低氧对人胚肺成纤维细胞表型与增生的影响*
作者：江向宁 车东媛 邓仲端 陈多恩
单位：江向宁 车东媛 邓仲端 陈多恩，同济医科大学基础医学院病理学教研室, 武汉 430030
关键词：低氧；成纤维细胞；表型；免疫组织化学
同济医科大学学报990403 摘要 采用单层细胞超薄切片技术和免疫细胞化学方法，观察常氧(N)、低氧(H)、常氧和低氧猪肺动脉内皮细胞条件培养液(NECCM 和HECCM)等不同条件，对肺血管外膜成纤维细胞的表型与增殖的影响。结果表明：(1) 仅HECCM组成纤维细胞显示表型转变，胞浆内出现微肌丝、致密体、基膜等平滑肌细胞超微结构，粗面内质网明显减少；且此组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达较其余3组明显增高(P<0.01)；(2)H和HECCM组增殖细胞核抗原(PCNA)表达较N和NECCM组明显升高(P<0.01)。结果提示：(1) 低氧可经肺动脉内皮细胞介导，引起人胚肺成纤维细胞向平滑肌样细胞转化，而单纯低氧无此作用；(2) 低氧可直接或经内皮细胞介导，刺激人胚肺成纤维细胞增殖。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R322.3, R845.2, R392.31
Effects of Hypoxia on Phenotype and Proliferation of Human Embryonic Lung Fibroblasts
Jiang Xiangning, Che Dongyuan, Deng Zhongduan et al
Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract Monolayer cell ultramicrotomy and immunocytochemistry were used to investigate the effects of normal oxygen (N), hypoxia (H), the media i.e. normoxic and hypoxic endothelial cell conditioned medium (NECCM and HECCM) on phenotype and proliferation of adventitial fibroblasts of the pulmonary vessels. The results showed: (1) Only the fibroblasts in the HECCM group displayed the phenotype modulation, i.e. the ultrastructural patterns characteristics of smooth muscle cells including abundant microfilaments inserting into dense bodies, basemembrane and decreased rough endoplasmic reticula. And the expression of α-smooth muscle-actin (α-SMA) in this group was increased obviously as compared with the other three groups (P<0.01); (2) The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) by the fibroblasts in groups of H and HECCM was higher than in the groups of N and NECCM (P<0.01).It was concluded that: (1) Hypoxia can, mediated by pulmonary arterial endothelial cells (PAECs) but not directly, induce phenotype modulation of the fibroblasts, namely transforming to smooth muscle cell-like cells. (2) Hypoxia can stimulate proliferation of human embryonic lung fibroblasts directly or mediated by PAECs.
, 百拇医药
Key words hypoxia; fibroblasts; phenotype; immunohistochemistry
