1，25-(OH)2维生素D3放射受体检测技术的建立及其在原发性骨质疏松症中的实验研究1
作者：张培因 曹 杰 石育原 刘大程 王东辉
单位：张培因 曹 杰 石育原(白求恩医科大学分子生物学教研室，长春 130021)；刘大程 王东辉(长春医学高等专科学校)
关键词：1，25二羟基胆钙甾醇；超微量放射受体检测技术；骨质疏松症
中国老年学杂志/990322 摘 要 目的 建立一种改良的血清1，25-(OH)2维生素D3即1，25二羟基胆钙甾醇(1，25-dihydrochole-calciferel，DHCC)超微量放射受体检测技术(RRA)，对原发性骨质疏松症血清的DHCC含量进行检测。方法 用非均相核素交换法制备了3H-DHCC，应用超速离心技术制备胞浆受体蛋白，改进提取与纯化手段，建立DHCC放射受体分析方法，检测了骨质疏松症患者血样。结果 完成灵敏度、精密度、准确度、稳定性及特异性等方法学技术指标，经分析检测的原发性骨质疏松症患者血清，DHCC含量明显低于正常老年对照组(P<0.05)。结论 DHCC降低是发生骨质疏松症的重要原因之一。
, 百拇医药
Radioreceptor assay for 1,25-Dihydroxy vitamin
D3 in se rum and its application in the study of osteoporosis
Zhang Peiyin,Liu Dacheng Cao Jie et al
Department of Molecular Biology,Norman Bethune
University of Medical Sciences,Ch angchun 130021
Objective To establish a modified radioreceptor assay(RRA ) fo r 1,25-(OH)2-D3(1,25-Dihydroxy-Vitamin D3,1,25-Dihydroxycholecalcifer ol DHCC) and to determine DHCC content in serum of patients with osteoporosis.Methods A hetergeneous radionuclide exchange technique wa s us ed to produce 3 H-DHCC.Cytoplasmic receptor protein was prepared by u ltracentrifu gation.Extraction and purification for DHCC were improved.RRA for DHCC was estab lished,with which to determine DHCC content in serum of patients with osteoporos is.Results A modified RRA technique was established.which ha s high sensitivity,stability accuracy and specificity.DHCC content in serum of pat ients with osteoporosis was lower than that of the control(P<0.05).Conclusions The decrease of DHCC content might be one of the important factors for osteoporosis.
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Key words DHCC RRA Osteoporosis
DHCC不仅作为机体调节骨质代谢的中心环节，其还具有影响激素分泌，促进细胞分化，促进神经生长因子分泌，调节免疫功能的重要作用。而DHCC检测又是进行上述各项研究及诊断多种代谢性骨病的重要手段之一。DHCC在血清中含量甚微(pg/ml水平)，分离手段复杂。国外检测血清DHCC主要是应用放射竞争性结合分析技术，但其操作较为复杂费时，在此基础上我们建立了一种更加简便、灵敏、稳定、精确的DHCC放射性受体检测试剂盒，并应用该检测试剂盒对原发性骨质疏松症进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料 DHCC标准品由Amersham公司购进，3H-DHCC由本课题组标记，采用非均相核素交换法，用钯作催化剂，Sephadex LH-20分离，比活性87ci/mmol(3.2 TBq)。其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。
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1.2 方法
1.2.1 DHCC胞浆蛋白制备 选用2～3.5kg雄性健康家兔(兔龄1年，白求恩医科大学动物部提供)击头部致休克后，2～6 ℃冰溶条件下取出小肠环，剥取粘膜制备匀浆，经高速和超速离心处理制得胞浆受体蛋白，测定其滴度和蛋白浓度后分装，-20 ℃贮藏。
