弱精子症患者精子中ATP和琥珀酸脱氢酶的含量与精子活率的关系*
作者：熊承良 黄勋彬 沈继云 夏文家
单位：同济医科大学计划生育研究所, 武汉 430030
关键词：弱精子症；三磷酸腺苷；琥珀酸脱氢酶
同济医科大学学报990406 摘要 采用生物发光技术和酶组织化学方法检测了75例不育症男子精子中的ATP和琥珀酸脱氢酶(SDH)。其中精液参数正常者25例, 弱精子症50例。结果发现, 精液参数组精子中ATP含量为(136.7±72.8) pmol/百万个精子(106), 弱精子症组(69.5±21.3) pmol/百万个精子(106),两组有显著性差异(P<0.01)。SDH主要分布在精子尾部中段,两组有极显著性差异(P<0.01)。SDH活力与精子活率呈正相关,研究表明SDH活性减低,可影响ATP的生成, 精子中ATP不足可能是弱精症的直接原因之一。
, 百拇医药
中图法分类号 R321.1, Q554.9
Relationship between Levels of ATP and Succinate Dehydrogenase in Spermatozoa in the Patients with Asthenospermia and Sperm Motility
Xiong Chengliang, Huang Xunbin, Shen Jiyun et al
Center of Reproductive Medicine, Tongji Medical University,Wuhan 430030
Abstract The levels of ATP and succinate dehydroge-nase (SDH) in spermatozoa of 75 infertile men were detected by bioluminecence and enzyme histochemistry.Among them 25 cases (group A) had normal parameter of seminal samples, 50(group B) diagnosed as having asthenospermia. The experimental results showed that the levels of ATP were (136.7±27.8) mmol/106 spermatozoa in group A, (69.5±21.3)mmol/106 spermatozoa in group B(P<0.01).SDH was mainly located in the midpiece of sperm flagellum with the differences being significant between the two groups(P<0.01). A positive correlation was observed between SDH activity and sperm motility. It was suggested that deficiency of SDH activity may influence production of ATP and shortage of ATP in sperm with asthenospermia may lower sperm motility.
, 百拇医药
Key words asthenospermia; ATP; succinate dehydrogenase
弱精子症是指精液参数中向前运动的精子(A类和B类)小于 50%或快速直线向前运动的精子小于25%的病症。临床上,发现不育夫妇中男性因精子活力差而引起生育力低下的发病率较高, 通过对正常人精子的研究发现精子的运动强弱与ATP的生成多少有关,本文分别对50例弱精子症男子和25例精液参数正常男子精液中精子ATP 含量和琥珀酸脱氢酶(SDH)的含量进行测定,现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源及处理
75份精液标本分别来自武汉南威医学中心不育症专科门诊和本中心不育专家门诊。年龄24～43岁,全部患者禁欲3～7 d, 手淫或电动按摩取精,将精液置洁净小烧杯中,放37℃水浴箱,待精液液化后,按WHO精液检验标准进行精液常规分析,然后迅速将精液转移至洁净试管中,加盖,放-30℃冰箱中保存待测,参照WHO标准,根据2 次以上精液分析结果将75例患者的精液标本分为精液参数正常组和弱精子症组。测定前,从-30℃冰箱中分别取出。 75份待测标本解融后,高速离心11000 r/min×10 min,弃精浆,双蒸水洗涤2次,用双蒸水调整精子浓度。取0.1 ml tris-EDTA缓冲液(pH 7.75)加双蒸水0. 8 ml,放100℃水中煮沸,加待测标本0.1 ml,混匀后煮沸2 min,离心,取上清,置冰块上待测。
, 百拇医药
1.2 ATP的测定
采用生物发光技术,在Bioorbit 1251 Luminometer(LKB公司产品)上进行测定,使用德国宝灵曼生物试剂公司提供的ATP 生物发光检验试剂盒,内含ATP标准品及虫荧光素酶,先用ATP标准品制做 ATP含量的标准曲线。75份待测标本依次进行测定, 每份待测标本均做双管,取均值,通过ATP标准曲线查出ATP的绝对含量。
1.3 SDH测定
从低温冰箱中取出待测标本,取0.2 ml,用生理盐水洗涤3次后涂片,采用Pearson建立的SDH方法显色[1]。精子涂片放室温内自然晾干后与作用液在37℃水温箱中反应3 h,生理盐水洗3次, Fca 固定10 min,置于80%酒精5 min,PVP封片。每张涂片均在高倍镜下观察10 个视野,共计数100个精子。根据精子有无着色及着色的部位采用测微尺测量,并记录着色的长及宽度。
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1.4 统计学处理
全部资料采用t检验和相关分析等统计学处理。
2 结果
2.1 精液分析参数