慢性低氧导致肺动脉高压和肺血管构形重建(PVSR)，是肺心病发病的两个重要病理过程。PVSR的主要形态学特征为肺血管壁细胞增殖和腺泡内肺动脉(IAPA)肌化增强(包括肌型动脉中膜肥厚和无肌细动脉的肌化)[1，2]。对于肺血管中膜平滑肌细胞在PVSR形成中的作用研究报道较多，而外膜成纤维细胞对低氧的反应性及其与相邻细胞的调控关系，在PVSR中所起的作用及机制，报道不多。我们应用细胞培养、单层细胞超薄切片技术、免疫细胞化学等方法，研究低氧是否直接或经肺动脉内皮细胞介导，影响外膜成纤维细胞的表型转变及增殖功能，从而探讨低氧时肺血管外膜成纤维细胞增生、无肌细动脉肌化和纤维化的发生机制。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及实验分组
, 百拇医药
用酶消化法收集猪肺动脉内皮细胞(PAEc)，PAEc培养用M199培养液(含100 ml/L胎牛血清、 0.3 g/L谷氨酰胺、100 μg/ml硫酸青霉素钠、100 μg/ml硫酸链霉素钠)。制备常氧和低氧内皮细胞条件培养液(NECCM和HECCM)[3]。KMB17人胚肺成纤维细胞株(购自武汉大学菌种保存中心，复苏后选用第3～5代细胞进行实验)依照培养液和培养条件不同分为4组(表1)。各组细胞在相应条件下继续培养24 h后，按检测指标不同分别用不同方法进行细胞固定。
表1 KMB17细胞的实验分组 组别
培养液
培养条件(含氧量，%)
N
SFM
, 百拇医药
21
H
SFM
3
NECCM
NECCM
21
HECCM
HECCM
21
注：SFM为无血清培养液
1.2 单层细胞超薄切片制作及透射电镜观察[4]
, 百拇医药
各组附有KMB17细胞的盖玻片，用30 ml/L戊二醛固定(4℃，30 min)和10 ml/L饿酸后固定(室温，30 min)。经梯度酒精脱水后，进行半浸润、浸润，再进行原位包埋，制成单层细胞包埋块。用LKBⅢ型超薄切片机制片，柠檬酸铅及醋酸铀双重染色，Opton EM10c透射电镜观察。选择有完整细胞核和胞质的细胞，每组6～10个，拍照并最终放大5000～10000倍。选取同样放大倍数的细胞照片，每组6张，应用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，选取等同面积的胞浆视野，分别测量该视野内线粒体(Mc)、粗面内质网(RER)及微肌丝(MF)的总面积，各型细胞器的总面积与视野面积之比即为体密度(Vv)。
1.3 免疫细胞化学染色及图像分析
小鼠抗人α-SMA和小鼠抗人PCNA单克隆抗体、LSAB试剂盒均购自北京中山公司。各组附有KMB17细胞的盖玻片，经D-Hanks液洗涤两次后，检测α-SMA者用丙酮:乙醇(1∶1)混合固定液室温固定15～20 min。检测PCNA者用10 g/L多聚甲醛室温固定5 min，继以甲醇后固定15 min(-20℃)[5]。LSAB法进行免疫细胞化学染色。图像分析采用TJTY-300图像处理软件，在相同的放大倍数(200)下，于同次实验的各组阳性片中随机选取和测定20个KMB17细胞中的阳性表达产物(α-SMA阳性表达为胞浆内呈棕色细丝状或条状产物，PCNA阳性表达产物为棕褐色，颗粒状，位于胞核内)的平均吸光度值(A)，作t检验分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 各组KMB17细胞的细胞器体密度比较
N组KMB17细胞呈梭形，胞浆内有丰富的粗面内质网，线粒体和微肌丝的含量较少，无基膜存在，呈典型的成纤维细胞表型。H组与NECCM组各种细胞器体密度均与N组无显著性差异，而HECCM组线粒体体密度与上述各组无差别，但粗面内质网体密度明显降低(P<0.05)，胞浆内出现大量的微肌丝，以质膜下分布量最多，成束的微肌丝交错处有致密体形成，细胞质膜处有致密斑和不连续的基膜存在，呈现平滑肌样细胞表型(图1及表2)。
表2 各组KMB17细胞细胞器体密度比较(
, n=6) 组 别
VMC
, http://www.100md.com
VRER
VMF
N
0.0980±0.0048
0.6448±0.0412*
0.1109±0.0053*
H
0.1158±0.0039
0.5331±0.0135*
0.1107±0.0065*
, http://www.100md.com
NECCM
0.0981±0.0012
0.4878±0.0209*
0.0927±0.0038*
HECCM
0.1184±0.0053
0.2388±0.0275
0.3784±0.0480
与HECCM组比较 *P<0.05 VMC：线粒体的体密度，VRER：粗面内质网的体密度，VMF：微肌丝的体密度
, 百拇医药
2.2 各组KMB17细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达
N组KMB17细胞质内有均匀分布的细丝状或条状、淡棕褐色的α-SMA表达阳性物质，H组、NECCM组表达阳性染色强度与N组相似，差别无显著性意义。而HECCM组细胞的阳性染色为较深的棕褐色，与前3组相比，差异具极显著性意义(P<0.01)。阴性对照组细胞胞质内无染色反应阳性物质(表3)。
2.3 各组KMB17细胞中PCNA的表达
