β-榄香烯抑制大鼠血栓形成及其机理研究
作者：陆 群 朱路佳 谢梅林 顾振纶
单位：苏州 215007 苏州中药研究所
关键词：β-榄香烯；血栓形成；血栓素A2；血小板聚集
中国现代应用药学990405 摘要 目的：探讨β-榄香烯(β-elemene，β-Ele)的抗血栓作用及其机理。方法：采用血栓法观察了大鼠口服β-Ele 40～160mg/kg/d 10d后对血栓形成的影响,采用比浊法和放免法分别测定其抗血小板聚集性和TXA2及PGI2的含量。结果：β-Ele能明显抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成，同时可明显抑制ADP、凝血酶和花生四烯酸诱导的血小板聚集及抑制凝血酶诱导的血小板TXA2释放，但对大鼠动脉壁中的PGI2无明显影响。结论：β-Ele抗血栓作用与其抑制血小板聚集和释放TXA2有关。
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Inhibitory effect of β-elemene on thrombosis and its mechanism in rats
Lu Qun(Lu Q),Zhu Lujia(Zhu LJ),Xie Meilin(Xie ML),et al(Suzhou Institute of Chinese Materia Medica,Suzhou 215007)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate the inhibitory action and mechanism of β-elemene(β-Ele) on thrombosis.METHOD:Male rats were treated with β-Ele 40～160 mg/kg.d-1 for 10 days,and effects of β-Ele on rat thrombosis,blood platelet aggregation and its releasing product(Thromboxane A2,TXA2),and prostacyclin(PGI2) in vessel wall were observed.RESULTS:β-Ele obviously reduced the weight of thrombus,with simultaneous inhibition of platelet aggregation induced by ADP,thrombin,arachidonic acid(AA) and its releasing reaction triggered by thrombin.The level of PGI2 in vessel wall was changed/little compared with the vehicle group.CONCLUSION:Antithrombotic effect of β-Ele was related to platelet aggregation inhibition and TXA2 release.
, 百拇医药
KEY WORDS β-Elemene,thrombosis,thromboxane A2,platelet aggregation
β-榄香烯(β-elemene,β-Ele)是从中药温莪术(Rhizoma cuzcumae)中提取的有效抗癌成分[1]。最近，实验研究发现它具有抗血栓和活血化瘀作用[2，3]，但其作用机理尚未明了，本文采用预先体内给药方法，观察β-Ele对大鼠动静脉旁路血栓形成、血小板聚集及对血栓素A2(TXA2)和前列环素PGI2生成的影响，为临床用于防治血栓栓塞性疾病提供可靠的实验依据。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂
β-Ele(大连金港制药有限公司，含量92.0%，批号970325)，使用时以食用色拉油配成所需浓度；阿斯匹林(aspirin)和花生四烯酸(AA)(Sigma公司)；凝血酶(珠海经济特区生物化学制药厂)；二磷酸腺苷(ADP)(中国科学院上海生物化学研究所)；125I-6-酮-前列腺素F1α(125I-6-Keto-PGF1α)和125I-血栓素B2(TXB2)放免测定试剂盒(苏州医学院血栓与止血研究室)，其余试剂均为国产分析纯。
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1.2动物
♂Sprague-Dawley大鼠(苏州医学院实验动物中心)。
1.3 仪器
智能血液凝集仪，TYXN-91型(上海通用机电技术研究所)。
1.4 动-静脉旁路血栓形成实验
大鼠60只，体重(350±20)g，随机分为6组，即生理盐水组，溶媒组，β-Ele小剂量组(40mg/kg/d)、中剂量组(80mg/kg/d)、大剂量组(160mg/kg/d)和阿斯匹林组(20mg/kg/d)。每组10只，每天口服给药一次，连续10d后以戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg,ip)，按文献[4]方法，分离右颈总动脉与左颈外静脉，用聚乙烯管(管内置有定量丝线)一端插入左颈外静脉后，聚乙烯管内准确注入肝素(50U/ml)抗凝，再将另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹开放血流15min后，迅速取出丝线称重，血栓重量=总重量-丝线重量。
