配套加样器，反应管。
(2)BECKMAN公司高精度稀释器(型号：Accuprep TM System zzzA)。
(3)医学实验数据处理智能系统(型号：94-04版)。
(4)日本岛津公司分光光度计(型号：UV-1601)，SHIMADZU。
2.4 实验试剂
(1)兔抗大鼠IgG：由军事医学科学院制备提供。
(2)兔抗大鼠IgA：由卫生部口腔生物医学工程重点实验室制备提供。
, 百拇医药
(3)溶血素：由军事医学科学院制备提供冻干溶血素。
(4)绵羊红细胞：由华西医大实验动物中心提供。
3 方 法
3.1 试验材料制备及动物体内植入
参照有关材料植入的标准方法[3]。
3.2 血清制备
分别于术后第7、14、30、60、90 d经股静脉采血，室温放置2 h后，2800 r/min离心10 min，吸取上清液制得大鼠血清，立即装入1 ml塑料锥形管内，置于-70 ℃冰箱内保存，待用。
3.3 免疫球蛋白(IgA、IgG)测定
, http://www.100md.com
免疫化学分析仪采用手动法，并与医学实验数据处理智能系统联机检测。
3.3.1 标准曲线 (1)将多个正常对照大鼠血清混合后，假设其代表正常总体，作为IgA，IgG正常参考，设为100 IU/ml。将正常参数作不同程度的稀释，取5-7个浓度梯度，将不同浓度的各梯度正常参考与抗IgG或抗IgA在ICS-Ⅱ仪器上测出抗原抗体结合到达峰值时的速率单位(Ru值)。(2)利用智能系统将不同浓度正常参考的含量(IU/ml)与该浓度测出的Ru均值进行回归拟合优选，优选出工作曲线，并绘制出散点图及拟合曲线，如图1、2。
图1 大鼠IgA工作曲线
Fig 1 IgA working curve of rats
图2 大鼠IgG工作曲线
Fig 2 IgG working curve of rats
, 百拇医药
3.3.2 样品检测 (1)将PES、YP及SR植入动物血清和空白-Bank对照动物血清，用BECKMAN高精确度稀释器稀释，IgG作1∶200稀释，IgA作1∶10稀释。(2)在ICS-Ⅱ仪器上测定出抗原抗体反应的Ru值，智能系统将自动同步采集Ru值，并换算出该样本的含量。
3.4 总补体量(CH50)的测定
参照标准方法[11]。
4 实验结果
(1)PES、YP及SR三种生物材料体内植入后不同时间免疫球蛋白测定结果表明，SR和YP植入动物IgG含量明显高于对照组；PES植入动物与对照动物相比无明显差异，在实验14 d后，IgG含量有增加趋势，统计学分析无显著性意义。但PES植入动物不同时间IgG变化不规则(见表1)。三种材料植入的IgA含量测定结果表明，YP和SR植入动物含量明显高于空白组，在植入14 d时，除SR组，每组动物(包括空白对照)含量均有增高趋势，在60 d后出现下降趋势(见表2)。
, 百拇医药
表1 大鼠体内植入生物材料不同时间IgG测定结果
Table 1 Value of IgG(IU/ml) measured on different days after implantation
of different materials into rats Materials
7d
14d
30d
60d
90d
YP
97.8±21.0
, http://www.100md.com
119.2±21.3
129.4±40.6
119.2±21.3
116.4±32.6
SR
116.5±25.9
116.2±21.3
115.5±19.7
PES
95.4±27.7
100.9±25.4
98.7±19.7
, 百拇医药
100.7±12.6
87.1±20.9
Bank
96.2±10.4
99.1±21.2
93.7±19.7
95.6±6.9
81.6±17.0
表2 大鼠体内植入生物材料不同时间IgA测定结果
Table 2 Value of IgA(IU/ml) measured on different days after implantation
, http://www.100md.com
of different materials into rats Materials
7d
14d
30d
60d
90d
YP
170.7±36.4
217.9±35.0
197.9±35.2
160.2±5.2
138.0±9.2
, 百拇医药
SR
197.3±7.8
153.6±26.4
137.6±15.2
PES
148.5±18.0
210.4±20.4
168.6±8.1
142.1±26.4
112.1±9.0
Bank
146.5±10.2
, 百拇医药
202.4±31.0
166.5±8.4
145.6±17.9
116.0±21.6
(2)PES、YP及SR三种生物材料体内植入后不同时间血清总补体活性检测结果表明，YP和SR植入动物血清总补体活性(50%溶血相应总补体值)明显低于对照组，PES植入动物与对照组动物比无明显差异，随时间的延长两组CH50值均有增加趋势，而YP和SR植入动物CH50变化不规则(见表3)。表3 大鼠体内植入生物材料不同时间CH50测定结果
Table 3 Value of CH50(IU/ml) measured on different days after implantation
, 百拇医药
of different materials into rats Materials