N组及NECCM组KMB17细胞中的圆形或卵圆形细胞核内有较均匀的棕色细颗粒状染色阳性物质，靠近核膜处稍多，而胞浆内几乎无阳性表达。H组和HECCM组细胞核内的阳性颗粒明显增多，核致密浓染，呈深褐色(图2)。图像分析及统计结果提示：H组、HECCM组PCNA表达明显高于N组及NECCM组，差异具极显著性意义(P<0.01)，而N与NECCM组之间，H与HECCM组之间则无明显差异(表4)。
, http://www.100md.com
表3 各组KMB17细胞α-SMA的表达
(
，n=20) 组别
细胞数
平均吸光度值
N
20
0.12621±0.02135*
H
20
0.13287±0.00816*
, 百拇医药
NECCM
20
0.11542±0.00662*
HECCM
20
0.15836±0.01253
与HECCM组比较 *P<0.01
图1 HECCM组细胞内出现大量微肌丝，并有致密体形成 EM×10000
, 百拇医药
图2 H组KMB17细胞核内PCNA表达 (LSAB法) ×266
表4 各组KMB17细胞PCNA表达比较
(, n=20) 组别
细胞数
平均吸光度值
N
20
0.1914±0.0239
H
20
, 百拇医药
0.2401±0.0231*
NECCM
20
0.1882±0.0133
HECCM
20
0.2305±0.0292*
与N组及NECCM组比较 *P<0.01
3 讨论
无肌型肺小动脉(NMA)是肺循环中的重要容量型血管，在低氧和炎症等因素作用下，其管壁出现中膜平滑肌细胞，而使肺循环阻力型血管增多，容量型血管减少，导致肺动脉压的升高。有关NMA结构改建中的平滑肌细胞来源问题，最初认为是肌源性来源，即由前一级部分肌型动脉壁的平滑肌细胞增殖并向NMA迁移、伸延的结果。继之认为肌化的中膜是由血管外膜成纤维细胞或周细胞因低氧的刺激而发生增殖和向平滑肌细胞转化形成的。目前尚无定论。
, 百拇医药
已知人胚肺成纤维细胞是一种具多向分化潜能的肺原始间叶细胞，可分化成熟为肺血管外膜或肺间质成纤维细胞，因此实验选用此细胞株代表后两种成纤维细胞。本研究在排除在体的神经体液因素影响下，证实单纯低氧和HECCM都能促进KMB17人胚肺成纤维细胞的PCNA蛋白表达增高，反映了细胞增殖的活跃现象，与文献报道一致[6]。同时也证明了只有HECCM可以促发KMB17细胞的超微结构、免疫表型具有平滑肌细胞特征，即向平滑肌样细胞分化。此为探讨低氧性肺动脉高压时，无肌型动脉肌化细胞可以来自肺血管外膜成纤维细胞提供了实验依据和干预的细胞对象。
同时我们认为此结论反映了肺血管构形特征和内皮细胞的旁分泌功能。因为组成无肌型肺动脉壁的细胞只有内皮细胞、成纤维细胞和少量周细胞，在内皮细胞基底面和成纤维细胞向腔面，均有较多的细胞微突，这些细胞突起可穿过单层弹力膜窗孔而相互接触，传递着细胞信息。已知低氧可促发内皮细胞旁分泌许多细胞因子(如ET、PDGF和TGF-β1等)[7]，这些因子可能通过受体激活信息传递途径，促进肺动脉成纤维细胞增殖、趋化或表型转变，在PVSR形成过程中起一定作用。
, 百拇医药
注:国家“八五”攻关项目(No.85-915-03-05)
作者简介:江向宁，女，1968年生，讲师
参 考 文 献
1 Vender R L. Chronic hypoxic pulmonary hypertension. Cell biology to pathophysiology. Chest, 1994, 106: 236
2 车东媛，熊 密. 肺血管构形重建的特征和形成机制. 基础医学与临床，1996, 16(1): 17
3 江向宁，袁永辉，张婉蓉等. 猪肺动脉缺氧内皮细胞条件培养液和DDPH对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响. 同济医科大学学报，1995, 24(6): 405
, 百拇医药
4 黄 蓓，车东媛，张婉蓉. 缺氧内皮细胞条件培养液对肺动脉平滑肌细胞表型的影响. 中华病理学杂志，1995，24(5): 306
5 Kurki P, Ogata K ，Tan E M. Monoclonal antibodies to proliferating cell nuclear antigen (PCNA)cyclin as probes for proliferating cells by immunofluorescence microscopy and flow cytometry. J Immunol Methods, 1988, 109: 49
6 Jones R C. Role of interstitial fibroblasts and intermediate cells in microvascular wall remodelling in pulmonary hypertension. Eur Respir Rev, 1993, 3: 569
