绿脓杆菌耐药性及β-内酰胺酶基因的研究*
作者：何兴祥 高美英 王以光
单位：何兴祥 高美英，同济医科大学附属同济医院传染病学教研室，武汉 430030；王以光，中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京 100050
关键词：绿脓杆菌；耐药性；β-内酰胺酶基因；Logistic回归分析
同济医科大学学报990422 摘要 对72株临床分离的绿脓杆菌进行了药敏试验，其中42株检测了β-内酰胺酶及几种β-内酰胺酶基因同源序列在总DNA和质粒中的情况，并探讨了绿脓杆菌总DNA中不同β-内酰胺酶基因同源序列与不同β-内酰胺类抗生素耐药性的关系。结果显示，绿脓杆菌有普遍耐药性和多重耐药性，在42株绿脓杆菌中有34株产β-内酰胺酶，阳性率80.95%，β-内酰胺酶基因同源序列在总DNA中的检出亦有普遍性和多重性的特点，42株菌总DNA中检出PSE-1、TEM-1、SHV-2、OXA-1、OXA-2β-内酰胺酶基因同源序列2～4种不等，其中有17株菌分离到质粒(17/42)，这17株菌的质粒均检出1～2种β-内酰胺酶基因同源序列不等。从酶基因的类型看 ，染色体介导的以PSE-1型为主，质粒介导的以TEM-1型为主。Logistic回归分析显示β-内酰胺类抗生素耐药性与β-内酰胺酶基因的关系有3种情况：(1)与一种特定的β-内酰胺酶基因有关；(2)与几种β-内酰胺酶基因有关；(3)与β-内酰胺酶基因无关。
, 百拇医药
中图法分类号 R378.99， R915， Q343.1
Studies of β-Lactamases Genes in Pseudomonas Aeruginosa and Its Resistance to Antimicrobial Agents
He Xingxiang, Gao Meiying
Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical University,Wuhan 430030
Wang Yiguang
Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical
, 百拇医药
Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100050
Abstract Seventy-two strains of Pseudomonas Aeruginosa were isolated clinically from nosocomial infection cases in Tongji Hospital. Antimicrobial susceptibility test was carried out for every isolation The β-lase and β-lactamase genes of total DNA and plasmids in 42 isolates of P. aeruginosa were detected. The relationship between the different β-lactamases gene and resistance of P. aeruginosa to different antimicrobial agents was studied. The results showed that P. Aeruginosa possessed the characteristic of general and multiple drug resistance. The β-lase was found out by Nitrocefin in 34 strains out of 42 isolates with the rate of positive reaction being 80.95%. The existence of the β-lactamase genes also had widespread and multiple characteristics. Two to 4 β-lactamase genes of the PSE-1, TEM-1, SHV-1， OXA-1 and OXA-2 type in total DNA of 42 P. Aeruginosa were demonstrated. Plasmids were detected in 17 strains of P. aeruginosa (17/42). These strains harbored 1 to 2 β-lactamase genes in the plasmid. Southern analysis showed that the PSE-1 type was dominant in the β-lactamase genes of chromosome-mediated. The majority of genes are the TEM-1 type in the β-lactamase genes of plasmid-mediated. The logistic analysis displayed the resistance of P. aeruginosa to different β-lactam agents might depend on β-lactamase differently: (1) It is affected by the spectial type of β-lactamase gene. (2) It is influenced jointly by the many β-lactamse genes. (3)It is not attacked by the β-lactamase gene.
