葱浸膏及其化合物对培养心肌细胞的作用
作者：赵怀清 难波恒雄
单位：沈阳药科大学基础部(赵怀清)；日本富山医科药科大学和汉药研究所(难波恒雄)
关键词：培养心肌细胞；自发性心率；葱；含硫化合物
沈阳药科大学学报990411 摘 要 利用图象分析系统考察了葱(Allium victorialis L.)浸膏及其成分对小鼠胎仔培养心肌细胞作用.结果表明，挥发性提取物对培养心肌细胞心率和振幅有明显的增强作用，而甲醇和水提取物对两者均无影响.从具有生物活性的挥发性提取物中分离得到的二甲基二硫、烯丙基甲基三硫、烯丙基甲基硫醚和二烯丙基二硫对培养心肌细胞心率和振幅均有不同程度的增强作用，而不含硫的2-戊酮则没有作用.
分类号 R962
Effects of an Allium Victorialis Extract and Its Constituents on the Rate and Amplitude of Beating of Cultured Myocardial Cell Sheets
, 百拇医药
Zhao Huaiqing,Tsuneo Namba
Department of Basic Courses，Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract Effects of various cardioactive agents and the extract and their constituents of caucas (Allium victorialis L.)on periodic beating of cultured myocardial cells were examined by using the image analyzing system.The volatile extracts of caucas increased both the beating rate and the beating amplitude,whereas,water and methanol extracts of caucas did not affect them.By the bio-assay directed fractionation of the volative constituents.dimethyl disulfide,allyl methyl trisulfide,allyl methyl sulfide and diallyl disulfide were found to increase the beating rate and beating amplitude in a standard medium,but the compund 2-pentanone without sulfide did not affect either of them.
, 百拇医药
Key words cultured myocardial cell;spontaneous beating;Allium victorialis L.;sulfur compounds
长期以来，治疗心脏功能不全，主要使用钠泵抑制剂毛地黄和β-受体部分激动剂扎莫特罗等，而这些药物常常会引起心律失常等副作用，所以，开发新的心功能不全治疗药物是十分必要的.葱(Allium victorialis L.)是百合科葱属植物，分布于日本寒冷的北海道地区.自古以来，除了为人们所食用外，还把它作为一种珍贵的药草而广泛利用.葱具有一种强烈的刺激性气味，其主要成分为含硫化合物〔1～4〕，具有抗血小板聚集作用〔5～7〕.除此之外，还具有减少中性脂肪，预防感冒，滋补强壮等功能.为了寻找其新的药效及功能，作者以培养小鼠心肌细胞作为动物实验模型，对日本产葱进行了研究.
1 材料
, http://www.100md.com
Eagle's MEM (minimal essential medium)由日本日水制药株式会社购入.FBS(fetal bovine serum)由Whittaker M.A.Biopfrofucts Inc.购入；HEPES(N-2-hydroxyethyl-piperadine-N′-2-ethane sulfonic acid)由日本同仁化学研究所购入；其它化学试剂由和光纯药株式会社、半井株式会社购入，均为优级试剂.葱新鲜叶由日本北海道バイオ技术研究所提供.实验动物为妊娠约14～16日的ICR小鼠，日本静冈县实验动物农业协同组提供.
2 方法与结果
2.1 心肌细胞的培养
根据五岛〔8〕制备心肌细胞方法，将妊娠14～16日ICR小鼠的胎仔心脏取出，放入0.125%胰蛋白酶-0.025%胶原酶的混合液中，在37℃的恒温水浴中振荡10 min，加入含有10%胎牛血清的Eagle's MEM培养液，离心(4℃，2 000 r/min，10 min).去除上清液，按照Polinger〔9〕方法除去成纤维细胞，然后将其分散于涂有纤维连接素的载玻片上，放入35 mm塑料培养皿中，置于37℃、95%空气-5%CO2饱和水蒸汽的培养箱中，经48 h培养，待测定.
, 百拇医药
2.2 心肌细胞心率和振幅的测定
心肌细胞的心率和振幅的测定是根据黄圣伦等人〔10〕方法进行的.将附着心肌细胞的载玻片细胞面向下，置于带有洞穴的丙烯酸酯板上(洞穴中充满含有胎牛血清的HEPES溶液)，使其稳定5 min后开始测定.首先测定空白溶液(含有1%DMSO的标准培养基)的心率，在相同条件下再测定对照品及样品的心率.测定是在37℃恒温倒立位相差式显微镜(olympus IMT-Z)下，通过内藏摄像机成像转变成电信号而检出.其数值通过计算机(NEC PC-9801VM)处理，根据1 min跳动次数、跳动时间的平均值及偏差值〔(140±15)/min,n=9〕求得.