7 Dawes K E, Peacock A J, Gray A J et al. Characterization of fibroblast mitogens and chemoattractants produced by endothelial cells exposed to hypoxia. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994, 10: 552
(1998-11-19 收稿)
, 百拇医药
单位：江向宁 车东媛 邓仲端 陈多恩，同济医科大学基础医学院病理学教研室, 武汉 430030
关键词：低氧；成纤维细胞；表型；免疫组织化学
同济医科大学学报990403 摘要 采用单层细胞超薄切片技术和免疫细胞化学方法，观察常氧(N)、低氧(H)、常氧和低氧猪肺动脉内皮细胞条件培养液(NECCM 和HECCM)等不同条件，对肺血管外膜成纤维细胞的表型与增殖的影响。结果表明：(1) 仅HECCM组成纤维细胞显示表型转变，胞浆内出现微肌丝、致密体、基膜等平滑肌细胞超微结构，粗面内质网明显减少；且此组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达较其余3组明显增高(P<0.01)；(2)H和HECCM组增殖细胞核抗原(PCNA)表达较N和NECCM组明显升高(P<0.01)。结果提示：(1) 低氧可经肺动脉内皮细胞介导，引起人胚肺成纤维细胞向平滑肌样细胞转化，而单纯低氧无此作用；(2) 低氧可直接或经内皮细胞介导，刺激人胚肺成纤维细胞增殖。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R322.3, R845.2, R392.31
Effects of Hypoxia on Phenotype and Proliferation of Human Embryonic Lung Fibroblasts
Jiang Xiangning, Che Dongyuan, Deng Zhongduan et al
Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract Monolayer cell ultramicrotomy and immunocytochemistry were used to investigate the effects of normal oxygen (N), hypoxia (H), the media i.e. normoxic and hypoxic endothelial cell conditioned medium (NECCM and HECCM) on phenotype and proliferation of adventitial fibroblasts of the pulmonary vessels. The results showed: (1) Only the fibroblasts in the HECCM group displayed the phenotype modulation, i.e. the ultrastructural patterns characteristics of smooth muscle cells including abundant microfilaments inserting into dense bodies, basemembrane and decreased rough endoplasmic reticula. And the expression of α-smooth muscle-actin (α-SMA) in this group was increased obviously as compared with the other three groups (P<0.01); (2) The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) by the fibroblasts in groups of H and HECCM was higher than in the groups of N and NECCM (P<0.01).It was concluded that: (1) Hypoxia can, mediated by pulmonary arterial endothelial cells (PAECs) but not directly, induce phenotype modulation of the fibroblasts, namely transforming to smooth muscle cell-like cells. (2) Hypoxia can stimulate proliferation of human embryonic lung fibroblasts directly or mediated by PAECs.