, 百拇医药
Key words pseudomonas aeruginosa; antimicrobial resistance; β-lactamase gene; logistic analysis
绿脓杆菌(Pseudomonas aernginosa, PA)又称绿脓假单胞菌(Pseudomonas pyocyanes)，为革兰氏阴性杆菌感染中较常见的条件致病菌，临床分离率不断增加，已居医院感染监测细菌的首位[1]，耐药性及耐药水平发展也较快，成为临床上最重要的耐药菌之一。其耐药机制十分复杂，涉及到β-内酰胺酶、外膜通透性、青霉素结合蛋白等。本文对PA的耐药性、β-内酰胺酶、β-内酰胺酶基因的定位，以及与β-内酰胺酶类抗生素耐药性的关系进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
细菌：72株PA均系同济医院细菌室1994年6月至1995年6月临床分离的医院感染致病菌。
, 百拇医药
抗生素：氨苄西林(Ampicillin, AMPC)、羧苄西林(Carbenicillin, CBPC)、哌拉西林(Pipearcillin, PIPC)均为上海第三制药厂产品；呋苄西林(Furbenicillin, FBPC)为山西太原药厂产品；头孢噻肟(Cefotaxime, CTX)、头孢哌酮(Cefoperazone, CPZ)、头孢曲松(Cefteriarone, CTRX)、头孢他定(Ceftazidine, CAZ)、亚胺培南(Imipenem, IMP)、庆大霉素(Gentamicin, GM)、阿米卡星(Amikacin, AMK)、诺氟沙星(Noefloxacin, NFLX)、环丙沙星(Ciprofloxacin, CILX)均为美国SIGMA公司产品。
Nitrocefin纸片为辉瑞公司赠送。β-内酰胺酶基因探针由Jacoby教授提供，分别是PSE-1、TEM-1、SHV-1、OXA-1和OXA-2[2]。
, 百拇医药 药敏试验：采用Kirby Bauer法测定细菌的耐药情况，采用试管稀释法测定抗生素的MIC。
β-内酰胺酶测定：运用Nitrocefin纸片检测β-内酰胺酶，按产品说明书进行。
质粒DNA提取和Southern杂交：质粒提取参照Kado[3]等法进行，分子量计算按Hansen和Olsen法进行[4]，运用Southern杂交试验检测β-内酰胺酶基因同源性，杂交膜制备参照Reed的碱Southern印迹法进行[5]，β-内酰胺酶基因控针片段用α-32P-dATP标记，杂交温度42℃，杂交液含甲酰胺4 ml、20×SSC 2 ml、0.5 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 320 μl、50×Denhant 800 μl、同源DNA 80 μl、双蒸水800 μl和新鲜变性的标记探针片段，杂交16～22 h后分别用2×SSC-0.1% SDS、0.1×SSC-0.1% SDS和0.1×SSC洗膜。
, http://www.100md.com
总DNA提取和斑点杂交：总DNA提取参照细菌总DNA提取原理进行[6]，运用斑点杂交试验，检测β-内酰胺酶基因同源性，β-内酰胺酶基因探针片段用地高辛标记(DIG DNA Labeling and Detection Kit系Molecular Biology Bochringer Mannheim公司产品)，杂交亦按此试剂盒说明进行。
Logistic回归分析：以总DNA中5种不同的酶基因为一组，即X1(PSE-1)、X2(TEM-1)、X3(SHV-1)、X4(OXA-1)和X5(OXA-2)为自变量，以8种β-内酰胺类抗生素为一组，即Y1(CBPC)、Y2(PIPC)、Y3(FBPC)、Y4(CTX)、Y5(CPZ)、Y6(CTRX)、Y7(CAZ)和Y8(IMP)为应变量，运用Logistic回归分析，了解X与Y的相关性，借以分析酶基因与β-内酰胺类抗生素耐药性的关系。
2 结果
, 百拇医药
2.1 绿脓杆菌抗生素的耐药性
测定了72株绿脓杆菌13种抗生素的耐药性及最低杆菌浓度(MIC mg/L)，结果见表1。
表1 72株PA的耐药性及对抗生素的
MIC(mg/L) 抗生素
耐药
株数
耐药率
(%)
MIC范围
MIC50
MIC90
, 百拇医药
AMPC
72
100.00
64->128
>128
>128
CBPC
28
38.89
32->128
128
>128
PIPC
, http://www.100md.com
26
36.11
4->128
64
>128
FBPC
12
16.67
1～32
4
16
CTX
28
, 百拇医药
38.89
4>128
32
128
CPZ
19
26.39
4->128
16
64
CTRX
24
33.33
, 百拇医药
8->128
16
128
CAZ
15
20.83
2～128
8
64
IMP
8
11.11
1～32
, 百拇医药
4
16
GM
48
66.67
2->128
16
128