1.2.2 血清维生素D3衍生物的提取 取血清1.0ml加入0.8mlCH2Cl2∶CH3OH(1∶2)溶液旋转混匀，静止5min，4℃1000r/min，离心10min，取上清液加入0.2mol/LKOH和CH2Cl2各2.5ml，充分混匀，静止5min，4℃500r/min，离心10min，重复此步骤。取下层液吹干，置-20℃，可存放15d。
1.2.3 样品纯化 取血清提取物室温下放置30min，取1.5mlHeX∶CHOH∶CHCl3(9∶1∶1)溶液将提取物充分溶解。将SephadexLH-20凝胶介质于层析前24h用上述溶液以10∶1(V/W)的比例充分涨溶后，装入1.5cm×15cm玻璃层析柱中，平衡，将充分溶解的血清提取物上柱，用上述溶液洗脱，流速2ml/min，分离维生素D，25-(OH)D3及DHCC，收集DHCC部分，将其吹干，放置-20℃，可保存3个月。
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1.3 竞争性结合测定
1.3.1 标准曲线的制备 取DHCC标准溶液1支(2.2ng/ml)加入异丙醇20ml，采用倍倍稀释法，浓度依次为每毫升含DHCC110、55、27、13.8、6.9、3.4、1.7pg。
1.3.2 加液程序 总计数管(T)加保温液750μl，空白管(NSB)加保温液550μl，零标准管(B0)加异丙醇50μl，胞浆蛋白500μl，标准管(S)加标准溶液50μl，胞浆蛋白500μl，测定管(U)加样品50μl，胞浆蛋白500μl，各测定管均为双重样。以上各管均加入3H-DHCC25μl，充分混匀，22℃孵育1h。反应结束后除总放射性管外，其余各管分别加入DHCC200μl。充分混匀，22℃孵育30min，4℃1500r/min，离心10min，上清液倒入装有闪烁液的液闪瓶中，放置1h以上，测量放射性强度。
2 结 果
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2.1 DHCC检测技术指标
2.1.1 灵敏度 标准曲线可测范围为1.7～110pg/ml。最小可测值为1.7pg/ml，血清最小用量为1.0ml。
2.1.2 精密度 批内变异(CV)9.2%，批间变异(CV)8.9%，反应误差关系(RER)0.027。
2.1.3 准确性 回收率低剂量组78.2%～82.1%，中剂量组80.2%～83.3%，高剂量组80.8%～84.0%。
2.1.4 稳定性 a∶1.971，b∶0.926，r∶0.972，ED50∶10.549，NSB∶3.4%，B0%∶48.5%。
2.1.5 特异性 以受体蛋白与DHCC结合为100，选择其他几处激素：孕酮、皮质醇、醛固酮、地塞米松以及维生素D3、25-羟维生素D3，其结合率均<1.0%。
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2.2 血清中1，25-(OH)2维生素D3的分离以3H-DHCC为示踪剂，掺入血清样品中，其分离区域如图1。
图1 Sephadex LH-20分离DHCC的层析曲线
2.3 原发性骨质疏松症的检测 共收集女性病例19份年龄50～60岁，患者确认均经脊柱X线拍片，SD-100型单光子骨密度仪测量右前臂中下1/3处桡、尺骨的骨矿物质含量(BMD)明显低于正常，临床表现为腰背痛，部分患者合并有病理性骨折。该组骨质疏松症患者血清中DHCC，含量为27.3±4.2pg/ml；同时测定60例正常老年人(对照组)血清DHCC含量 为60.8±3.8 pg/ml(P<0.05)。
3 讨 论
3.1 DHCC检测方法学 尽管人们对DHCC检测做了大量工作，也推出了比较简化的测试手段与技术，并可提供部分检测试剂，但由于价格昂贵及其他因素均限制了DHCC的检测研究。我们应用正常家兔代替佝偻病鸡制备高活性的受体蛋白，提供了广泛而经济的受体蛋白来源。同时应用SephadexLH-20凝胶层析代替了高效液相层析(HPLC)纯化DHCC，从而使DHCC检测系统简便、快速，建立了一种快速、灵敏、稳定、准确的DHCC检测法。其血清用量仅需1.0ml，检测过程4h内完成，此方法的建立为DHCC的研究带来了极大的方便。
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3.2 已经确认DHCC作用于小肠、肾、骨，促进肠钙、磷吸收，促进肾钙重吸收及促进骨钙释放，从而维持血浆钙、磷平衡。而近年来许多受体研究证明DHCC受体还存在于脑、胰腺、甲状旁腺、垂体等许多器官。DHCC可通过其受体来影响这些器官激素的分泌和细胞内钙的平衡。随着增龄，肝肾功能不断减退，使肝肾羟化酶活力降低，所合成的DHCC也减少，肠道钙、磷的吸收能力下降，从而动用骨钙来维持血钙平衡，这可能是造成骨质疏松的原因之一。实验也证明了骨质疏松症患者血清中DHCC含量明显低于正常组(P<0.05)。DHCC的降低对PTH的分泌有反馈作用，可促进PTH分泌，而PTH的作用是增加骨吸收，同时雌激素分泌的减少增加了骨对PTH的敏感性，更加重了骨钙的减少。许多研究表明原发性骨质疏松与妇女绝经后或老年多种激素变化有关，包括PTH、雌激素、降钙素、甲状腺素、糖皮质激素等。而DHCC对于内分泌的影响表明DHCC降低也是发生骨质疏松症的一个重要因素。