精液参数正常组和弱精子症组精液分析参数见表1。
表1 两组精液分析的部分参数(
) 组 别
例数
(n)
密度
(1×109/L)
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形态
(%)
活率
(%)
精液参数正常组
25
63
72.4
71.6
弱精子症组
50
51
68.7
, 百拇医药
43.2
2.2 精子中ATP的含量
采用生物发光技术,通过生物发光仪测定两组精子 ATP的含量,结果提示精液参数正常组ATP含量为(136.7±27.8) pmol/百万个精子(106精子),弱精子症组ATP含量为(69.5±21.3) pmol/百万个精子(106精子)。经统计学处理表明,精液参数正常组精子ATP 含量显著高于弱精子症组,有极显著性差异(P<0.01)。
2.3 SDH染色
高倍镜下, 精液参数正常组可见精子尾部中段有较深的蓝紫色颗粒,而弱精子症组着色部位同精子参数正常组比较,着色略浅,着色面积也较前者小,同时可见到许多未着色精子(附图)。两组精子着色部位用测微尺测量长和宽,见表2。精液参数正常组SDH 着色面积明显大于弱精子症组。经相关分析发现SDH活力与精子活率呈正相关,相关系数0.87,P<0.01。
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表2 两组SDH着色面积测定结果() 组 别
例数
平均活率
SDH着色面积
(μm2/100个精子)
精液参数正常组
25
71.65
284.75±28.32*
弱精子症组
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50
43.2
151.58±42.67
与弱精子症组相比较 *P<0.01
附图 精液参数正常组精子SDH活性(左)；弱精子症组精子SDH活性(右)
3 讨 论
弱精子症在男性不育者中较多见,已成为一种常见病,弱精子症主要精液特征表现为精子活动力差,前向运动能力低,因而受精能力也下降,精子射出体外进入女性阴道,除了女性生殖道肌性抽吸作用有利于精子前向运动外,主要靠精子自身前向运动。 精子的运动需消耗能量,而ATP是一种高能磷酸化合物。
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1955年Hoffman-Berling最早证明ATP是精子尾部运动的能量来源,Comhaire等人认为精子中的ATP水平是反映人体精子受精能力的最好标志[2,3]。Bilgeri等人认为ATP含量越高,精子活率和运动能力越好,受精潜在能力越大[4]。Doki等人发现具有生育能力的男性精子细胞内含有高浓度ATP,ATP是精子能量的直接来源,当把能运动的精子和不动的精子分离后发现可动精子中ATP 的含量高于不动精子中ATP的含量,另有学者发现精子活率与精子中ATP含量呈正相关[5]。本研究把弱精子症的精子包括缓慢前向运动的精子、原地微动的精子和不动的精子经化学处理后，测定提取液中所含ATP 并与精液参数正常组精子中ATP进行比较，发现弱精子症组精子中ATP 的含量显著低于精液参数正常组(P<0.01)。表明精子中ATP 含量不足可能是弱精子症的直接原因之一。
SDH是三羧酸循环的限速酶, 它催化琥珀酸脱氢酶转变成延胡索酸,脱氢后生成ATP,SDH与ATP的生成有关系,因此SDH 活力的强弱,反映精子能量代谢的活跃程度,SDH定位于线粒体内膜和嵴。SDH染色后正常精子在镜检时以精子的尾部中段显色较强。而弱精子症组精子中SDH 着色面积低于精液参数正常组,并有极显著性差异，因为SDH活性较差，ATP生成不足,这可能是精子活动力减弱的原因之一,因此在治疗弱精子症时,使用ATP以及消除抑制SDH酶活性的因素,提高与ATP生成有关的酶的活性,具有一定临床意义。
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注：湖北省科委自然科学基金资助课题(No.95JS-25)
作者简介：熊承良，男，1954年生，副教授
参 考 文 献
1 陈啸梅,周文郁, 彭俊云等. 组织化学手册. 北京:人民卫生出版社,1982.224～226
2 Comhaire F H, Vermeulen L, Schoonjans F. Reassessment of the accuracy of traditional sperm characteristics and adenosine triphosphate(ATP) in estimating the fertilizing potential of human semen in vivo. Int J Androl, 1987, 10:653
, 百拇医药
3 Comhaire F H, Vermeulen L, Ghedira K et al. Adenosine triphosphate in human semen: a quantitative estimate of fertilizing potential. Fertil Steril, 1983,40:500
4 Bilgeri Y R, Winckelmann A, Berzin M et al. denosine triphosphate levels in human spermatozoa. Arch Androl, 1987,18:183
5 Chan S Y M, Wang C. Correlation between semen adenosine triphosphate and sperm fertilizing capacity. Fertil Steril, 1987, 47:717
(1999-05-22 收稿)
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单位：同济医科大学计划生育研究所, 武汉 430030
关键词：弱精子症；三磷酸腺苷；琥珀酸脱氢酶