AMK
22
30.56
2->128
8
, http://www.100md.com
64
NFLX
14
19.44
1～64
4
32
CILX
6
8.33
0.25～8
1
2
, 百拇医药
结果显示全部菌株至少耐2种抗生素，其中耐5种及5种以上者计30株，占41.66%。2.2 β-内酰胺酶的检测
对42株绿脓杆菌检测β-内酰胺酶，34株阳性，阳性率80.95%。
2.3 质检分析
2.3.1 质检DNA检测：对上述42株测酶的绿脓杆菌提取了质粒，其中17株携带有质粒，携带率40.48%，质粒条带1～3条不等，长度为18.41～228.2 kb。
2.3.2 β-内酰胺酶基因同源性检测：利用已知的几种β-内酰胺酶基因为探针，17株质粒中全部检出β-内酰胺酶基因同源序列，检出率100%，其中质粒上含有1种酶基因同源序列的菌株计7株；含有2种酶基因同源序列的菌株计10株。分类中以TEM-1型检出率最高，为8株，占47.06%；其次为 OXA-2、SHV-1及OXA-1。
, http://www.100md.com
2.4 绿脓杆菌总DNA中β-内酰胺酶基因同源性检测
42株绿脓杆菌总DNA中亦全部检出β-内酰胺酶基因同源序列，检出率100%，每株菌中含2～4种酶基因同源序列不等，其中检出3种酶基因的菌株计23株，占54.76%，酶基因同源序列检出的类型与质粒不同，以PSE-1为最多，42株绿脓杆菌中有41株检出(其中的2株是存在于质粒上，见前面的结果)，占97.62%；其次为OXA-1、TEM-1、SHV-1，最低者为OXA-2，占35.71%。
2.5 β-内酰胺酶基因与绿脓杆菌耐药性的关系
2.5.1 质粒对绿脓杆菌耐药性的影响：结果见表2。
2.5.2 β-内酰胺酶基因与β-内酰胺类抗生素耐药性Logistic回归分析：结果见表3。
基于X1(PSE-1)普遍存在于绿脓杆菌(41/42)中，故先抽去X1后再作X与Y的Logistic回归分析，从表3中看出：①TEM-1、SHV-1、OXA-1、OXA-2分别使CBPC、PIPC、FBPC、CTX、CPZ的耐药率显著上升；②TEM-1、OXA-2共同影响CTRX的耐药率；③TEM-1、SHV-1、OXA-1共同影响CAZ的耐药率；④酶基因(除PSE-1)对IMP耐药率无显著影响。
, 百拇医药
表2 质粒对绿脓杆菌耐药性的影响 抗生素
检出质粒的PA
(n=17)
未检出质粒的PA
(n=25)
耐药
株数
耐药率
(%)
耐药
株数
耐药率
(%)
, http://www.100md.com
CBPC
9
52.94
7
28.00*
*PIPC
5
29.41
10
40.00
FBPC
7
41.17
, 百拇医药
0
0*
CTX
13
76.47
3
12.00*
CPZ
11
64.70
0
0*
CTRZ
, 百拇医药
11
64.70
3
12.00*
CAZ
6
35.29
3
12.00*
IMP
3
17.64
2
, 百拇医药
8.00*
GM
14
82.35
14
56.00*
AMK
9
52.94
4
16.00*
*NFLX
, http://www.100md.com
3
17.64
5
20.00
*CILZ
0
0
3
12.00
与相应组比较 *P<0.05
复合影响Y6、Y7耐药率(P)的回归方程为：
, http://www.100md.com
表3 X与Y的Logistic回归分析结果
单因素分析(P<0.05)
多因素分析(sle=0.15，sls=0.15)
使Y耐药率显著上升的X
对Y耐药率无显著影响的X
对Y耐药率有复合影响的X
Y1(CPBC)
X2
X3X4X5
Y2(PIPC)
X3
, 百拇医药
X2X4X5
Y3(FBPC)
X4
X2X4X5
Y4(CTX)
X5
X2X3X5
Y5(CPZ)
X2X3X4
Y6(CTRX)
X3X4
X2X5
Y7(CAZ)
, http://www.100md.com
X5
X2X3X4
Y8(IMP)
X2X3X4X5
3 讨论
3.1 绿脓杆菌的耐药现状
前几种国内外报道医院感染绿脓杆菌临床分离率居第4位，现已跃升第1位[1]，是医院感染菌出现率最高的细菌，又是重症感染的常见病原菌。本组资料显示绿脓杆菌为多重耐药菌株，高度耐药菌株。从表1中看AMPC、GM居耐药首位，不能作为治疗绿脓杆菌感染的选用药；CBPC及CTX的MIC也较高，也不能作为首选药，令人不安的是常用药PIPC、CTRX及AMK耐药率也上升到30%以上，其中PIPC及CTRX的MIC90达128 ml/L；CPZ耐药率为26.39%，MIC90为64 mg/L；IMP及CAZ是大家最为关注的问题，对绿脓杆菌的耐药率分别为11.11%及20.83%，CILX的耐药率最低为8.33%、MIC90仅为2 mg/L；FBPC耐药率为16.67%。因而CPZ、CAZ、FBPC、IMP、CILX可作为治疗绿脓杆菌的适宜药物。
, 百拇医药
3.2 β-内酰胺酶基因的定位及其意义
