补体活化与中性粒细胞产生活性氧之间的反馈调节作用△
作者：范欣荣 凌允礼 吴元德 侯健存
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理研究室，北京 100005
关键词：补体；中性粒细胞；活性氧
中国医学科学院学报990303 摘要 目的 在试管实验中证明补体系统的活化与中性粒细胞产生的活性氧间存在相互作用的反馈关系。方法 用菊糖活化的补体作用于中性粒细胞产生活性氧，并进一步通过测定吸光度以观察补体进一步活化情况。用佛波醇肉豆蔻醋酸酯激发中性粒细胞产生的活性氧作用于补体，并进一步采用发光测定仪测定活性氧来观察活化的补体对中性粒细胞释放活性氧的促进作用。结果 试管实验证明活化的补体能刺激中性粒细胞产生活性氧，而活性氧又能进一步活化补体。结论 补体和中性粒细胞产生的活性氧两者间存在着相互活化的反馈调节作用。从而推测炎症过程中补体活化在炎症反应的产生中起主要作用，而在炎症反应的持续过程中，此两者起互相促进的反馈调节作用。
, http://www.100md.com
中图号 R392.31
Relationship between Complement Activation and Reactive Oxygen Species Generation in Inflammatory Response
Fan Xinrong Ling Yunli Wu Yuande Hou Jiancun
(Department of Pathology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005)
Objective To verify the proposed activation feedback mechanism between complement and polymorphonuclear leukocytes(PMN) derived reactive oxygen species(ROS).Methods In vitro tests were designed to identify the activation feedback process by alternative activations of complement by inulin or PMNs by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA) in the test medium in consisting serum complement and isolated PMNs，with chemiluminescence technique to determine the production of ROS and complement fixation trial for complement activations.Results Evidently that actevated complement could activate PMNs to release ROS which further activated complement，so the activating feedback cycle was set.Conclusions The complement and PMNs-ROS activation feedback cycle mechanism was recognized.It was expected to serve for delineating the regulation of inflammatory response.
, 百拇医药
Key words complement; polymorphonuclear leukocytes; reactive oxygen species
90年代以来，本研究组发现亚硒酸钠、甘草酸盐等参与机体抗氧化或清除自由基作用的化合物在动物体内均有抑制补体活化的作用[1]。临床上亦发现，口服亚硒酸钠能阻断补体活化，并显著降低流行性出血热患者的死亡率[2]。小鼠体内实验证明，抑制补体的活化或清除氧自由基(oxygen free radical，OFR)均可有效地减轻实验动物皮肤Arthus血管炎的发生。以上结果提示，补体介导的炎症反应损伤与氧自由基的参与有关。补体活化片段可以趋化中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)，并将后者激活发生呼吸爆发而释放OFR。Shingu及Vogt等[3，4]也曾提出，炎症损伤过程中PMN激活产生的氧代谢产物可能是活化补体的一种方式。由此促使笔者提出一个设想，补体系统介导的炎症反应和组织损伤是在PMN呼吸爆发产生氧自由基的协同作用下发生的，即补体活化与PMN呼吸爆发产生的氧自由基之间存在着相互促进的反馈作用： 补体活化引起PMN呼吸爆发，PMN释放的OFR又进一步促进补体的活化(图1)。此反馈作用可能是调节炎症反应及组织损伤的一个重要途径[5]。本研究拟通过体外实验验证此反馈作用的存在，为临床上调控炎症反应提供新的理论依据。
, 百拇医药
图1 炎症反应中补体、中性粒细胞及活性氧之间的相互作用关系
Fig 1 Reaction among complement，polymorphonuclear leukocytes and reactive oxygen species in inflammation
OFR：oxygen free radial
1 材料和方法
试剂与仪器 鲁米诺(luminol)和佛波醇肉豆蔻醋酸脂(TPA)为Sigma公司产品，糖原为第二军医大学朝晖药厂产品，溶血素由卫生部北京生物制品研究所生产，其他试剂均为国产分析纯产品。溶血活性实验比色测定采用上海第三分析仪器厂生产的722光栅分光光度计，活性氧发光测定使用上海市技术监督局生产的SHG-I型生物化学发光测定仪。
, 百拇医药
方法