7d
14d
30d
60d
90d
YP
67.5±34.7
67.5±24.2
122.0±15.6
111.5±22.6
133.0±0.0
, 百拇医药
SR
73.3±45.4
99.8±33.2
78.0±38.2
PES
83.3±16.7
74.4±44.6
128.3±45.5
132.0±15.6
146.4±26.8
Bank
87.6±45.4
, 百拇医药
78.0±38.2
123.3±45.5
133.0±0.0
158.3±43.3
5 结论与讨论
采用BECKMAN ICS免疫分析系统[12，13]测定三种生物材料体内植入动物血清免疫球蛋白结果表明：(1)YP和SR组的IgA、IgG明显增加，可以推测出这两种材料体内应用后，作用于机体免疫系统产生大量免疫球蛋白，引起血清中浓度增加，这与有关报道一致。具有免疫反应的材料，在免疫反应过程中，除了可使机体内免疫球蛋白变性、裂解外，可明显地提高免疫系统的刺激作用，出现一系列的免疫反应[14]。(2)YP和SR组的CH50明显降低，可能是由于具有免疫反应的材料的不同结构与活泼的基团(羟基)在反应过程中引起补体裂解导致补体活化[15]。(3)PES组与对照比无明显差异，说明该材料不具有引起免疫球蛋白和补体活化的化学结构及基团。通过以上两种检测方法对三种材料进行系统的免疫学评价，初步结果反应了不同材料所致机体免疫反应有所不同，研究也进一步证实这两种方法用于评价生物材料所致机体免疫反应是可行的。这将为制定生物材料生物相容性评价标准增添免疫学方面新的评价指标提供重要的参考价值。
, http://www.100md.com
* 国家自然科学基金资助项目(39470217)省八五重点攻关课题(921034)
参考文献
1 吴增树，李国光，王定国.生物材料的应用，生物材料毒理学及应用.成都：成都科技大学出版社.1988∶166
2 范加裕，徐丽蓉.GN514硅橡胶鞍鼻注射整形1014例五年随访分析.生物医学工程学杂志，1986；5(1)∶14
3 朱明华，杨成民，王彭延等.植入性高分子材料的组织病理学观察.北京生物医学工程，1991；10(2)∶102
4 朱明华，黄聘和，曾 怡等.高分子材料生物应用与致突致癌效应.北京生物医学工程，1996；15(2)∶121
5 Kumagai Y, Shiokava Y, Medsger TA et al. Clinical spectrum of connective tissue disease after cosmetic sugery. Arthritis Rheum, 1984; 27∶1
, http://www.100md.com
6 Van Nunen SA, Gatenby PA, Basten A. Post-mammoplas connective tissue disease. Arthritis Rheum， 1983; 25∶694
7 Hitoshi S, Ito Y, Takehara K et al. A case of malignant hypertension and scleroderma after cosmetic surgery. Jpn. J. Med. 1991; 30∶97
8 Okamo Y. Nishikai M, Sato A. Scleroderma, primary biliary cirrhosis and Sjogren's syndrome after cosmetic breast augmentation with silicon injection. A case report of possible human adjuvant disease. Ann Rheum DIs.1984; 43∶502
, 百拇医药
9 Hammer M,Krippner H. Three cases of chronic polyarthritis after silicon implantation (breast augmentatio-
n):causal relationship.Immun Infekt, 1991; 19∶62
10 Kaiser W, Biesenbach G, Study U et al. Human adjuvant disease:Remission of silicone induced autoimmune disease after explantation of breast augmentation. Ann. Rheum Dis 1990; 49∶937
11 叶应妩，王毓三，马兆祥等.总补体溶血活性测定.全国临床检验操作常规.广州：东南大学出版社.1991∶302
, 百拇医药
12 张静仪，蒋成荣.免疫化学系统(ICS-Ⅱ型)自配试剂简易流程.上海免疫学杂志，1989；9(5)∶299
13 孔宪涛，谢映华.利用ICS-Ⅱ型手动快速测定体液中的Ig和C3的含量.临床检验杂志，1986；4(1)∶39
14 Kossovsky NIR. Assay for humoral immunity to macromolecules. Pct Int Appl Wo, 1994; 20857