本组42株绿脓杆菌β-内酰胺酶基因同源性的检出率100%；全部为β-内酰胺酶基因阳性菌。但用Nitrocefin纸片检测42株绿脓杆菌只有34株产β-内酰胺酶，造成这种差异可能是两种方法的灵敏度不一样，或是个别酶基因处于未表达的“沉默”状态。在β-内酰胺酶基因同源性的检测中，单纯由染色体检出酶基因的菌株计25株，占59.52%；由染色体和质粒共同检出的菌株计17，占40.48%。从酶基因类型看，染色体介导的以PSE-1型为主；质粒介导的以TEM-1型为主。由表2得知，PIPC、NFLZ、CILX在有无质粒介导的情况下其耐药率无明显差异(P>0.05)，说明其耐药主要由染色体介导；其他9种抗生素的耐药率则由染色体和质粒共同介导，高于单纯由染色体的介导，说明在绿脓杆菌耐药性的形成中，染色体和质粒所介导的有协同作用。绿脓杆菌是产生诱导型β-内酰胺酶的典型细菌，本实验42株绿脓杆菌，39株绿脓杆菌染色体中检出PSE-1，占92.86%。已有资料表明，染色体介导的β-内酰胺酶是可诱导的[7]，正常情况下，绿脓杆菌的这种染色体介导的β-内酰胺酶的合成受着基因阻遏物的控制，只产生少量的基础水平的β-内酰胺酶。当绿脓杆菌接触β-内酰胺酶的诱导剂时，β-内酰胺酶基因去阻遏，表达增加，绿脓杆菌产生大量的诱导型的β-内酰胺酶，这可能是绿脓杆菌严重耐药的重要原因之一。
, 百拇医药
3.3 绿脓杆菌β-内酰胺酶基因类型与耐β-内酰胺类抗生素种类的关系
已有许多资料证实不产β-内酰胺酶(β-lase)的变异株对β-内酰胺类抗生素的敏感性，比产β-lase的野生株明显增加。有关β-lase使β-内酰胺类抗生素灭活的机制有多种，经典的学说是β-lase水解抗生素的β-内酰胺环使其失活，随着对酶稳定性较好的抗生素耐药株的出现，提出了非水解共价结合学说。从表3看出，β-内酰胺类抗生素耐药性与β-lase的关系十分复杂，表现多种多样，归纳起来有3种情况，即：①受一种特定的β-lase的影响；②受几种β-lase的共同影响；③不受β-lase的影响。根据这些结果，一方面可为临床用药提供参考，另一方面也为进一步研究β-lase与β-内酰胺类抗生素作用机制提供了线索。
绿脓杆菌耐药机制复杂，其它尚有外膜屏障、主动泵出系统以及彼此间的相互协同耐药机制尚待进一步研究，以便能制定出更为有效的抗菌治疗方法。
, http://www.100md.com
注：国家自然科学基金资助项目(No. 39570864)
作者简介：何兴祥，男，1964年生，医学博士
参 考 文 献
1 周贵民，张有红，张淑芝等.北京4家医院对常用较新的16种抗生素的敏感性监测.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15(4)：219
2 Huovinen S, Huovinen P, Jacoby G A. Detection of plasmid mediates β-lactamases with DNA probes. Antimicrob Agents Chemother, 1988,32:175
3 Kado C I, Liu S T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteria, 1981,145:1365
, 百拇医药
4 Hansen J B， Olsen R H. Isolation of large bacterial plasmids and Characterization of the P2 incompatibility group plasmids pMG1 and pMG5. J Bacterial, 1978,135:227
5 Reed K C, Mann D A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to Nylon membrane. Nucleic Acids Res, 1985,13:7207
6 蔡良琬主编.核酸研究技术(上册).北京：科学技术出版社，1987.6～8
7 Jacoby G A, Archer G L. New mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial agents. N Engl J Med, 1991,324:601
(1998-09-29 收稿)
, 百拇医药
单位：何兴祥 高美英，同济医科大学附属同济医院传染病学教研室，武汉 430030；王以光，中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京 100050
关键词：绿脓杆菌；耐药性；β-内酰胺酶基因；Logistic回归分析