活化的补体诱导PMN产生活性氧及后者进一步激活补体实验： 菊糖活化的补体诱导PMN产生活性氧发光实验 在1 ml反应体系中，实验组含有800 μl PMN混悬液(4×106/ml)、 100 μl豚鼠血清、50 μl菊糖混悬液(4 mg/ml)、50 μl鲁米诺溶液(1.75 μg/ml); 两个对照组分别以等量巴比妥缓冲液(veronal-buffered saline，VBS)替代菊糖混悬液及血清，余同实验组。检测各组发光值，每10分钟计数1次，描记发光曲线。
菊糖激活补体诱发PMN产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)进一步激活补体实验： 在200 μl反应体系中，实验组含有170 μl PMN混悬液(同上)、20 μl豚鼠血清、10 μl菊糖混悬液(同上)；两个对照组分别以等量巴比妥缓冲液替代菊糖混悬液及PMN混悬液，余同实验组。各组反应体系分别作溶血活性实验(按照传统CH50方法改进[6])，即在37℃水浴1 h后，各组分别取50 μl样品，加入2.5 ml含有1 U溶血素、0.5 ml 2%羊红细胞的缓冲液中，37℃水浴0.5 h，离心后取上清在542 nm波长的光波下比色，根据所测吸光值，比较各组补体活化情况，补体活性以吸光度(absorbance，A)表示。
, 百拇医药
PMN产生的ROS激活补体及后者进一步诱发PMN产生ROS实验： TPA激发PMN产生活性氧对补体激活实验 在300 μl实验体系中，实验组含有267 μl PMN 混悬液(同上)、30 μl豚鼠血清、3μl TPA溶液(1 μg/ml)。两个对照组分别以等量缓冲液替代TPA溶液、PMN混悬液，余同实验组。检测各组溶血活性，比较补体活化程度。
活性氧激活补体诱发PMN进一步产生活性氧发光实验： 在1 ml实验体系中，实验组含有840μl PMN混悬液(同上)、100 μl豚鼠血清、10 μl TPA溶液(1 μg/ml)、50 μl鲁米诺溶液(同上)。两个对照组分别以等量缓冲液替代豚鼠血清和PMN混悬液，余同实验组。检测各组发光值，描记发光曲线。
统计学处理 采用t检验，数据用
±s表示。
, 百拇医药 2 结果和讨论
菊糖活化的补体诱导PMN产生活性氧的发光曲线示，实验组与无血清或无菊糖对照组相比发光效应显著增强(P<0.01，n=8)(图2)。表明血清中补体激活产物能刺激PMN呼吸爆发，产生活性氧及发光。
图2 补体活化诱导中性粒细胞产生活性氧
Fig 2 Activated complememt system stimulates PMNs generating reactive oxygen species
PMN：polymorphonuclear leukocytes; VBS：veronal-buffered saline
菊糖激活补体诱发PMN产生活性氧，后者进一步激活补体。溶血活性实验测定结果表明，实验组较菊糖及血清对照组的溶血活性显著降低，三组补体活性吸光度(A)分别为0.314±0.064、0.501±0.083和0.684±0.147，实验组与两对照组比较，均P<0.01。说明血清中补体除受到菊糖激活外，还可能被PMN受激产生的活性氧进一步激活，进而使实验组溶血活性进一步显著降低。
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TPA激发PMN产生的活性氧对补体的激活结果表明，实验组较无TPA和无PMN对照组的溶血活性显著降低，三组的补体活性吸光度(A)分别为0.534±0.032、0.700±0.017和0.663±0.053，实验组与对照组比较均P<0.01。PMN受TPA作用后产生的活性氧可以激活血清中的补体系统，进而使溶血活性显著下降。
活性氧激活补体可诱发PMN进一步产生活性氧，其发光曲线示实验组呈现宽大或呈双峰发光曲线，而对照组仅见陡直的单峰(图3)。
图3 活性氧活化的补体进一步诱发中性粒细胞产生活性氧
Fig 3 Activated complement system by reactive oxygen species induces PMN producing more reactive oxygen species
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TPA：12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate;PMN：polymorphonuclear leukocytes; VBS：veronal-buffered saline
宽大的发光曲线说明实验组比对照组产生更多的活性氧。双峰发光曲线的形成可能是PMN第一次受到TPA刺激产生活性氧并发光后，其产物激活血清中的补体，后者进一步刺激PMN呼吸爆发而产生活性氧并发光。
目前认为炎症性疾病，特别是在自身免疫病及一些病毒感染等免疫复合物病中，组织的炎症损伤主要由补体系统的活化所介导。多年来，对补体系统活化与炎症损伤的关系已引起实验及临床研究者的广泛关注。由于机体内各种生物学功能调控系统的复杂性，补体活化触发炎症损伤的机制迄今大部分仍属推测，急待深入研究和证实[7]。本研究在试管实验中证实，补体系统的活化与PMN产生活性氧之间存在双向反馈调节作用。但在体内，补体-PMN-OFR的协同反馈作用尚需进一步验证。
, 百拇医药
从图1可知，上述两个生物反应系统中任何一方被单独激活均有可能启动此反馈作用，从而引发炎症反应。目前已知补体活化是导致炎症反应的基础，笔者认为由OFR参与的协同作用可能是维持炎症持续反应的重要机制，而活性氧产生所引发的炎症也可能通过补体活化而实现。因此，某些补体活化或PMN激活抑制剂及OFR清除剂、抗氧化剂可能通过抑制或阻断此反馈作用而达到减轻或消除炎症反应的效果。本实验结果对探索炎症发生机制具有重要意义，并可为临床治疗炎症提供新的理论依据。
△国家自然科学基金(39670288)资助
侯健存为通讯作者
作者简介：范欣荣，博士研究生
参考文献
1 侯健存，戴 岩，凌允礼.亚硒酸钠在小鼠体内对补体活化的抑制作用.中国医学科学院学报，1989,11(4):250～253