同济医科大学学报990406 摘要 采用生物发光技术和酶组织化学方法检测了75例不育症男子精子中的ATP和琥珀酸脱氢酶(SDH)。其中精液参数正常者25例, 弱精子症50例。结果发现, 精液参数组精子中ATP含量为(136.7±72.8) pmol/百万个精子(106), 弱精子症组(69.5±21.3) pmol/百万个精子(106),两组有显著性差异(P<0.01)。SDH主要分布在精子尾部中段,两组有极显著性差异(P<0.01)。SDH活力与精子活率呈正相关,研究表明SDH活性减低,可影响ATP的生成, 精子中ATP不足可能是弱精症的直接原因之一。
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中图法分类号 R321.1, Q554.9
Relationship between Levels of ATP and Succinate Dehydrogenase in Spermatozoa in the Patients with Asthenospermia and Sperm Motility
Xiong Chengliang, Huang Xunbin, Shen Jiyun et al
Center of Reproductive Medicine, Tongji Medical University,Wuhan 430030
Abstract The levels of ATP and succinate dehydroge-nase (SDH) in spermatozoa of 75 infertile men were detected by bioluminecence and enzyme histochemistry.Among them 25 cases (group A) had normal parameter of seminal samples, 50(group B) diagnosed as having asthenospermia. The experimental results showed that the levels of ATP were (136.7±27.8) mmol/106 spermatozoa in group A, (69.5±21.3)mmol/106 spermatozoa in group B(P<0.01).SDH was mainly located in the midpiece of sperm flagellum with the differences being significant between the two groups(P<0.01). A positive correlation was observed between SDH activity and sperm motility. It was suggested that deficiency of SDH activity may influence production of ATP and shortage of ATP in sperm with asthenospermia may lower sperm motility.
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Key words asthenospermia; ATP; succinate dehydrogenase
弱精子症是指精液参数中向前运动的精子(A类和B类)小于 50%或快速直线向前运动的精子小于25%的病症。临床上,发现不育夫妇中男性因精子活力差而引起生育力低下的发病率较高, 通过对正常人精子的研究发现精子的运动强弱与ATP的生成多少有关,本文分别对50例弱精子症男子和25例精液参数正常男子精液中精子ATP 含量和琥珀酸脱氢酶(SDH)的含量进行测定,现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源及处理
75份精液标本分别来自武汉南威医学中心不育症专科门诊和本中心不育专家门诊。年龄24～43岁,全部患者禁欲3～7 d, 手淫或电动按摩取精,将精液置洁净小烧杯中,放37℃水浴箱,待精液液化后,按WHO精液检验标准进行精液常规分析,然后迅速将精液转移至洁净试管中,加盖,放-30℃冰箱中保存待测,参照WHO标准,根据2 次以上精液分析结果将75例患者的精液标本分为精液参数正常组和弱精子症组。测定前,从-30℃冰箱中分别取出。 75份待测标本解融后,高速离心11000 r/min×10 min,弃精浆,双蒸水洗涤2次,用双蒸水调整精子浓度。取0.1 ml tris-EDTA缓冲液(pH 7.75)加双蒸水0. 8 ml,放100℃水中煮沸,加待测标本0.1 ml,混匀后煮沸2 min,离心,取上清,置冰块上待测。
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1.2 ATP的测定
采用生物发光技术,在Bioorbit 1251 Luminometer(LKB公司产品)上进行测定,使用德国宝灵曼生物试剂公司提供的ATP 生物发光检验试剂盒,内含ATP标准品及虫荧光素酶,先用ATP标准品制做 ATP含量的标准曲线。75份待测标本依次进行测定, 每份待测标本均做双管,取均值,通过ATP标准曲线查出ATP的绝对含量。
1.3 SDH测定
从低温冰箱中取出待测标本,取0.2 ml,用生理盐水洗涤3次后涂片,采用Pearson建立的SDH方法显色[1]。精子涂片放室温内自然晾干后与作用液在37℃水温箱中反应3 h,生理盐水洗3次, Fca 固定10 min,置于80%酒精5 min,PVP封片。每张涂片均在高倍镜下观察10 个视野,共计数100个精子。根据精子有无着色及着色的部位采用测微尺测量,并记录着色的长及宽度。
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1.4 统计学处理
全部资料采用t检验和相关分析等统计学处理。