同济医科大学学报990422 摘要 对72株临床分离的绿脓杆菌进行了药敏试验，其中42株检测了β-内酰胺酶及几种β-内酰胺酶基因同源序列在总DNA和质粒中的情况，并探讨了绿脓杆菌总DNA中不同β-内酰胺酶基因同源序列与不同β-内酰胺类抗生素耐药性的关系。结果显示，绿脓杆菌有普遍耐药性和多重耐药性，在42株绿脓杆菌中有34株产β-内酰胺酶，阳性率80.95%，β-内酰胺酶基因同源序列在总DNA中的检出亦有普遍性和多重性的特点，42株菌总DNA中检出PSE-1、TEM-1、SHV-2、OXA-1、OXA-2β-内酰胺酶基因同源序列2～4种不等，其中有17株菌分离到质粒(17/42)，这17株菌的质粒均检出1～2种β-内酰胺酶基因同源序列不等。从酶基因的类型看 ，染色体介导的以PSE-1型为主，质粒介导的以TEM-1型为主。Logistic回归分析显示β-内酰胺类抗生素耐药性与β-内酰胺酶基因的关系有3种情况：(1)与一种特定的β-内酰胺酶基因有关；(2)与几种β-内酰胺酶基因有关；(3)与β-内酰胺酶基因无关。
, 百拇医药
中图法分类号 R378.99， R915， Q343.1
Studies of β-Lactamases Genes in Pseudomonas Aeruginosa and Its Resistance to Antimicrobial Agents
He Xingxiang, Gao Meiying
Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical University,Wuhan 430030
Wang Yiguang
Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical
, 百拇医药
Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100050
Abstract Seventy-two strains of Pseudomonas Aeruginosa were isolated clinically from nosocomial infection cases in Tongji Hospital. Antimicrobial susceptibility test was carried out for every isolation The β-lase and β-lactamase genes of total DNA and plasmids in 42 isolates of P. aeruginosa were detected. The relationship between the different β-lactamases gene and resistance of P. aeruginosa to different antimicrobial agents was studied. The results showed that P. Aeruginosa possessed the characteristic of general and multiple drug resistance. The β-lase was found out by Nitrocefin in 34 strains out of 42 isolates with the rate of positive reaction being 80.95%. The existence of the β-lactamase genes also had widespread and multiple characteristics. Two to 4 β-lactamase genes of the PSE-1, TEM-1, SHV-1， OXA-1 and OXA-2 type in total DNA of 42 P. Aeruginosa were demonstrated. Plasmids were detected in 17 strains of P. aeruginosa (17/42). These strains harbored 1 to 2 β-lactamase genes in the plasmid. Southern analysis showed that the PSE-1 type was dominant in the β-lactamase genes of chromosome-mediated. The majority of genes are the TEM-1 type in the β-lactamase genes of plasmid-mediated. The logistic analysis displayed the resistance of P. aeruginosa to different β-lactam agents might depend on β-lactamase differently: (1) It is affected by the spectial type of β-lactamase gene. (2) It is influenced jointly by the many β-lactamse genes. (3)It is not attacked by the β-lactamase gene.