1 国家自然科学基金资助课题(39270700)
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作者简介：张培因，男，45岁，副主任技师
石育原，男，62岁，教授，从事活性D3及其受体与分子骨病学研究
4 参考文献
1 MarlinezJ，Olmos JM，Amado JA et al.1，25 Dihydroxyvitamin D receptors in peripheral blood mononuclear cells from patients with posimenopausal osteoporosis.Bone Miner，1993；23(3)：207
2 李贤慧，石育原.1，25-二羟基维生素D对L细胞神经生长因子诱导作用.生物化学杂志，1995；11(4)：493
3 宋亮年.1，25-二羟基维生素D的免疫调节作用.生物科学进展，1994；25(1)：83
4 Horst RL，Littiedike ET,Riley JL et al.Quantization of Vitamin D and its metabolites and their plasma concentrations in five species of animals.Anal Biochem，1981；116：189
5 江 岩，战 术.老年钙吸收功能减退其机制的研究进展.国外医学.老年医学分册，1996；17(1)：36
〔1998-08-07收稿 1998-11-11修回〕, http://www.100md.com
单位：张培因 曹 杰 石育原(白求恩医科大学分子生物学教研室，长春 130021)；刘大程 王东辉(长春医学高等专科学校)
关键词：1，25二羟基胆钙甾醇；超微量放射受体检测技术；骨质疏松症
中国老年学杂志/990322 摘 要 目的 建立一种改良的血清1，25-(OH)2维生素D3即1，25二羟基胆钙甾醇(1，25-dihydrochole-calciferel，DHCC)超微量放射受体检测技术(RRA)，对原发性骨质疏松症血清的DHCC含量进行检测。方法 用非均相核素交换法制备了3H-DHCC，应用超速离心技术制备胞浆受体蛋白，改进提取与纯化手段，建立DHCC放射受体分析方法，检测了骨质疏松症患者血样。结果 完成灵敏度、精密度、准确度、稳定性及特异性等方法学技术指标，经分析检测的原发性骨质疏松症患者血清，DHCC含量明显低于正常老年对照组(P<0.05)。结论 DHCC降低是发生骨质疏松症的重要原因之一。
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Radioreceptor assay for 1,25-Dihydroxy vitamin
D3 in se rum and its application in the study of osteoporosis
Zhang Peiyin,Liu Dacheng Cao Jie et al
Department of Molecular Biology,Norman Bethune
University of Medical Sciences,Ch angchun 130021
Objective To establish a modified radioreceptor assay(RRA ) fo r 1,25-(OH)2-D3(1,25-Dihydroxy-Vitamin D3,1,25-Dihydroxycholecalcifer ol DHCC) and to determine DHCC content in serum of patients with osteoporosis.Methods A hetergeneous radionuclide exchange technique wa s us ed to produce 3 H-DHCC.Cytoplasmic receptor protein was prepared by u ltracentrifu gation.Extraction and purification for DHCC were improved.RRA for DHCC was estab lished,with which to determine DHCC content in serum of patients with osteoporos is.Results A modified RRA technique was established.which ha s high sensitivity,stability accuracy and specificity.DHCC content in serum of pat ients with osteoporosis was lower than that of the control(P<0.05).Conclusions The decrease of DHCC content might be one of the important factors for osteoporosis.