, 百拇医药
1.5血小板聚集及TXB2测定
♂SD大鼠60只，体重(270.0±25.0)g，分组及给药方法同前，由腹主动脉取血后按本室常法[5]制备血小板悬液或富血小板血浆(PRP)，将悬液或PRP中血小板数调整为3×1011/L，用改良Born[6]比浊法加以改进测定血小板聚集性。取200μl血小板悬液或PRP，37℃温育5min后，加入200μmol/L的ADP 3μl或10U/ml的凝血酶1μl或10g/L AA 2μl后，描记5min血小板聚集曲线。聚集抑制率按下列公式计算：血小板聚集抑制率(%)=(对照组最大聚集率-给药组最大聚集率/对照组最大聚集率)×100%。
将上述凝血酶诱导血小板聚集管中迅速加入消炎痛终止反应[7]，另取未加诱导剂的空白血小板悬液200μl，同时离心后取上清液用放免法测定血小板释放的TXB2含量。
, 百拇医药
1.6 大鼠主动脉环125I-6-酮-PGF1α测定
上述动物取血后迅速剪下胸主动脉，置冷生理盐水中去除周围结缔组织及脂肪，切成约2～3mm小段，按10mg组织加1ml生理盐水后制成匀浆，37℃温育0.5h后，置冰浴中终止反应，取上清液按放免药盒说明测定125I-6-酮-PGF1α含量。
1.7 统计方法
实验数据均以x±s表示，组间比较采用t检验。
2 实验结果
2.1 β-Ele对动-静脉旁路血栓形成的影响
β-Ele体内给药40～160 mg/kg/d能明显抑制动-静脉血栓形成，抑制率达到30.8%～47.4%，与生理盐水组和溶媒组相比，差异非常显著(P<0.01)，见表1。
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2.2 β-Ele对ADP、凝血酶和AA诱导血小板聚集的影响
如表2所示，大鼠连续口服β-Ele(40～160mg/kg/d)10d后，对ADP、凝血酶和AA诱导的血小板聚集均有明显的抑制作用，且随着剂量增加，抑制作用有所增强，与溶媒组相比，差异均非常显著(P<0.01)。
表1 大鼠口服β-Ele 10d后对血栓形成的影响(n=10，x±s) 组 别
剂量(mg/kg/d)
血栓湿重(mg)
抑制率(%)
生理盐水组
25.3±6.7
, http://www.100md.com 溶媒组
28.8±8.6
β-Ele
40
17.5±4.1*
30.8
80
15.1±4.0*
40.3
160
13.3±3.6*
47.4
, http://www.100md.com
阿斯匹林组
20
16.3±3.2*
35.6
注：与溶媒组相比较，*P<0.01
2.3 β-Ele对主动脉壁PGI2和血小板释放TXB2影响
表3显示，大鼠体内给予β-Ele(160 mg/kg/d)10d可明显抑制血小板TXB2的释放，与溶媒组相比，差异显著(P<0.05)，而对胸主动脉壁6-酮-PGF1α生成虽有增加趋势，但无显著影响。
3 讨 论
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本研究结果表明，大鼠服用β-Ele后，可剂量依赖性地使血栓形成减少，并可显著抑制ADP、凝血酶和表2 大鼠口服β-Ele 10d后对血小板聚集的影响(n=10，x±s)AA诱导的血小板聚集，提示β-Ele可通过抑制血小板聚集而抑制血栓形成，且其抑制血小板聚集的途径是多方面的。业已表明，血小板在血栓形成中发挥着十分重要的作用，但血小板功能又受TXA2和PGI2的调控[8]。TXA2是血小板激活剂，它是目前已知最强的血小板聚集剂之一。而PGI2是血小板功能的抑制剂，它与TXA2的作用相反，它们两者之间的平衡对控制正常的止血机制，防止血栓形成是极为重要的。血管内皮细胞的PGI2合成酶能利用附近血小板释放的内过氧化物合成PGI2，使血小板内cAMP水平增高，从而抑制血小板的聚集和释放反应，防止血栓形成。
组 别
, 百拇医药
剂量(mg/kg/d)
ADP(%)
凝血酶(%)
AA(%)
最大聚集率
抑制率(%)
最大聚集率
抑制率(%)
最大聚集率
抑制率(%)
生理盐水组
88.0±7.1
, 百拇医药
95.0±4.5
79.1±10.2
溶媒组
91.7±6.8
94.2±8.7
75.5±9.3
β-Ele
40
59.0±19.0*
33.0
68.8±18.0*
27.6
, 百拇医药
60.2±15.9*
23.9
80
59.5±14.5*
32.4
66.6±19.7*
29.9
53.8±22.5*
32.0
160
51.8±14.9*
, http://www.100md.com
41.2
60.6±22.3*
36.2
50.4±21.3*
36.3
阿斯匹林组
20
51.0±15.6*
42.1
38.1±26.0*
59.8
, 百拇医药
54.8±19.8*
30.7
注：与溶媒组相比较，*P<0.01
表3 大鼠口服β-Ele 10d后对动脉壁生成6-keto-PGF1α及血小板释放TXB2的影响(n=10,x±s)
组 别
剂量
(mg/kg/d)
6-keto-PGF1α
(pg/mg 湿重)
, 百拇医药 TXB2
(ng/L)
生理盐水组
823.5±142.8
17.3±3.0
溶媒组
817.5±170.7
16.2±4.5
β-Ele
40
827.4±131.4
13.8±4.9
, 百拇医药
80
887.1±66.2