, 百拇医药
Key words pseudomonas aeruginosa; antimicrobial resistance; β-lactamase gene; logistic analysis
绿脓杆菌(Pseudomonas aernginosa, PA)又称绿脓假单胞菌(Pseudomonas pyocyanes)，为革兰氏阴性杆菌感染中较常见的条件致病菌，临床分离率不断增加，已居医院感染监测细菌的首位[1]，耐药性及耐药水平发展也较快，成为临床上最重要的耐药菌之一。其耐药机制十分复杂，涉及到β-内酰胺酶、外膜通透性、青霉素结合蛋白等。本文对PA的耐药性、β-内酰胺酶、β-内酰胺酶基因的定位，以及与β-内酰胺酶类抗生素耐药性的关系进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
细菌：72株PA均系同济医院细菌室1994年6月至1995年6月临床分离的医院感染致病菌。
, 百拇医药
抗生素：氨苄西林(Ampicillin, AMPC)、羧苄西林(Carbenicillin, CBPC)、哌拉西林(Pipearcillin, PIPC)均为上海第三制药厂产品；呋苄西林(Furbenicillin, FBPC)为山西太原药厂产品；头孢噻肟(Cefotaxime, CTX)、头孢哌酮(Cefoperazone, CPZ)、头孢曲松(Cefteriarone, CTRX)、头孢他定(Ceftazidine, CAZ)、亚胺培南(Imipenem, IMP)、庆大霉素(Gentamicin, GM)、阿米卡星(Amikacin, AMK)、诺氟沙星(Noefloxacin, NFLX)、环丙沙星(Ciprofloxacin, CILX)均为美国SIGMA公司产品。
Nitrocefin纸片为辉瑞公司赠送。β-内酰胺酶基因探针由Jacoby教授提供，分别是PSE-1、TEM-1、SHV-1、OXA-1和OXA-2[2]。
, 百拇医药 药敏试验：采用Kirby Bauer法测定细菌的耐药情况，采用试管稀释法测定抗生素的MIC。
β-内酰胺酶测定：运用Nitrocefin纸片检测β-内酰胺酶，按产品说明书进行。
质粒DNA提取和Southern杂交：质粒提取参照Kado[3]等法进行，分子量计算按Hansen和Olsen法进行[4]，运用Southern杂交试验检测β-内酰胺酶基因同源性，杂交膜制备参照Reed的碱Southern印迹法进行[5]，β-内酰胺酶基因控针片段用α-32P-dATP标记，杂交温度42℃，杂交液含甲酰胺4 ml、20×SSC 2 ml、0.5 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 320 μl、50×Denhant 800 μl、同源DNA 80 μl、双蒸水800 μl和新鲜变性的标记探针片段，杂交16～22 h后分别用2×SSC-0.1% SDS、0.1×SSC-0.1% SDS和0.1×SSC洗膜。
, http://www.100md.com
总DNA提取和斑点杂交：总DNA提取参照细菌总DNA提取原理进行[6]，运用斑点杂交试验，检测β-内酰胺酶基因同源性，β-内酰胺酶基因探针片段用地高辛标记(DIG DNA Labeling and Detection Kit系Molecular Biology Bochringer Mannheim公司产品)，杂交亦按此试剂盒说明进行。
Logistic回归分析：以总DNA中5种不同的酶基因为一组，即X1(PSE-1)、X2(TEM-1)、X3(SHV-1)、X4(OXA-1)和X5(OXA-2)为自变量，以8种β-内酰胺类抗生素为一组，即Y1(CBPC)、Y2(PIPC)、Y3(FBPC)、Y4(CTX)、Y5(CPZ)、Y6(CTRX)、Y7(CAZ)和Y8(IMP)为应变量，运用Logistic回归分析，了解X与Y的相关性，借以分析酶基因与β-内酰胺类抗生素耐药性的关系。
2 结果
, 百拇医药
2.1 绿脓杆菌抗生素的耐药性
测定了72株绿脓杆菌13种抗生素的耐药性及最低杆菌浓度(MIC mg/L)，结果见表1。
表1 72株PA的耐药性及对抗生素的
MIC(mg/L) 抗生素
耐药
株数
耐药率
(%)
MIC范围
MIC50
MIC90
, 百拇医药
AMPC
72
100.00
64->128
>128
>128
CBPC
28
38.89
32->128
128
>128
PIPC
, http://www.100md.com
26
36.11
4->128
64
>128
FBPC
12
16.67
1～32
4
16
CTX
28
, 百拇医药
38.89
4>128
32
128
CPZ
19
26.39
4->128
16
64
CTRX
24