振幅的测定是将显微镜观察到的心率情况，经内藏摄像机(olympus FCD-10)摄像后直接转录到录放机(National AC-6300)上，将其画面显示于图像监视器(NEC PC-KD854)，通过连有计算机(NEC PC-9801)的图象分析器(PIAS LA-500)进行画像解析.选择细胞群的录相画面中高亮度的3个点，记录各点的周期性(0.07 s间隔)跳动情况.一定时间内的振幅是根据测定波动图的峰高度来计算的.投药后相对的心率或振幅按：投药后一定时间内心率或振幅/投药前的心率或振幅×100%计算.
, 百拇医药
2.3 结果
以1%DMSO为空白、去甲肾上腺素为阳性对照的条件下，分别对葱的甲醇、水提取物及挥发油进行测定.在5～20 min间隔的测定中，去甲肾上腺素对心率和振幅有明显的增强作用，葱的甲醇和水提取物均无变化，而挥发油对心率和振幅均有明显的增加.
为寻找挥发油中的有效成分，将挥发油进行分离，并对其中5种化合物培养心肌细胞的作用进行考察.结果表明，化合物二甲基二硫、烯丙基甲基三硫、烯丙基甲基硫醚及二烯丙基二硫对培养的心肌细胞的心率和振幅均有明显的增强作用.其中，化合物二甲基二硫在5、10 min的时候，心率明显增加，而到20 min后又趋于正常.化合物烯丙基甲基三硫在15 min后心率明显增强.而化合物2-戊酮在各个测定周期均无显著性差异(见表1).为进一步考察化合物2-戊酮对心肌细胞的作用情况，加大浓度(1 mmol/L)，再次测定，仍无显著性差异.
3 讨论
, http://www.100md.com
心脏的功能通过心肌收缩与舒张使血液循环，而这个过程受体内各种因素相互影响.例如：心率和振幅、心肌收缩性、主动脉压力、末梢血管阻力、自主神经系统与内分泌系统等.这些影响因素与心脏功能之间的关系应该进行不同的分析.作者基于心脏是通过反复地收缩和舒张使血液泵出，在体内进行循环的这一事实，将葱浸膏及其化合物对心输出量的两个主要影响因素——心率和振幅的作用进行了研究.
实验结果表明，葱的甲醇和水的提取物对心率和振幅没有影响，而挥发油对两者均有明显增强作用.由挥发油中分离得到的化合物，其作用情况也存在着差异.化合物2-戊酮没有引起心率和振幅的变化，而化合物二甲基二硫、烯丙基甲基三硫、烯丙基甲基硫醚及二烯丙基二硫对心率和振幅均有不同程度的增加作用.
至今为止，有许多中药一直用于治疗心脏病，但大多数还没有用现代的科学技术进行彻底评估.培养心肌细胞系统作为体外生物测定系统是十分适合的，因为它采用最新的心脏分析手段，使用图象分析器来测定振幅的变化情况，其变化与单一心肌收缩和舒张的情况紧密相关的.从而可以认为，葱浸膏及其化合物对培养心肌细胞的作用可以反映出对整个心脏的作用情况.因此，可以借助于这个方法对许多中药提取物及其大量的化合物进行考察，并从中筛选出更加有效的单一成分，为开发用于心脏病治疗的新药提供一个新途径.