15 Raymond M,Hakim MD, PH D et al. Complement activation and hypersensitivity reaction to dialysis membrane. N Eng J Med, 1984; 311(4)∶878
(收稿：1998-02-13 修回：1998-04-13), 百拇医药
单位：四川省生物医学材料监测中心，成都 610041
关键词：生物材料；体内植入；免疫球蛋白；CH50值
生物医学工程学杂志990304 摘要 PES、YP及SR三种生物材料植入大鼠皮下后7、14、30、60、90 d，采用Beckman ICS免疫分析系统和标准的总补体量测定方法(CH50法)分析测定血清中免疫球蛋白含量及CH50变化。结果表明YP和SR材料植入动物IgG、IgA明显高于对照组，CH50值明显低于对照组动物，PES材料与对照组相比无明显差异。
Effects on the Amount of Total Hemolytic Complement Levles(CH50)
, 百拇医药
and Immunoglobulin in Serum Induced by the Implantation
of Biomaterials into Rats
Zhu Minghua Zeng Yi Jiang Li Huang Pinghe Wu Zengshu
(Biomedical Material Test Centre of Sichuan, Chengdu 610041)
Abstract Three kinds of biomaterials, PES, YP and SR, were implanted into the subcutaneous tissue of rats and stayed there for 7,14,30,60 and 90 days.Then using the immunity assaying system(Beckman, ICS) and the standard method of measuring the value of total hemolytic complement levels(CH50), we determined the values of immunoglobulin and CH50 in serum of rats. The results showed the amounts of IgG and IgA of rats with the implanted YP and SR materials were significantly higher than those of the control groups, and their value of CH50 was significantly lower than that of the control group. There was no significant difference between the PES group and the control group.
, 百拇医药
Key words Biomaterial Implantation in vivo Immunoglobulin CH50
1 引 言
随着科学技术的向前发展，生物材料已广泛用于医学各领域，我国近10年以来发展很快[1，2]。但由于化学成分、各种添加剂及未聚合的单体与组织长期接触中可能会引起各种反应，除局部一般炎性反应、坏死及肿瘤形成外[3，4]，机体免疫反应十分引人关注。据报道应用硅树脂做妇女乳房修补，可引起自体免疫结缔组织疾病症状，如系统性红斑狼疮[5，6]、硬皮病[7]、斯耶格伦综合症[8]，或者更多的非特异性表现，认为是一种“人佐剂疾病”[9，10]，取出这些修补物后症状可迅速消失。说明了机体产生的抗原抗体反应可激活补体，从而引起补体系统一系列变化，因此某些生物材料体内植入可改变机体的免疫功能。
, http://www.100md.com
我们在大鼠体内植入生物材料，长期动态观察生物材料组织接触后动物血清中的CH50及免疫球蛋白的变化，进一步评价植入物对机体的免疫反应，从不同角度探讨生物材料免疫反应状况，为评价植入材料对机体的免疫反应提供依据。
2 材 料
2.1 生物材料
聚醚砜(PES)、牦牛心包(YP)、硅橡胶(SR)分别由四川大学生物材料及生物技术研究所提供及市售产品。
2.2 实验动物
(1)SD大鼠80只，雌雄各半，健康未经任何试验，体重150～200 g，动物1级，由四川省抗菌素研究所提供。
(2)实验前将动物随机分为四组：三种生物材料各为一组，一组空白对照。每组20只，观察两周，实验整个过程按标准饲养条件喂养。
, 百拇医药
2.3 实验仪器
(1)美国BECKMAN公司免疫化学分析仪(型号：ICS Analyzer Ⅱ)及配套加样器，反应管。
(2)BECKMAN公司高精度稀释器(型号：Accuprep TM System zzzA)。
(3)医学实验数据处理智能系统(型号：94-04版)。
(4)日本岛津公司分光光度计(型号：UV-1601)，SHIMADZU。
2.4 实验试剂
(1)兔抗大鼠IgG：由军事医学科学院制备提供。
(2)兔抗大鼠IgA：由卫生部口腔生物医学工程重点实验室制备提供。
, 百拇医药