13.1±5.7
160
869.5±148.8
12.9±5.9*1
阿斯匹林组
20
710.3±78.1*1
3.7±1.8*2
注：与溶媒组相比较，*1P<0.05,*P<0.01
, 百拇医药
在体内，TXA2和PGI2均极不稳定，很快地分别转化成TXB2和6-酮-PGF1α。因此测定TXB2和6-酮-PGF1α分别代表TXA2和PGI2的水平。本文研究表明，大鼠连续口服β-Ele 40～160mg/kg/d 10d后，TXB2含量明显减少，提示β-Ele可抑制凝血酶激活血小板时的TXA2释放反应，对血管壁的PGI2生成虽有所增加，但无统计学显著性。
综上所述，β-Ele主要通过抑制血小板聚集和TXA2的释放而发挥抗血栓作用。
参考文献
[1] 季宇彬，张广美主编.中药抗肿瘤有效成分药理与应用.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1998∶189.
, 百拇医药
[2] 许俊杰，陈育尧，孟庆棣.莪术对大鼠血液流变学及血栓形成的影响.中药材，1992，15(5)∶33.
[3] 朱路佳,肖东，陈星织,等.榄香烯对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响.中国野生植物资源，1996，(3)∶6.
[4] 徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991∶1124.
[5] 顾振纶，钱曾年，王兆钺，等. 罗布麻叶的药理学研究-对血小板聚集的影响.中成药，1989，11(11)∶28.
[6] Born GVR.Aggregation of blood platelets by adenosine diphospohate and its reveral.Nature,1962,194∶927.
[7] 徐叔云，卞如濂，陈修主编. 药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991∶1127.
[8] Gorman RR,Bunting S, Miller OV.Modulation of human platelet adenylate cyclase by prostacyclin.Prostaglandins,1977,13∶377.
收稿日期：1998-11-05, 百拇医药
单位：苏州 215007 苏州中药研究所
关键词：β-榄香烯；血栓形成；血栓素A2；血小板聚集
中国现代应用药学990405 摘要 目的：探讨β-榄香烯(β-elemene，β-Ele)的抗血栓作用及其机理。方法：采用血栓法观察了大鼠口服β-Ele 40～160mg/kg/d 10d后对血栓形成的影响,采用比浊法和放免法分别测定其抗血小板聚集性和TXA2及PGI2的含量。结果：β-Ele能明显抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成，同时可明显抑制ADP、凝血酶和花生四烯酸诱导的血小板聚集及抑制凝血酶诱导的血小板TXA2释放，但对大鼠动脉壁中的PGI2无明显影响。结论：β-Ele抗血栓作用与其抑制血小板聚集和释放TXA2有关。
, http://www.100md.com
Inhibitory effect of β-elemene on thrombosis and its mechanism in rats
Lu Qun(Lu Q),Zhu Lujia(Zhu LJ),Xie Meilin(Xie ML),et al(Suzhou Institute of Chinese Materia Medica,Suzhou 215007)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate the inhibitory action and mechanism of β-elemene(β-Ele) on thrombosis.METHOD:Male rats were treated with β-Ele 40～160 mg/kg.d-1 for 10 days,and effects of β-Ele on rat thrombosis,blood platelet aggregation and its releasing product(Thromboxane A2,TXA2),and prostacyclin(PGI2) in vessel wall were observed.RESULTS:β-Ele obviously reduced the weight of thrombus,with simultaneous inhibition of platelet aggregation induced by ADP,thrombin,arachidonic acid(AA) and its releasing reaction triggered by thrombin.The level of PGI2 in vessel wall was changed/little compared with the vehicle group.CONCLUSION:Antithrombotic effect of β-Ele was related to platelet aggregation inhibition and TXA2 release.