, http://www.100md.com
2 侯健存，江之云，何志藩，等.硒对流行性出血热患者补体活化的抑制作用与疗效观察.中华医学杂志，1993，73(11):645～646
3 Shingu M，Nonaka S，Nishimukai H，et al.Activation of complement in normal serum by hydrogen peroxide and hydrogen peroxide-related oxygen radicals produced by activated neutrophils.Clin Exp Immunol，1992，90：72～78
4 Vogt W，Hesse D.Oxidants generated by the myeloperoxidase-halide system activate the fifth component of human complement，C5.Immunobiology，1994，192(1,2):1～9
, 百拇医药
5 Hou JC.Inhibitory effect of selenite and other antioxidants on complement-mediated tissue injury in patients with epidemic hemorrhagic fever.Biol Trace Elem Res，1997，56(1)：125～130
6 Rose NR，de Macario EC，Fahey JL，et al.Manual of clinical laboratory immunology.4th ed.Washington DC：American Society for Microbiology Press，1992
7 Johnson KJ，Ward P.Newer concepts in the pathogenesis of immune complex-induced tissue injury.In：Rubin E，Damjanov I ed.Advances in the biology of disease.London：Williams & Wilkins，1984
(1998-07-07收稿), 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理研究室，北京 100005
关键词：补体；中性粒细胞；活性氧
中国医学科学院学报990303 摘要 目的 在试管实验中证明补体系统的活化与中性粒细胞产生的活性氧间存在相互作用的反馈关系。方法 用菊糖活化的补体作用于中性粒细胞产生活性氧，并进一步通过测定吸光度以观察补体进一步活化情况。用佛波醇肉豆蔻醋酸酯激发中性粒细胞产生的活性氧作用于补体，并进一步采用发光测定仪测定活性氧来观察活化的补体对中性粒细胞释放活性氧的促进作用。结果 试管实验证明活化的补体能刺激中性粒细胞产生活性氧，而活性氧又能进一步活化补体。结论 补体和中性粒细胞产生的活性氧两者间存在着相互活化的反馈调节作用。从而推测炎症过程中补体活化在炎症反应的产生中起主要作用，而在炎症反应的持续过程中，此两者起互相促进的反馈调节作用。
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中图号 R392.31
Relationship between Complement Activation and Reactive Oxygen Species Generation in Inflammatory Response
Fan Xinrong Ling Yunli Wu Yuande Hou Jiancun
(Department of Pathology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005)
Objective To verify the proposed activation feedback mechanism between complement and polymorphonuclear leukocytes(PMN) derived reactive oxygen species(ROS).Methods In vitro tests were designed to identify the activation feedback process by alternative activations of complement by inulin or PMNs by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA) in the test medium in consisting serum complement and isolated PMNs，with chemiluminescence technique to determine the production of ROS and complement fixation trial for complement activations.Results Evidently that actevated complement could activate PMNs to release ROS which further activated complement，so the activating feedback cycle was set.Conclusions The complement and PMNs-ROS activation feedback cycle mechanism was recognized.It was expected to serve for delineating the regulation of inflammatory response.