(3)溶血素：由军事医学科学院制备提供冻干溶血素。
(4)绵羊红细胞：由华西医大实验动物中心提供。
3 方 法
3.1 试验材料制备及动物体内植入
参照有关材料植入的标准方法[3]。
3.2 血清制备
分别于术后第7、14、30、60、90 d经股静脉采血，室温放置2 h后，2800 r/min离心10 min，吸取上清液制得大鼠血清，立即装入1 ml塑料锥形管内，置于-70 ℃冰箱内保存，待用。
3.3 免疫球蛋白(IgA、IgG)测定
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免疫化学分析仪采用手动法，并与医学实验数据处理智能系统联机检测。
3.3.1 标准曲线 (1)将多个正常对照大鼠血清混合后，假设其代表正常总体，作为IgA，IgG正常参考，设为100 IU/ml。将正常参数作不同程度的稀释，取5-7个浓度梯度，将不同浓度的各梯度正常参考与抗IgG或抗IgA在ICS-Ⅱ仪器上测出抗原抗体结合到达峰值时的速率单位(Ru值)。(2)利用智能系统将不同浓度正常参考的含量(IU/ml)与该浓度测出的Ru均值进行回归拟合优选，优选出工作曲线，并绘制出散点图及拟合曲线，如图1、2。
图1 大鼠IgA工作曲线
Fig 1 IgA working curve of rats
图2 大鼠IgG工作曲线
Fig 2 IgG working curve of rats
, 百拇医药
3.3.2 样品检测 (1)将PES、YP及SR植入动物血清和空白-Bank对照动物血清，用BECKMAN高精确度稀释器稀释，IgG作1∶200稀释，IgA作1∶10稀释。(2)在ICS-Ⅱ仪器上测定出抗原抗体反应的Ru值，智能系统将自动同步采集Ru值，并换算出该样本的含量。
3.4 总补体量(CH50)的测定
参照标准方法[11]。
4 实验结果
(1)PES、YP及SR三种生物材料体内植入后不同时间免疫球蛋白测定结果表明，SR和YP植入动物IgG含量明显高于对照组；PES植入动物与对照动物相比无明显差异，在实验14 d后，IgG含量有增加趋势，统计学分析无显著性意义。但PES植入动物不同时间IgG变化不规则(见表1)。三种材料植入的IgA含量测定结果表明，YP和SR植入动物含量明显高于空白组，在植入14 d时，除SR组，每组动物(包括空白对照)含量均有增高趋势，在60 d后出现下降趋势(见表2)。
, 百拇医药
表1 大鼠体内植入生物材料不同时间IgG测定结果
Table 1 Value of IgG(IU/ml) measured on different days after implantation
of different materials into rats Materials
7d
14d
30d
60d
90d
YP
97.8±21.0
, http://www.100md.com
119.2±21.3
129.4±40.6
119.2±21.3
116.4±32.6
SR
116.5±25.9
116.2±21.3
115.5±19.7
PES
95.4±27.7
100.9±25.4
98.7±19.7
, 百拇医药
100.7±12.6
87.1±20.9
Bank
96.2±10.4
99.1±21.2
93.7±19.7
95.6±6.9
81.6±17.0
表2 大鼠体内植入生物材料不同时间IgA测定结果
Table 2 Value of IgA(IU/ml) measured on different days after implantation
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of different materials into rats Materials
7d
14d
30d
60d
90d
YP
170.7±36.4
217.9±35.0
197.9±35.2
160.2±5.2
138.0±9.2
, 百拇医药
SR
197.3±7.8
153.6±26.4
137.6±15.2
PES
148.5±18.0
210.4±20.4
168.6±8.1
142.1±26.4
112.1±9.0
Bank
146.5±10.2
, 百拇医药
202.4±31.0
166.5±8.4
145.6±17.9
116.0±21.6
(2)PES、YP及SR三种生物材料体内植入后不同时间血清总补体活性检测结果表明，YP和SR植入动物血清总补体活性(50%溶血相应总补体值)明显低于对照组，PES植入动物与对照组动物比无明显差异，随时间的延长两组CH50值均有增加趋势，而YP和SR植入动物CH50变化不规则(见表3)。表3 大鼠体内植入生物材料不同时间CH50测定结果
Table 3 Value of CH50(IU/ml) measured on different days after implantation
, 百拇医药
of different materials into rats Materials
7d
14d
30d
60d
90d
YP
67.5±34.7
67.5±24.2
122.0±15.6
111.5±22.6
133.0±0.0
, 百拇医药
SR
73.3±45.4
99.8±33.2
78.0±38.2
PES
83.3±16.7