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Tab.1 Effects of the compounds from Allium Victorialis on the rate
and amplitude of beating of cultured myocardial cell sheets Compounds
Time after addition/min
Beating rate/%
Beating amplitude/%
Control
5
99.8±2.6
100.2±3.0
, http://www.100md.com
10
98.2±1.8
98.7±2.5
15
98.5±1.5
99.5±2.7
20
98.6±2.7
101.3±1.9
CH3COCH=CHCH3
5
100.1±1.5
, 百拇医药
99.2±3.0
10
97.3±2.6
96.8±3.2
15
99.2±2.6
98.5±1.5
20
102.5±3.1
98.9±1.8
CH3SSCH3
5
, 百拇医药
117.9±1.5* *
115.6±2.0* *
10
119.2±3.2* *
117.2±1.8*
15
115.4±2.6*
115.9±3.0*
20
100.2±2.8
, 百拇医药
100.2±2.9
CH3SSSCH2CH=CH2
5
116.5±4.2* *
114.3±2.6* *
10
116.6±3.8* *
117.5±1.5*
15
118.5±1.3* * *
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119.2±3.7* *
20
116.6±3.6* * *
118.8±3.4* *
CH3SCH2CH=CH2
5
109.5±5.5*
102.5±3.5
10
113.8±2.4*
, 百拇医药
104.8±2.7
15
117.2±3.7* *
118.4±3.2*
20
115.8±3.5* *
114.7±3.6*
CH2=CHCH2SSCH2CH=CH2
5
113.8±2.1*
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108.5±3.1
10
115.2±3.9*
110.0±5.2
15
118.5±1.9* *
117.4±3.5*
20
112.6±2.4
116.0±2.8*
Values are expressed as mean±S.E.Significantly different from control:.P<0.04，. .P<0.01，. . .P<0.001
, 百拇医药
参考文献
1 Nishimura H,Fujiwara K,Mizutani J.et al.Volatile flavor components of caucas.J Agric Food Chem,1971,19:992～994
2 Akashi K,Nishimura H,Mizutani J.Precursors and enzymatic development of caucas flavor components.Agric Biol CHem,1975,39:1507～1509
3 水谷纯也，田原哲士，西村弘行.ネギ属植物のフレ一バ一.化学と生物，1979，17：814～820
4 Nishimura H,Hanny Wijaya C,Mizutani J.Volatile flavor components and antithrombic agents:Vinyldithiins from Allium victorialis L.J Argic Food Chem,1988,36(3):563～566
, 百拇医药
5 Apitz Castro R,Escalante J,Vargas R M.et al.Ajoene,the antiplatelet principle of garlic,synergistically potentiates the antiaggregatory action of prostasycin Foskolin,Indomethacin and dypiridamole on human platelets.Thromb Res,1986,42:303～305
6 Block E,Ahmd S,K Jain M,et al.(E.Z)-Ajoene:A potent antithrombotic agent from garlic.J Am Chem Soc,1984,106:8295～8300
7 Block E,Ahmad S,Catalfamo J L,et al.Antithrombotic organosulfur compounds from garlic:structural,mechanistic and synthetic studies.J Am Chem Soc,1986,108:7045～7048
, http://www.100md.com
8 五岛喜与太.培养心筋细胞的搏动.科学，1974，44：475～481
9 Polinger I S.Sepapration of cell types in embryonic heart cell cultures.Exp Cell Res,1970,63:78～81
10 Huang S L,Kakiuchi N,Hattori M.et al.A new monitoring system of cultured myocardial cell motion:Effect of pilose anther extract and cardioactive agents on spontaneous beating of myocardiol cell shects.Chem Pharm Bull,1991,39:384～386
收稿日期:1998-11-25, 百拇医药
单位：沈阳药科大学基础部(赵怀清)；日本富山医科药科大学和汉药研究所(难波恒雄)
关键词：培养心肌细胞；自发性心率；葱；含硫化合物
沈阳药科大学学报990411 摘 要 利用图象分析系统考察了葱(Allium victorialis L.)浸膏及其成分对小鼠胎仔培养心肌细胞作用.结果表明，挥发性提取物对培养心肌细胞心率和振幅有明显的增强作用，而甲醇和水提取物对两者均无影响.从具有生物活性的挥发性提取物中分离得到的二甲基二硫、烯丙基甲基三硫、烯丙基甲基硫醚和二烯丙基二硫对培养心肌细胞心率和振幅均有不同程度的增强作用，而不含硫的2-戊酮则没有作用.
分类号 R962
Effects of an Allium Victorialis Extract and Its Constituents on the Rate and Amplitude of Beating of Cultured Myocardial Cell Sheets
, 百拇医药
Zhao Huaiqing,Tsuneo Namba
Department of Basic Courses，Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract Effects of various cardioactive agents and the extract and their constituents of caucas (Allium victorialis L.)on periodic beating of cultured myocardial cells were examined by using the image analyzing system.The volatile extracts of caucas increased both the beating rate and the beating amplitude,whereas,water and methanol extracts of caucas did not affect them.By the bio-assay directed fractionation of the volative constituents.dimethyl disulfide,allyl methyl trisulfide,allyl methyl sulfide and diallyl disulfide were found to increase the beating rate and beating amplitude in a standard medium,but the compund 2-pentanone without sulfide did not affect either of them.
, 百拇医药
Key words cultured myocardial cell;spontaneous beating;Allium victorialis L.;sulfur compounds
长期以来，治疗心脏功能不全，主要使用钠泵抑制剂毛地黄和β-受体部分激动剂扎莫特罗等，而这些药物常常会引起心律失常等副作用，所以，开发新的心功能不全治疗药物是十分必要的.葱(Allium victorialis L.)是百合科葱属植物，分布于日本寒冷的北海道地区.自古以来，除了为人们所食用外，还把它作为一种珍贵的药草而广泛利用.葱具有一种强烈的刺激性气味，其主要成分为含硫化合物〔1～4〕，具有抗血小板聚集作用〔5～7〕.除此之外，还具有减少中性脂肪，预防感冒，滋补强壮等功能.为了寻找其新的药效及功能，作者以培养小鼠心肌细胞作为动物实验模型，对日本产葱进行了研究.