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Key words DHCC RRA Osteoporosis
DHCC不仅作为机体调节骨质代谢的中心环节，其还具有影响激素分泌，促进细胞分化，促进神经生长因子分泌，调节免疫功能的重要作用。而DHCC检测又是进行上述各项研究及诊断多种代谢性骨病的重要手段之一。DHCC在血清中含量甚微(pg/ml水平)，分离手段复杂。国外检测血清DHCC主要是应用放射竞争性结合分析技术，但其操作较为复杂费时，在此基础上我们建立了一种更加简便、灵敏、稳定、精确的DHCC放射性受体检测试剂盒，并应用该检测试剂盒对原发性骨质疏松症进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料 DHCC标准品由Amersham公司购进，3H-DHCC由本课题组标记，采用非均相核素交换法，用钯作催化剂，Sephadex LH-20分离，比活性87ci/mmol(3.2 TBq)。其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。
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1.2 方法
1.2.1 DHCC胞浆蛋白制备 选用2～3.5kg雄性健康家兔(兔龄1年，白求恩医科大学动物部提供)击头部致休克后，2～6 ℃冰溶条件下取出小肠环，剥取粘膜制备匀浆，经高速和超速离心处理制得胞浆受体蛋白，测定其滴度和蛋白浓度后分装，-20 ℃贮藏。
1.2.2 血清维生素D3衍生物的提取 取血清1.0ml加入0.8mlCH2Cl2∶CH3OH(1∶2)溶液旋转混匀，静止5min，4℃1000r/min，离心10min，取上清液加入0.2mol/LKOH和CH2Cl2各2.5ml，充分混匀，静止5min，4℃500r/min，离心10min，重复此步骤。取下层液吹干，置-20℃，可存放15d。
1.2.3 样品纯化 取血清提取物室温下放置30min，取1.5mlHeX∶CHOH∶CHCl3(9∶1∶1)溶液将提取物充分溶解。将SephadexLH-20凝胶介质于层析前24h用上述溶液以10∶1(V/W)的比例充分涨溶后，装入1.5cm×15cm玻璃层析柱中，平衡，将充分溶解的血清提取物上柱，用上述溶液洗脱，流速2ml/min，分离维生素D，25-(OH)D3及DHCC，收集DHCC部分，将其吹干，放置-20℃，可保存3个月。
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1.3 竞争性结合测定
1.3.1 标准曲线的制备 取DHCC标准溶液1支(2.2ng/ml)加入异丙醇20ml，采用倍倍稀释法，浓度依次为每毫升含DHCC110、55、27、13.8、6.9、3.4、1.7pg。
1.3.2 加液程序 总计数管(T)加保温液750μl，空白管(NSB)加保温液550μl，零标准管(B0)加异丙醇50μl，胞浆蛋白500μl，标准管(S)加标准溶液50μl，胞浆蛋白500μl，测定管(U)加样品50μl，胞浆蛋白500μl，各测定管均为双重样。以上各管均加入3H-DHCC25μl，充分混匀，22℃孵育1h。反应结束后除总放射性管外，其余各管分别加入DHCC200μl。充分混匀，22℃孵育30min，4℃1500r/min，离心10min，上清液倒入装有闪烁液的液闪瓶中，放置1h以上，测量放射性强度。
2 结 果
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2.1 DHCC检测技术指标
2.1.1 灵敏度 标准曲线可测范围为1.7～110pg/ml。最小可测值为1.7pg/ml，血清最小用量为1.0ml。
2.1.2 精密度 批内变异(CV)9.2%，批间变异(CV)8.9%，反应误差关系(RER)0.027。
2.1.3 准确性 回收率低剂量组78.2%～82.1%，中剂量组80.2%～83.3%，高剂量组80.8%～84.0%。
2.1.4 稳定性 a∶1.971，b∶0.926，r∶0.972，ED50∶10.549，NSB∶3.4%，B0%∶48.5%。