, 百拇医药
Key words complement; polymorphonuclear leukocytes; reactive oxygen species
90年代以来，本研究组发现亚硒酸钠、甘草酸盐等参与机体抗氧化或清除自由基作用的化合物在动物体内均有抑制补体活化的作用[1]。临床上亦发现，口服亚硒酸钠能阻断补体活化，并显著降低流行性出血热患者的死亡率[2]。小鼠体内实验证明，抑制补体的活化或清除氧自由基(oxygen free radical，OFR)均可有效地减轻实验动物皮肤Arthus血管炎的发生。以上结果提示，补体介导的炎症反应损伤与氧自由基的参与有关。补体活化片段可以趋化中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)，并将后者激活发生呼吸爆发而释放OFR。Shingu及Vogt等[3，4]也曾提出，炎症损伤过程中PMN激活产生的氧代谢产物可能是活化补体的一种方式。由此促使笔者提出一个设想，补体系统介导的炎症反应和组织损伤是在PMN呼吸爆发产生氧自由基的协同作用下发生的，即补体活化与PMN呼吸爆发产生的氧自由基之间存在着相互促进的反馈作用： 补体活化引起PMN呼吸爆发，PMN释放的OFR又进一步促进补体的活化(图1)。此反馈作用可能是调节炎症反应及组织损伤的一个重要途径[5]。本研究拟通过体外实验验证此反馈作用的存在，为临床上调控炎症反应提供新的理论依据。
, 百拇医药
图1 炎症反应中补体、中性粒细胞及活性氧之间的相互作用关系
Fig 1 Reaction among complement，polymorphonuclear leukocytes and reactive oxygen species in inflammation
OFR：oxygen free radial
1 材料和方法
试剂与仪器 鲁米诺(luminol)和佛波醇肉豆蔻醋酸脂(TPA)为Sigma公司产品，糖原为第二军医大学朝晖药厂产品，溶血素由卫生部北京生物制品研究所生产，其他试剂均为国产分析纯产品。溶血活性实验比色测定采用上海第三分析仪器厂生产的722光栅分光光度计，活性氧发光测定使用上海市技术监督局生产的SHG-I型生物化学发光测定仪。
, 百拇医药
方法
活化的补体诱导PMN产生活性氧及后者进一步激活补体实验： 菊糖活化的补体诱导PMN产生活性氧发光实验 在1 ml反应体系中，实验组含有800 μl PMN混悬液(4×106/ml)、 100 μl豚鼠血清、50 μl菊糖混悬液(4 mg/ml)、50 μl鲁米诺溶液(1.75 μg/ml); 两个对照组分别以等量巴比妥缓冲液(veronal-buffered saline，VBS)替代菊糖混悬液及血清，余同实验组。检测各组发光值，每10分钟计数1次，描记发光曲线。
菊糖激活补体诱发PMN产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)进一步激活补体实验： 在200 μl反应体系中，实验组含有170 μl PMN混悬液(同上)、20 μl豚鼠血清、10 μl菊糖混悬液(同上)；两个对照组分别以等量巴比妥缓冲液替代菊糖混悬液及PMN混悬液，余同实验组。各组反应体系分别作溶血活性实验(按照传统CH50方法改进[6])，即在37℃水浴1 h后，各组分别取50 μl样品，加入2.5 ml含有1 U溶血素、0.5 ml 2%羊红细胞的缓冲液中，37℃水浴0.5 h，离心后取上清在542 nm波长的光波下比色，根据所测吸光值，比较各组补体活化情况，补体活性以吸光度(absorbance，A)表示。
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PMN产生的ROS激活补体及后者进一步诱发PMN产生ROS实验： TPA激发PMN产生活性氧对补体激活实验 在300 μl实验体系中，实验组含有267 μl PMN 混悬液(同上)、30 μl豚鼠血清、3μl TPA溶液(1 μg/ml)。两个对照组分别以等量缓冲液替代TPA溶液、PMN混悬液，余同实验组。检测各组溶血活性，比较补体活化程度。
活性氧激活补体诱发PMN进一步产生活性氧发光实验： 在1 ml实验体系中，实验组含有840μl PMN混悬液(同上)、100 μl豚鼠血清、10 μl TPA溶液(1 μg/ml)、50 μl鲁米诺溶液(同上)。两个对照组分别以等量缓冲液替代豚鼠血清和PMN混悬液，余同实验组。检测各组发光值，描记发光曲线。
统计学处理 采用t检验，数据用
±s表示。, 百拇医药 2 结果和讨论
菊糖活化的补体诱导PMN产生活性氧的发光曲线示，实验组与无血清或无菊糖对照组相比发光效应显著增强(P<0.01，n=8)(图2)。表明血清中补体激活产物能刺激PMN呼吸爆发，产生活性氧及发光。
图2 补体活化诱导中性粒细胞产生活性氧
Fig 2 Activated complememt system stimulates PMNs generating reactive oxygen species
PMN：polymorphonuclear leukocytes; VBS：veronal-buffered saline
菊糖激活补体诱发PMN产生活性氧，后者进一步激活补体。溶血活性实验测定结果表明，实验组较菊糖及血清对照组的溶血活性显著降低，三组补体活性吸光度(A)分别为0.314±0.064、0.501±0.083和0.684±0.147，实验组与两对照组比较，均P<0.01。说明血清中补体除受到菊糖激活外，还可能被PMN受激产生的活性氧进一步激活，进而使实验组溶血活性进一步显著降低。