2 结果
2.1 精液分析参数
精液参数正常组和弱精子症组精液分析参数见表1。
表1 两组精液分析的部分参数(
) 组 别例数
(n)
密度
(1×109/L)
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形态
(%)
活率
(%)
精液参数正常组
25
63
72.4
71.6
弱精子症组
50
51
68.7
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43.2
2.2 精子中ATP的含量
采用生物发光技术,通过生物发光仪测定两组精子 ATP的含量,结果提示精液参数正常组ATP含量为(136.7±27.8) pmol/百万个精子(106精子),弱精子症组ATP含量为(69.5±21.3) pmol/百万个精子(106精子)。经统计学处理表明,精液参数正常组精子ATP 含量显著高于弱精子症组,有极显著性差异(P<0.01)。
2.3 SDH染色
高倍镜下, 精液参数正常组可见精子尾部中段有较深的蓝紫色颗粒,而弱精子症组着色部位同精子参数正常组比较,着色略浅,着色面积也较前者小,同时可见到许多未着色精子(附图)。两组精子着色部位用测微尺测量长和宽,见表2。精液参数正常组SDH 着色面积明显大于弱精子症组。经相关分析发现SDH活力与精子活率呈正相关,相关系数0.87,P<0.01。
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表2 两组SDH着色面积测定结果(
) 组 别例数
平均活率
SDH着色面积
(μm2/100个精子)
精液参数正常组
25
71.65
284.75±28.32*
弱精子症组
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43.2
151.58±42.67
与弱精子症组相比较 *P<0.01
附图 精液参数正常组精子SDH活性(左)；弱精子症组精子SDH活性(右)
3 讨 论
弱精子症在男性不育者中较多见,已成为一种常见病,弱精子症主要精液特征表现为精子活动力差,前向运动能力低,因而受精能力也下降,精子射出体外进入女性阴道,除了女性生殖道肌性抽吸作用有利于精子前向运动外,主要靠精子自身前向运动。 精子的运动需消耗能量,而ATP是一种高能磷酸化合物。
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1955年Hoffman-Berling最早证明ATP是精子尾部运动的能量来源,Comhaire等人认为精子中的ATP水平是反映人体精子受精能力的最好标志[2,3]。Bilgeri等人认为ATP含量越高,精子活率和运动能力越好,受精潜在能力越大[4]。Doki等人发现具有生育能力的男性精子细胞内含有高浓度ATP,ATP是精子能量的直接来源,当把能运动的精子和不动的精子分离后发现可动精子中ATP 的含量高于不动精子中ATP的含量,另有学者发现精子活率与精子中ATP含量呈正相关[5]。本研究把弱精子症的精子包括缓慢前向运动的精子、原地微动的精子和不动的精子经化学处理后，测定提取液中所含ATP 并与精液参数正常组精子中ATP进行比较，发现弱精子症组精子中ATP 的含量显著低于精液参数正常组(P<0.01)。表明精子中ATP 含量不足可能是弱精子症的直接原因之一。
SDH是三羧酸循环的限速酶, 它催化琥珀酸脱氢酶转变成延胡索酸,脱氢后生成ATP,SDH与ATP的生成有关系,因此SDH 活力的强弱,反映精子能量代谢的活跃程度,SDH定位于线粒体内膜和嵴。SDH染色后正常精子在镜检时以精子的尾部中段显色较强。而弱精子症组精子中SDH 着色面积低于精液参数正常组,并有极显著性差异，因为SDH活性较差，ATP生成不足,这可能是精子活动力减弱的原因之一,因此在治疗弱精子症时,使用ATP以及消除抑制SDH酶活性的因素,提高与ATP生成有关的酶的活性,具有一定临床意义。
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注：湖北省科委自然科学基金资助课题(No.95JS-25)
作者简介：熊承良，男，1954年生，副教授
参 考 文 献
1 陈啸梅,周文郁, 彭俊云等. 组织化学手册. 北京:人民卫生出版社,1982.224～226
2 Comhaire F H, Vermeulen L, Schoonjans F. Reassessment of the accuracy of traditional sperm characteristics and adenosine triphosphate(ATP) in estimating the fertilizing potential of human semen in vivo. Int J Androl, 1987, 10:653
, 百拇医药
3 Comhaire F H, Vermeulen L, Ghedira K et al. Adenosine triphosphate in human semen: a quantitative estimate of fertilizing potential. Fertil Steril, 1983,40:500
4 Bilgeri Y R, Winckelmann A, Berzin M et al. denosine triphosphate levels in human spermatozoa. Arch Androl, 1987,18:183
5 Chan S Y M, Wang C. Correlation between semen adenosine triphosphate and sperm fertilizing capacity. Fertil Steril, 1987, 47:717
(1999-05-22 收稿)
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