2.1.5 特异性 以受体蛋白与DHCC结合为100，选择其他几处激素：孕酮、皮质醇、醛固酮、地塞米松以及维生素D3、25-羟维生素D3，其结合率均<1.0%。
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2.2 血清中1，25-(OH)2维生素D3的分离以3H-DHCC为示踪剂，掺入血清样品中，其分离区域如图1。
图1 Sephadex LH-20分离DHCC的层析曲线
2.3 原发性骨质疏松症的检测 共收集女性病例19份年龄50～60岁，患者确认均经脊柱X线拍片，SD-100型单光子骨密度仪测量右前臂中下1/3处桡、尺骨的骨矿物质含量(BMD)明显低于正常，临床表现为腰背痛，部分患者合并有病理性骨折。该组骨质疏松症患者血清中DHCC，含量为27.3±4.2pg/ml；同时测定60例正常老年人(对照组)血清DHCC含量 为60.8±3.8 pg/ml(P<0.05)。
3 讨 论
3.1 DHCC检测方法学 尽管人们对DHCC检测做了大量工作，也推出了比较简化的测试手段与技术，并可提供部分检测试剂，但由于价格昂贵及其他因素均限制了DHCC的检测研究。我们应用正常家兔代替佝偻病鸡制备高活性的受体蛋白，提供了广泛而经济的受体蛋白来源。同时应用SephadexLH-20凝胶层析代替了高效液相层析(HPLC)纯化DHCC，从而使DHCC检测系统简便、快速，建立了一种快速、灵敏、稳定、准确的DHCC检测法。其血清用量仅需1.0ml，检测过程4h内完成，此方法的建立为DHCC的研究带来了极大的方便。
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3.2 已经确认DHCC作用于小肠、肾、骨，促进肠钙、磷吸收，促进肾钙重吸收及促进骨钙释放，从而维持血浆钙、磷平衡。而近年来许多受体研究证明DHCC受体还存在于脑、胰腺、甲状旁腺、垂体等许多器官。DHCC可通过其受体来影响这些器官激素的分泌和细胞内钙的平衡。随着增龄，肝肾功能不断减退，使肝肾羟化酶活力降低，所合成的DHCC也减少，肠道钙、磷的吸收能力下降，从而动用骨钙来维持血钙平衡，这可能是造成骨质疏松的原因之一。实验也证明了骨质疏松症患者血清中DHCC含量明显低于正常组(P<0.05)。DHCC的降低对PTH的分泌有反馈作用，可促进PTH分泌，而PTH的作用是增加骨吸收，同时雌激素分泌的减少增加了骨对PTH的敏感性，更加重了骨钙的减少。许多研究表明原发性骨质疏松与妇女绝经后或老年多种激素变化有关，包括PTH、雌激素、降钙素、甲状腺素、糖皮质激素等。而DHCC对于内分泌的影响表明DHCC降低也是发生骨质疏松症的一个重要因素。
1 国家自然科学基金资助课题(39270700)
, 百拇医药
作者简介：张培因，男，45岁，副主任技师
石育原，男，62岁，教授，从事活性D3及其受体与分子骨病学研究
4 参考文献
1 MarlinezJ，Olmos JM，Amado JA et al.1，25 Dihydroxyvitamin D receptors in peripheral blood mononuclear cells from patients with posimenopausal osteoporosis.Bone Miner，1993；23(3)：207
2 李贤慧，石育原.1，25-二羟基维生素D对L细胞神经生长因子诱导作用.生物化学杂志，1995；11(4)：493
3 宋亮年.1，25-二羟基维生素D的免疫调节作用.生物科学进展，1994；25(1)：83
4 Horst RL，Littiedike ET,Riley JL et al.Quantization of Vitamin D and its metabolites and their plasma concentrations in five species of animals.Anal Biochem，1981；116：189
5 江 岩，战 术.老年钙吸收功能减退其机制的研究进展.国外医学.老年医学分册，1996；17(1)：36
〔1998-08-07收稿 1998-11-11修回〕, http://www.100md.com