1 材料
, http://www.100md.com
Eagle's MEM (minimal essential medium)由日本日水制药株式会社购入.FBS(fetal bovine serum)由Whittaker M.A.Biopfrofucts Inc.购入；HEPES(N-2-hydroxyethyl-piperadine-N′-2-ethane sulfonic acid)由日本同仁化学研究所购入；其它化学试剂由和光纯药株式会社、半井株式会社购入，均为优级试剂.葱新鲜叶由日本北海道バイオ技术研究所提供.实验动物为妊娠约14～16日的ICR小鼠，日本静冈县实验动物农业协同组提供.
2 方法与结果
2.1 心肌细胞的培养
根据五岛〔8〕制备心肌细胞方法，将妊娠14～16日ICR小鼠的胎仔心脏取出，放入0.125%胰蛋白酶-0.025%胶原酶的混合液中，在37℃的恒温水浴中振荡10 min，加入含有10%胎牛血清的Eagle's MEM培养液，离心(4℃，2 000 r/min，10 min).去除上清液，按照Polinger〔9〕方法除去成纤维细胞，然后将其分散于涂有纤维连接素的载玻片上，放入35 mm塑料培养皿中，置于37℃、95%空气-5%CO2饱和水蒸汽的培养箱中，经48 h培养，待测定.
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2.2 心肌细胞心率和振幅的测定
心肌细胞的心率和振幅的测定是根据黄圣伦等人〔10〕方法进行的.将附着心肌细胞的载玻片细胞面向下，置于带有洞穴的丙烯酸酯板上(洞穴中充满含有胎牛血清的HEPES溶液)，使其稳定5 min后开始测定.首先测定空白溶液(含有1%DMSO的标准培养基)的心率，在相同条件下再测定对照品及样品的心率.测定是在37℃恒温倒立位相差式显微镜(olympus IMT-Z)下，通过内藏摄像机成像转变成电信号而检出.其数值通过计算机(NEC PC-9801VM)处理，根据1 min跳动次数、跳动时间的平均值及偏差值〔(140±15)/min,n=9〕求得.
振幅的测定是将显微镜观察到的心率情况，经内藏摄像机(olympus FCD-10)摄像后直接转录到录放机(National AC-6300)上，将其画面显示于图像监视器(NEC PC-KD854)，通过连有计算机(NEC PC-9801)的图象分析器(PIAS LA-500)进行画像解析.选择细胞群的录相画面中高亮度的3个点，记录各点的周期性(0.07 s间隔)跳动情况.一定时间内的振幅是根据测定波动图的峰高度来计算的.投药后相对的心率或振幅按：投药后一定时间内心率或振幅/投药前的心率或振幅×100%计算.
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2.3 结果
以1%DMSO为空白、去甲肾上腺素为阳性对照的条件下，分别对葱的甲醇、水提取物及挥发油进行测定.在5～20 min间隔的测定中，去甲肾上腺素对心率和振幅有明显的增强作用，葱的甲醇和水提取物均无变化，而挥发油对心率和振幅均有明显的增加.
为寻找挥发油中的有效成分，将挥发油进行分离，并对其中5种化合物培养心肌细胞的作用进行考察.结果表明，化合物二甲基二硫、烯丙基甲基三硫、烯丙基甲基硫醚及二烯丙基二硫对培养的心肌细胞的心率和振幅均有明显的增强作用.其中，化合物二甲基二硫在5、10 min的时候，心率明显增加，而到20 min后又趋于正常.化合物烯丙基甲基三硫在15 min后心率明显增强.而化合物2-戊酮在各个测定周期均无显著性差异(见表1).为进一步考察化合物2-戊酮对心肌细胞的作用情况，加大浓度(1 mmol/L)，再次测定，仍无显著性差异.
3 讨论
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心脏的功能通过心肌收缩与舒张使血液循环，而这个过程受体内各种因素相互影响.例如：心率和振幅、心肌收缩性、主动脉压力、末梢血管阻力、自主神经系统与内分泌系统等.这些影响因素与心脏功能之间的关系应该进行不同的分析.作者基于心脏是通过反复地收缩和舒张使血液泵出，在体内进行循环的这一事实，将葱浸膏及其化合物对心输出量的两个主要影响因素——心率和振幅的作用进行了研究.