, 百拇医药
KEY WORDS β-Elemene,thrombosis,thromboxane A2,platelet aggregation
β-榄香烯(β-elemene,β-Ele)是从中药温莪术(Rhizoma cuzcumae)中提取的有效抗癌成分[1]。最近，实验研究发现它具有抗血栓和活血化瘀作用[2，3]，但其作用机理尚未明了，本文采用预先体内给药方法，观察β-Ele对大鼠动静脉旁路血栓形成、血小板聚集及对血栓素A2(TXA2)和前列环素PGI2生成的影响，为临床用于防治血栓栓塞性疾病提供可靠的实验依据。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂
β-Ele(大连金港制药有限公司，含量92.0%，批号970325)，使用时以食用色拉油配成所需浓度；阿斯匹林(aspirin)和花生四烯酸(AA)(Sigma公司)；凝血酶(珠海经济特区生物化学制药厂)；二磷酸腺苷(ADP)(中国科学院上海生物化学研究所)；125I-6-酮-前列腺素F1α(125I-6-Keto-PGF1α)和125I-血栓素B2(TXB2)放免测定试剂盒(苏州医学院血栓与止血研究室)，其余试剂均为国产分析纯。
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1.2动物
♂Sprague-Dawley大鼠(苏州医学院实验动物中心)。
1.3 仪器
智能血液凝集仪，TYXN-91型(上海通用机电技术研究所)。
1.4 动-静脉旁路血栓形成实验
大鼠60只，体重(350±20)g，随机分为6组，即生理盐水组，溶媒组，β-Ele小剂量组(40mg/kg/d)、中剂量组(80mg/kg/d)、大剂量组(160mg/kg/d)和阿斯匹林组(20mg/kg/d)。每组10只，每天口服给药一次，连续10d后以戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg,ip)，按文献[4]方法，分离右颈总动脉与左颈外静脉，用聚乙烯管(管内置有定量丝线)一端插入左颈外静脉后，聚乙烯管内准确注入肝素(50U/ml)抗凝，再将另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹开放血流15min后，迅速取出丝线称重，血栓重量=总重量-丝线重量。
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1.5血小板聚集及TXB2测定
♂SD大鼠60只，体重(270.0±25.0)g，分组及给药方法同前，由腹主动脉取血后按本室常法[5]制备血小板悬液或富血小板血浆(PRP)，将悬液或PRP中血小板数调整为3×1011/L，用改良Born[6]比浊法加以改进测定血小板聚集性。取200μl血小板悬液或PRP，37℃温育5min后，加入200μmol/L的ADP 3μl或10U/ml的凝血酶1μl或10g/L AA 2μl后，描记5min血小板聚集曲线。聚集抑制率按下列公式计算：血小板聚集抑制率(%)=(对照组最大聚集率-给药组最大聚集率/对照组最大聚集率)×100%。
将上述凝血酶诱导血小板聚集管中迅速加入消炎痛终止反应[7]，另取未加诱导剂的空白血小板悬液200μl，同时离心后取上清液用放免法测定血小板释放的TXB2含量。
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1.6 大鼠主动脉环125I-6-酮-PGF1α测定
上述动物取血后迅速剪下胸主动脉，置冷生理盐水中去除周围结缔组织及脂肪，切成约2～3mm小段，按10mg组织加1ml生理盐水后制成匀浆，37℃温育0.5h后，置冰浴中终止反应，取上清液按放免药盒说明测定125I-6-酮-PGF1α含量。
1.7 统计方法
实验数据均以x±s表示，组间比较采用t检验。
2 实验结果
2.1 β-Ele对动-静脉旁路血栓形成的影响
β-Ele体内给药40～160 mg/kg/d能明显抑制动-静脉血栓形成，抑制率达到30.8%～47.4%，与生理盐水组和溶媒组相比，差异非常显著(P<0.01)，见表1。
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2.2 β-Ele对ADP、凝血酶和AA诱导血小板聚集的影响
如表2所示，大鼠连续口服β-Ele(40～160mg/kg/d)10d后，对ADP、凝血酶和AA诱导的血小板聚集均有明显的抑制作用，且随着剂量增加，抑制作用有所增强，与溶媒组相比，差异均非常显著(P<0.01)。
表1 大鼠口服β-Ele 10d后对血栓形成的影响(n=10，x±s) 组 别
剂量(mg/kg/d)
血栓湿重(mg)
抑制率(%)
生理盐水组
25.3±6.7
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28.8±8.6
β-Ele
40
17.5±4.1*
30.8
80
15.1±4.0*
40.3
160
13.3±3.6*
47.4
, http://www.100md.com
阿斯匹林组
20
16.3±3.2*
35.6
注：与溶媒组相比较，*P<0.01