33.33
, 百拇医药
8->128
16
128
CAZ
15
20.83
2～128
8
64
IMP
8
11.11
1～32
, 百拇医药
4
16
GM
48
66.67
2->128
16
128
AMK
22
30.56
2->128
8
, http://www.100md.com
64
NFLX
14
19.44
1～64
4
32
CILX
6
8.33
0.25～8
1
2
, 百拇医药
结果显示全部菌株至少耐2种抗生素，其中耐5种及5种以上者计30株，占41.66%。2.2 β-内酰胺酶的检测
对42株绿脓杆菌检测β-内酰胺酶，34株阳性，阳性率80.95%。
2.3 质检分析
2.3.1 质检DNA检测：对上述42株测酶的绿脓杆菌提取了质粒，其中17株携带有质粒，携带率40.48%，质粒条带1～3条不等，长度为18.41～228.2 kb。
2.3.2 β-内酰胺酶基因同源性检测：利用已知的几种β-内酰胺酶基因为探针，17株质粒中全部检出β-内酰胺酶基因同源序列，检出率100%，其中质粒上含有1种酶基因同源序列的菌株计7株；含有2种酶基因同源序列的菌株计10株。分类中以TEM-1型检出率最高，为8株，占47.06%；其次为 OXA-2、SHV-1及OXA-1。
, http://www.100md.com
2.4 绿脓杆菌总DNA中β-内酰胺酶基因同源性检测
42株绿脓杆菌总DNA中亦全部检出β-内酰胺酶基因同源序列，检出率100%，每株菌中含2～4种酶基因同源序列不等，其中检出3种酶基因的菌株计23株，占54.76%，酶基因同源序列检出的类型与质粒不同，以PSE-1为最多，42株绿脓杆菌中有41株检出(其中的2株是存在于质粒上，见前面的结果)，占97.62%；其次为OXA-1、TEM-1、SHV-1，最低者为OXA-2，占35.71%。
2.5 β-内酰胺酶基因与绿脓杆菌耐药性的关系
2.5.1 质粒对绿脓杆菌耐药性的影响：结果见表2。
2.5.2 β-内酰胺酶基因与β-内酰胺类抗生素耐药性Logistic回归分析：结果见表3。
基于X1(PSE-1)普遍存在于绿脓杆菌(41/42)中，故先抽去X1后再作X与Y的Logistic回归分析，从表3中看出：①TEM-1、SHV-1、OXA-1、OXA-2分别使CBPC、PIPC、FBPC、CTX、CPZ的耐药率显著上升；②TEM-1、OXA-2共同影响CTRX的耐药率；③TEM-1、SHV-1、OXA-1共同影响CAZ的耐药率；④酶基因(除PSE-1)对IMP耐药率无显著影响。
, 百拇医药
表2 质粒对绿脓杆菌耐药性的影响 抗生素
检出质粒的PA
(n=17)
未检出质粒的PA
(n=25)
耐药
株数
耐药率
(%)
耐药
株数
耐药率
(%)
, http://www.100md.com
CBPC
9
52.94
7
28.00*
*PIPC
5
29.41
10
40.00
FBPC
7
41.17
, 百拇医药
0
0*
CTX
13
76.47
3
12.00*
CPZ
11
64.70
0
0*
CTRZ
, 百拇医药
11
64.70
3
12.00*
CAZ
6
35.29
3
12.00*
IMP
3
17.64
2
, 百拇医药
8.00*
GM
14
82.35
14
56.00*
AMK
9
52.94
4
16.00*
*NFLX
, http://www.100md.com
3
17.64
5
20.00
*CILZ
0
0
3
12.00
与相应组比较 *P<0.05
复合影响Y6、Y7耐药率(P)的回归方程为：
, http://www.100md.com
表3 X与Y的Logistic回归分析结果
单因素分析(P<0.05)
多因素分析(sle=0.15，sls=0.15)
使Y耐药率显著上升的X
对Y耐药率无显著影响的X
对Y耐药率有复合影响的X
Y1(CPBC)
X2
X3X4X5
Y2(PIPC)
X3
, 百拇医药
X2X4X5
Y3(FBPC)
X4
X2X4X5
Y4(CTX)
X5
X2X3X5
Y5(CPZ)
X2X3X4
Y6(CTRX)
X3X4
X2X5
Y7(CAZ)
, http://www.100md.com
X5
X2X3X4
Y8(IMP)
X2X3X4X5
3 讨论
3.1 绿脓杆菌的耐药现状
前几种国内外报道医院感染绿脓杆菌临床分离率居第4位，现已跃升第1位[1]，是医院感染菌出现率最高的细菌，又是重症感染的常见病原菌。本组资料显示绿脓杆菌为多重耐药菌株，高度耐药菌株。从表1中看AMPC、GM居耐药首位，不能作为治疗绿脓杆菌感染的选用药；CBPC及CTX的MIC也较高，也不能作为首选药，令人不安的是常用药PIPC、CTRX及AMK耐药率也上升到30%以上，其中PIPC及CTRX的MIC90达128 ml/L；CPZ耐药率为26.39%，MIC90为64 mg/L；IMP及CAZ是大家最为关注的问题，对绿脓杆菌的耐药率分别为11.11%及20.83%，CILX的耐药率最低为8.33%、MIC90仅为2 mg/L；FBPC耐药率为16.67%。因而CPZ、CAZ、FBPC、IMP、CILX可作为治疗绿脓杆菌的适宜药物。