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TPA激发PMN产生的活性氧对补体的激活结果表明，实验组较无TPA和无PMN对照组的溶血活性显著降低，三组的补体活性吸光度(A)分别为0.534±0.032、0.700±0.017和0.663±0.053，实验组与对照组比较均P<0.01。PMN受TPA作用后产生的活性氧可以激活血清中的补体系统，进而使溶血活性显著下降。
活性氧激活补体可诱发PMN进一步产生活性氧，其发光曲线示实验组呈现宽大或呈双峰发光曲线，而对照组仅见陡直的单峰(图3)。
图3 活性氧活化的补体进一步诱发中性粒细胞产生活性氧
Fig 3 Activated complement system by reactive oxygen species induces PMN producing more reactive oxygen species
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TPA：12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate;PMN：polymorphonuclear leukocytes; VBS：veronal-buffered saline
宽大的发光曲线说明实验组比对照组产生更多的活性氧。双峰发光曲线的形成可能是PMN第一次受到TPA刺激产生活性氧并发光后，其产物激活血清中的补体，后者进一步刺激PMN呼吸爆发而产生活性氧并发光。
目前认为炎症性疾病，特别是在自身免疫病及一些病毒感染等免疫复合物病中，组织的炎症损伤主要由补体系统的活化所介导。多年来，对补体系统活化与炎症损伤的关系已引起实验及临床研究者的广泛关注。由于机体内各种生物学功能调控系统的复杂性，补体活化触发炎症损伤的机制迄今大部分仍属推测，急待深入研究和证实[7]。本研究在试管实验中证实，补体系统的活化与PMN产生活性氧之间存在双向反馈调节作用。但在体内，补体-PMN-OFR的协同反馈作用尚需进一步验证。
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从图1可知，上述两个生物反应系统中任何一方被单独激活均有可能启动此反馈作用，从而引发炎症反应。目前已知补体活化是导致炎症反应的基础，笔者认为由OFR参与的协同作用可能是维持炎症持续反应的重要机制，而活性氧产生所引发的炎症也可能通过补体活化而实现。因此，某些补体活化或PMN激活抑制剂及OFR清除剂、抗氧化剂可能通过抑制或阻断此反馈作用而达到减轻或消除炎症反应的效果。本实验结果对探索炎症发生机制具有重要意义，并可为临床治疗炎症提供新的理论依据。
△国家自然科学基金(39670288)资助
侯健存为通讯作者
作者简介：范欣荣，博士研究生
参考文献
1 侯健存，戴 岩，凌允礼.亚硒酸钠在小鼠体内对补体活化的抑制作用.中国医学科学院学报，1989,11(4):250～253
, http://www.100md.com
2 侯健存，江之云，何志藩，等.硒对流行性出血热患者补体活化的抑制作用与疗效观察.中华医学杂志，1993，73(11):645～646
3 Shingu M，Nonaka S，Nishimukai H，et al.Activation of complement in normal serum by hydrogen peroxide and hydrogen peroxide-related oxygen radicals produced by activated neutrophils.Clin Exp Immunol，1992，90：72～78
4 Vogt W，Hesse D.Oxidants generated by the myeloperoxidase-halide system activate the fifth component of human complement，C5.Immunobiology，1994，192(1,2):1～9
, 百拇医药
5 Hou JC.Inhibitory effect of selenite and other antioxidants on complement-mediated tissue injury in patients with epidemic hemorrhagic fever.Biol Trace Elem Res，1997，56(1)：125～130
6 Rose NR，de Macario EC，Fahey JL，et al.Manual of clinical laboratory immunology.4th ed.Washington DC：American Society for Microbiology Press，1992
7 Johnson KJ，Ward P.Newer concepts in the pathogenesis of immune complex-induced tissue injury.In：Rubin E，Damjanov I ed.Advances in the biology of disease.London：Williams & Wilkins，1984
(1998-07-07收稿), 百拇医药