2.3 β-Ele对主动脉壁PGI2和血小板释放TXB2影响
表3显示，大鼠体内给予β-Ele(160 mg/kg/d)10d可明显抑制血小板TXB2的释放，与溶媒组相比，差异显著(P<0.05)，而对胸主动脉壁6-酮-PGF1α生成虽有增加趋势，但无显著影响。
3 讨 论
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本研究结果表明，大鼠服用β-Ele后，可剂量依赖性地使血栓形成减少，并可显著抑制ADP、凝血酶和表2 大鼠口服β-Ele 10d后对血小板聚集的影响(n=10，x±s)AA诱导的血小板聚集，提示β-Ele可通过抑制血小板聚集而抑制血栓形成，且其抑制血小板聚集的途径是多方面的。业已表明，血小板在血栓形成中发挥着十分重要的作用，但血小板功能又受TXA2和PGI2的调控[8]。TXA2是血小板激活剂，它是目前已知最强的血小板聚集剂之一。而PGI2是血小板功能的抑制剂，它与TXA2的作用相反，它们两者之间的平衡对控制正常的止血机制，防止血栓形成是极为重要的。血管内皮细胞的PGI2合成酶能利用附近血小板释放的内过氧化物合成PGI2，使血小板内cAMP水平增高，从而抑制血小板的聚集和释放反应，防止血栓形成。
组 别
, 百拇医药
剂量(mg/kg/d)
ADP(%)
凝血酶(%)
AA(%)
最大聚集率
抑制率(%)
最大聚集率
抑制率(%)
最大聚集率
抑制率(%)
生理盐水组
88.0±7.1
, 百拇医药
95.0±4.5
79.1±10.2
溶媒组
91.7±6.8
94.2±8.7
75.5±9.3
β-Ele
40
59.0±19.0*
33.0
68.8±18.0*
27.6
, 百拇医药
60.2±15.9*
23.9
80
59.5±14.5*
32.4
66.6±19.7*
29.9
53.8±22.5*
32.0
160
51.8±14.9*
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41.2
60.6±22.3*
36.2
50.4±21.3*
36.3
阿斯匹林组
20
51.0±15.6*
42.1
38.1±26.0*
59.8
, 百拇医药
54.8±19.8*
30.7
注：与溶媒组相比较，*P<0.01
表3 大鼠口服β-Ele 10d后对动脉壁生成6-keto-PGF1α及血小板释放TXB2的影响(n=10,x±s)
组 别
剂量
(mg/kg/d)
6-keto-PGF1α
(pg/mg 湿重)
, 百拇医药 TXB2
(ng/L)
生理盐水组
823.5±142.8
17.3±3.0
溶媒组
817.5±170.7
16.2±4.5
β-Ele
40
827.4±131.4
13.8±4.9
, 百拇医药
80
887.1±66.2
13.1±5.7
160
869.5±148.8
12.9±5.9*1
阿斯匹林组
20
710.3±78.1*1
3.7±1.8*2
注：与溶媒组相比较，*1P<0.05,*P<0.01
, 百拇医药
在体内，TXA2和PGI2均极不稳定，很快地分别转化成TXB2和6-酮-PGF1α。因此测定TXB2和6-酮-PGF1α分别代表TXA2和PGI2的水平。本文研究表明，大鼠连续口服β-Ele 40～160mg/kg/d 10d后，TXB2含量明显减少，提示β-Ele可抑制凝血酶激活血小板时的TXA2释放反应，对血管壁的PGI2生成虽有所增加，但无统计学显著性。
综上所述，β-Ele主要通过抑制血小板聚集和TXA2的释放而发挥抗血栓作用。
参考文献
[1] 季宇彬，张广美主编.中药抗肿瘤有效成分药理与应用.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1998∶189.
, 百拇医药
[2] 许俊杰，陈育尧，孟庆棣.莪术对大鼠血液流变学及血栓形成的影响.中药材，1992，15(5)∶33.
[3] 朱路佳,肖东，陈星织,等.榄香烯对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响.中国野生植物资源，1996，(3)∶6.
[4] 徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991∶1124.
[5] 顾振纶，钱曾年，王兆钺，等. 罗布麻叶的药理学研究-对血小板聚集的影响.中成药，1989，11(11)∶28.
[6] Born GVR.Aggregation of blood platelets by adenosine diphospohate and its reveral.Nature,1962,194∶927.
[7] 徐叔云，卞如濂，陈修主编. 药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991∶1127.
[8] Gorman RR,Bunting S, Miller OV.Modulation of human platelet adenylate cyclase by prostacyclin.Prostaglandins,1977,13∶377.
收稿日期：1998-11-05, 百拇医药