, 百拇医药
Key words hypoxia; fibroblasts; phenotype; immunohistochemistry
慢性低氧导致肺动脉高压和肺血管构形重建(PVSR)，是肺心病发病的两个重要病理过程。PVSR的主要形态学特征为肺血管壁细胞增殖和腺泡内肺动脉(IAPA)肌化增强(包括肌型动脉中膜肥厚和无肌细动脉的肌化)[1，2]。对于肺血管中膜平滑肌细胞在PVSR形成中的作用研究报道较多，而外膜成纤维细胞对低氧的反应性及其与相邻细胞的调控关系，在PVSR中所起的作用及机制，报道不多。我们应用细胞培养、单层细胞超薄切片技术、免疫细胞化学等方法，研究低氧是否直接或经肺动脉内皮细胞介导，影响外膜成纤维细胞的表型转变及增殖功能，从而探讨低氧时肺血管外膜成纤维细胞增生、无肌细动脉肌化和纤维化的发生机制。
1 材料与方法
1.1 细胞培养及实验分组
, 百拇医药
用酶消化法收集猪肺动脉内皮细胞(PAEc)，PAEc培养用M199培养液(含100 ml/L胎牛血清、 0.3 g/L谷氨酰胺、100 μg/ml硫酸青霉素钠、100 μg/ml硫酸链霉素钠)。制备常氧和低氧内皮细胞条件培养液(NECCM和HECCM)[3]。KMB17人胚肺成纤维细胞株(购自武汉大学菌种保存中心，复苏后选用第3～5代细胞进行实验)依照培养液和培养条件不同分为4组(表1)。各组细胞在相应条件下继续培养24 h后，按检测指标不同分别用不同方法进行细胞固定。
表1 KMB17细胞的实验分组 组别
培养液
培养条件(含氧量，%)
N
SFM
, 百拇医药
21
H
SFM
3
NECCM
NECCM
21
HECCM
HECCM
21
注：SFM为无血清培养液
1.2 单层细胞超薄切片制作及透射电镜观察[4]
, 百拇医药
各组附有KMB17细胞的盖玻片，用30 ml/L戊二醛固定(4℃，30 min)和10 ml/L饿酸后固定(室温，30 min)。经梯度酒精脱水后，进行半浸润、浸润，再进行原位包埋，制成单层细胞包埋块。用LKBⅢ型超薄切片机制片，柠檬酸铅及醋酸铀双重染色，Opton EM10c透射电镜观察。选择有完整细胞核和胞质的细胞，每组6～10个，拍照并最终放大5000～10000倍。选取同样放大倍数的细胞照片，每组6张，应用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，选取等同面积的胞浆视野，分别测量该视野内线粒体(Mc)、粗面内质网(RER)及微肌丝(MF)的总面积，各型细胞器的总面积与视野面积之比即为体密度(Vv)。
1.3 免疫细胞化学染色及图像分析
小鼠抗人α-SMA和小鼠抗人PCNA单克隆抗体、LSAB试剂盒均购自北京中山公司。各组附有KMB17细胞的盖玻片，经D-Hanks液洗涤两次后，检测α-SMA者用丙酮:乙醇(1∶1)混合固定液室温固定15～20 min。检测PCNA者用10 g/L多聚甲醛室温固定5 min，继以甲醇后固定15 min(-20℃)[5]。LSAB法进行免疫细胞化学染色。图像分析采用TJTY-300图像处理软件，在相同的放大倍数(200)下，于同次实验的各组阳性片中随机选取和测定20个KMB17细胞中的阳性表达产物(α-SMA阳性表达为胞浆内呈棕色细丝状或条状产物，PCNA阳性表达产物为棕褐色，颗粒状，位于胞核内)的平均吸光度值(A)，作t检验分析。
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2 结果
2.1 各组KMB17细胞的细胞器体密度比较
N组KMB17细胞呈梭形，胞浆内有丰富的粗面内质网，线粒体和微肌丝的含量较少，无基膜存在，呈典型的成纤维细胞表型。H组与NECCM组各种细胞器体密度均与N组无显著性差异，而HECCM组线粒体体密度与上述各组无差别，但粗面内质网体密度明显降低(P<0.05)，胞浆内出现大量的微肌丝，以质膜下分布量最多，成束的微肌丝交错处有致密体形成，细胞质膜处有致密斑和不连续的基膜存在，呈现平滑肌样细胞表型(图1及表2)。
表2 各组KMB17细胞细胞器体密度比较(
, n=6) 组 别VMC
, http://www.100md.com
VRER
VMF
N
0.0980±0.0048
0.6448±0.0412*
0.1109±0.0053*
H
0.1158±0.0039
0.5331±0.0135*
0.1107±0.0065*
, http://www.100md.com
NECCM
0.0981±0.0012
0.4878±0.0209*
0.0927±0.0038*
HECCM
0.1184±0.0053
0.2388±0.0275
0.3784±0.0480