实验结果表明，葱的甲醇和水的提取物对心率和振幅没有影响，而挥发油对两者均有明显增强作用.由挥发油中分离得到的化合物，其作用情况也存在着差异.化合物2-戊酮没有引起心率和振幅的变化，而化合物二甲基二硫、烯丙基甲基三硫、烯丙基甲基硫醚及二烯丙基二硫对心率和振幅均有不同程度的增加作用.
至今为止，有许多中药一直用于治疗心脏病，但大多数还没有用现代的科学技术进行彻底评估.培养心肌细胞系统作为体外生物测定系统是十分适合的，因为它采用最新的心脏分析手段，使用图象分析器来测定振幅的变化情况，其变化与单一心肌收缩和舒张的情况紧密相关的.从而可以认为，葱浸膏及其化合物对培养心肌细胞的作用可以反映出对整个心脏的作用情况.因此，可以借助于这个方法对许多中药提取物及其大量的化合物进行考察，并从中筛选出更加有效的单一成分，为开发用于心脏病治疗的新药提供一个新途径.
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Tab.1 Effects of the compounds from Allium Victorialis on the rate
and amplitude of beating of cultured myocardial cell sheets Compounds
Time after addition/min
Beating rate/%
Beating amplitude/%
Control
5
99.8±2.6
100.2±3.0
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10
98.2±1.8
98.7±2.5
15
98.5±1.5
99.5±2.7
20
98.6±2.7
101.3±1.9
CH3COCH=CHCH3
5
100.1±1.5
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99.2±3.0
10
97.3±2.6
96.8±3.2
15
99.2±2.6
98.5±1.5
20
102.5±3.1
98.9±1.8
CH3SSCH3
5
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117.9±1.5* *
115.6±2.0* *
10
119.2±3.2* *
117.2±1.8*
15
115.4±2.6*
115.9±3.0*
20
100.2±2.8
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100.2±2.9
CH3SSSCH2CH=CH2
5
116.5±4.2* *
114.3±2.6* *
10
116.6±3.8* *
117.5±1.5*
15
118.5±1.3* * *
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119.2±3.7* *
20
116.6±3.6* * *
118.8±3.4* *
CH3SCH2CH=CH2
5
109.5±5.5*
102.5±3.5
10
113.8±2.4*
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104.8±2.7
15
117.2±3.7* *
118.4±3.2*
20
115.8±3.5* *
114.7±3.6*
CH2=CHCH2SSCH2CH=CH2
5
113.8±2.1*
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108.5±3.1
10
115.2±3.9*
110.0±5.2
15
118.5±1.9* *
117.4±3.5*
20
112.6±2.4
116.0±2.8*
Values are expressed as mean±S.E.Significantly different from control:.P<0.04，. .P<0.01，. . .P<0.001
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参考文献
1 Nishimura H,Fujiwara K,Mizutani J.et al.Volatile flavor components of caucas.J Agric Food Chem,1971,19:992～994
2 Akashi K,Nishimura H,Mizutani J.Precursors and enzymatic development of caucas flavor components.Agric Biol CHem,1975,39:1507～1509
3 水谷纯也，田原哲士，西村弘行.ネギ属植物のフレ一バ一.化学と生物，1979，17：814～820
4 Nishimura H,Hanny Wijaya C,Mizutani J.Volatile flavor components and antithrombic agents:Vinyldithiins from Allium victorialis L.J Argic Food Chem,1988,36(3):563～566
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5 Apitz Castro R,Escalante J,Vargas R M.et al.Ajoene,the antiplatelet principle of garlic,synergistically potentiates the antiaggregatory action of prostasycin Foskolin,Indomethacin and dypiridamole on human platelets.Thromb Res,1986,42:303～305
6 Block E,Ahmd S,K Jain M,et al.(E.Z)-Ajoene:A potent antithrombotic agent from garlic.J Am Chem Soc,1984,106:8295～8300
7 Block E,Ahmad S,Catalfamo J L,et al.Antithrombotic organosulfur compounds from garlic:structural,mechanistic and synthetic studies.J Am Chem Soc,1986,108:7045～7048
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8 五岛喜与太.培养心筋细胞的搏动.科学，1974，44：475～481
9 Polinger I S.Sepapration of cell types in embryonic heart cell cultures.Exp Cell Res,1970,63:78～81
10 Huang S L,Kakiuchi N,Hattori M.et al.A new monitoring system of cultured myocardial cell motion:Effect of pilose anther extract and cardioactive agents on spontaneous beating of myocardiol cell shects.Chem Pharm Bull,1991,39:384～386
收稿日期:1998-11-25, 百拇医药