, 百拇医药
3.2 β-内酰胺酶基因的定位及其意义
本组42株绿脓杆菌β-内酰胺酶基因同源性的检出率100%；全部为β-内酰胺酶基因阳性菌。但用Nitrocefin纸片检测42株绿脓杆菌只有34株产β-内酰胺酶，造成这种差异可能是两种方法的灵敏度不一样，或是个别酶基因处于未表达的“沉默”状态。在β-内酰胺酶基因同源性的检测中，单纯由染色体检出酶基因的菌株计25株，占59.52%；由染色体和质粒共同检出的菌株计17，占40.48%。从酶基因类型看，染色体介导的以PSE-1型为主；质粒介导的以TEM-1型为主。由表2得知，PIPC、NFLZ、CILX在有无质粒介导的情况下其耐药率无明显差异(P>0.05)，说明其耐药主要由染色体介导；其他9种抗生素的耐药率则由染色体和质粒共同介导，高于单纯由染色体的介导，说明在绿脓杆菌耐药性的形成中，染色体和质粒所介导的有协同作用。绿脓杆菌是产生诱导型β-内酰胺酶的典型细菌，本实验42株绿脓杆菌，39株绿脓杆菌染色体中检出PSE-1，占92.86%。已有资料表明，染色体介导的β-内酰胺酶是可诱导的[7]，正常情况下，绿脓杆菌的这种染色体介导的β-内酰胺酶的合成受着基因阻遏物的控制，只产生少量的基础水平的β-内酰胺酶。当绿脓杆菌接触β-内酰胺酶的诱导剂时，β-内酰胺酶基因去阻遏，表达增加，绿脓杆菌产生大量的诱导型的β-内酰胺酶，这可能是绿脓杆菌严重耐药的重要原因之一。
, 百拇医药
3.3 绿脓杆菌β-内酰胺酶基因类型与耐β-内酰胺类抗生素种类的关系
已有许多资料证实不产β-内酰胺酶(β-lase)的变异株对β-内酰胺类抗生素的敏感性，比产β-lase的野生株明显增加。有关β-lase使β-内酰胺类抗生素灭活的机制有多种，经典的学说是β-lase水解抗生素的β-内酰胺环使其失活，随着对酶稳定性较好的抗生素耐药株的出现，提出了非水解共价结合学说。从表3看出，β-内酰胺类抗生素耐药性与β-lase的关系十分复杂，表现多种多样，归纳起来有3种情况，即：①受一种特定的β-lase的影响；②受几种β-lase的共同影响；③不受β-lase的影响。根据这些结果，一方面可为临床用药提供参考，另一方面也为进一步研究β-lase与β-内酰胺类抗生素作用机制提供了线索。
绿脓杆菌耐药机制复杂，其它尚有外膜屏障、主动泵出系统以及彼此间的相互协同耐药机制尚待进一步研究，以便能制定出更为有效的抗菌治疗方法。
, http://www.100md.com
注：国家自然科学基金资助项目(No. 39570864)
作者简介：何兴祥，男，1964年生，医学博士
参 考 文 献
1 周贵民，张有红，张淑芝等.北京4家医院对常用较新的16种抗生素的敏感性监测.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15(4)：219
2 Huovinen S, Huovinen P, Jacoby G A. Detection of plasmid mediates β-lactamases with DNA probes. Antimicrob Agents Chemother, 1988,32:175
3 Kado C I, Liu S T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteria, 1981,145:1365
, 百拇医药
4 Hansen J B， Olsen R H. Isolation of large bacterial plasmids and Characterization of the P2 incompatibility group plasmids pMG1 and pMG5. J Bacterial, 1978,135:227
5 Reed K C, Mann D A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to Nylon membrane. Nucleic Acids Res, 1985,13:7207
6 蔡良琬主编.核酸研究技术(上册).北京：科学技术出版社，1987.6～8
7 Jacoby G A, Archer G L. New mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial agents. N Engl J Med, 1991,324:601
(1998-09-29 收稿)
, 百拇医药