74.4±44.6
128.3±45.5
132.0±15.6
146.4±26.8
Bank
87.6±45.4
, 百拇医药
78.0±38.2
123.3±45.5
133.0±0.0
158.3±43.3
5 结论与讨论
采用BECKMAN ICS免疫分析系统[12，13]测定三种生物材料体内植入动物血清免疫球蛋白结果表明：(1)YP和SR组的IgA、IgG明显增加，可以推测出这两种材料体内应用后，作用于机体免疫系统产生大量免疫球蛋白，引起血清中浓度增加，这与有关报道一致。具有免疫反应的材料，在免疫反应过程中，除了可使机体内免疫球蛋白变性、裂解外，可明显地提高免疫系统的刺激作用，出现一系列的免疫反应[14]。(2)YP和SR组的CH50明显降低，可能是由于具有免疫反应的材料的不同结构与活泼的基团(羟基)在反应过程中引起补体裂解导致补体活化[15]。(3)PES组与对照比无明显差异，说明该材料不具有引起免疫球蛋白和补体活化的化学结构及基团。通过以上两种检测方法对三种材料进行系统的免疫学评价，初步结果反应了不同材料所致机体免疫反应有所不同，研究也进一步证实这两种方法用于评价生物材料所致机体免疫反应是可行的。这将为制定生物材料生物相容性评价标准增添免疫学方面新的评价指标提供重要的参考价值。
, http://www.100md.com
* 国家自然科学基金资助项目(39470217)省八五重点攻关课题(921034)
参考文献
1 吴增树，李国光，王定国.生物材料的应用，生物材料毒理学及应用.成都：成都科技大学出版社.1988∶166
2 范加裕，徐丽蓉.GN514硅橡胶鞍鼻注射整形1014例五年随访分析.生物医学工程学杂志，1986；5(1)∶14
3 朱明华，杨成民，王彭延等.植入性高分子材料的组织病理学观察.北京生物医学工程，1991；10(2)∶102
4 朱明华，黄聘和，曾 怡等.高分子材料生物应用与致突致癌效应.北京生物医学工程，1996；15(2)∶121
5 Kumagai Y, Shiokava Y, Medsger TA et al. Clinical spectrum of connective tissue disease after cosmetic sugery. Arthritis Rheum, 1984; 27∶1
, http://www.100md.com
6 Van Nunen SA, Gatenby PA, Basten A. Post-mammoplas connective tissue disease. Arthritis Rheum， 1983; 25∶694
7 Hitoshi S, Ito Y, Takehara K et al. A case of malignant hypertension and scleroderma after cosmetic surgery. Jpn. J. Med. 1991; 30∶97
8 Okamo Y. Nishikai M, Sato A. Scleroderma, primary biliary cirrhosis and Sjogren's syndrome after cosmetic breast augmentation with silicon injection. A case report of possible human adjuvant disease. Ann Rheum DIs.1984; 43∶502
, 百拇医药
9 Hammer M,Krippner H. Three cases of chronic polyarthritis after silicon implantation (breast augmentatio-
n):causal relationship.Immun Infekt, 1991; 19∶62
10 Kaiser W, Biesenbach G, Study U et al. Human adjuvant disease:Remission of silicone induced autoimmune disease after explantation of breast augmentation. Ann. Rheum Dis 1990; 49∶937
11 叶应妩，王毓三，马兆祥等.总补体溶血活性测定.全国临床检验操作常规.广州：东南大学出版社.1991∶302
, 百拇医药
12 张静仪，蒋成荣.免疫化学系统(ICS-Ⅱ型)自配试剂简易流程.上海免疫学杂志，1989；9(5)∶299
13 孔宪涛，谢映华.利用ICS-Ⅱ型手动快速测定体液中的Ig和C3的含量.临床检验杂志，1986；4(1)∶39
14 Kossovsky NIR. Assay for humoral immunity to macromolecules. Pct Int Appl Wo, 1994; 20857
15 Raymond M,Hakim MD, PH D et al. Complement activation and hypersensitivity reaction to dialysis membrane. N Eng J Med, 1984; 311(4)∶878
(收稿：1998-02-13 修回：1998-04-13), 百拇医药