与HECCM组比较 *P<0.05 VMC：线粒体的体密度，VRER：粗面内质网的体密度，VMF：微肌丝的体密度
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2.2 各组KMB17细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达
N组KMB17细胞质内有均匀分布的细丝状或条状、淡棕褐色的α-SMA表达阳性物质，H组、NECCM组表达阳性染色强度与N组相似，差别无显著性意义。而HECCM组细胞的阳性染色为较深的棕褐色，与前3组相比，差异具极显著性意义(P<0.01)。阴性对照组细胞胞质内无染色反应阳性物质(表3)。
2.3 各组KMB17细胞中PCNA的表达
N组及NECCM组KMB17细胞中的圆形或卵圆形细胞核内有较均匀的棕色细颗粒状染色阳性物质，靠近核膜处稍多，而胞浆内几乎无阳性表达。H组和HECCM组细胞核内的阳性颗粒明显增多，核致密浓染，呈深褐色(图2)。图像分析及统计结果提示：H组、HECCM组PCNA表达明显高于N组及NECCM组，差异具极显著性意义(P<0.01)，而N与NECCM组之间，H与HECCM组之间则无明显差异(表4)。
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表3 各组KMB17细胞α-SMA的表达
(
，n=20) 组别细胞数
平均吸光度值
N
20
0.12621±0.02135*
H
20
0.13287±0.00816*
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NECCM
20
0.11542±0.00662*
HECCM
20
0.15836±0.01253
与HECCM组比较 *P<0.01
图1 HECCM组细胞内出现大量微肌丝，并有致密体形成 EM×10000
, 百拇医药
图2 H组KMB17细胞核内PCNA表达 (LSAB法) ×266
表4 各组KMB17细胞PCNA表达比较
(
, n=20) 组别细胞数
平均吸光度值
N
20
0.1914±0.0239
H
20
, 百拇医药
0.2401±0.0231*
NECCM
20
0.1882±0.0133
HECCM
20
0.2305±0.0292*
与N组及NECCM组比较 *P<0.01
3 讨论
无肌型肺小动脉(NMA)是肺循环中的重要容量型血管，在低氧和炎症等因素作用下，其管壁出现中膜平滑肌细胞，而使肺循环阻力型血管增多，容量型血管减少，导致肺动脉压的升高。有关NMA结构改建中的平滑肌细胞来源问题，最初认为是肌源性来源，即由前一级部分肌型动脉壁的平滑肌细胞增殖并向NMA迁移、伸延的结果。继之认为肌化的中膜是由血管外膜成纤维细胞或周细胞因低氧的刺激而发生增殖和向平滑肌细胞转化形成的。目前尚无定论。
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已知人胚肺成纤维细胞是一种具多向分化潜能的肺原始间叶细胞，可分化成熟为肺血管外膜或肺间质成纤维细胞，因此实验选用此细胞株代表后两种成纤维细胞。本研究在排除在体的神经体液因素影响下，证实单纯低氧和HECCM都能促进KMB17人胚肺成纤维细胞的PCNA蛋白表达增高，反映了细胞增殖的活跃现象，与文献报道一致[6]。同时也证明了只有HECCM可以促发KMB17细胞的超微结构、免疫表型具有平滑肌细胞特征，即向平滑肌样细胞分化。此为探讨低氧性肺动脉高压时，无肌型动脉肌化细胞可以来自肺血管外膜成纤维细胞提供了实验依据和干预的细胞对象。
同时我们认为此结论反映了肺血管构形特征和内皮细胞的旁分泌功能。因为组成无肌型肺动脉壁的细胞只有内皮细胞、成纤维细胞和少量周细胞，在内皮细胞基底面和成纤维细胞向腔面，均有较多的细胞微突，这些细胞突起可穿过单层弹力膜窗孔而相互接触，传递着细胞信息。已知低氧可促发内皮细胞旁分泌许多细胞因子(如ET、PDGF和TGF-β1等)[7]，这些因子可能通过受体激活信息传递途径，促进肺动脉成纤维细胞增殖、趋化或表型转变，在PVSR形成过程中起一定作用。
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注:国家“八五”攻关项目(No.85-915-03-05)
作者简介:江向宁，女，1968年生，讲师
参 考 文 献
1 Vender R L. Chronic hypoxic pulmonary hypertension. Cell biology to pathophysiology. Chest, 1994, 106: 236
2 车东媛，熊 密. 肺血管构形重建的特征和形成机制. 基础医学与临床，1996, 16(1): 17
3 江向宁，袁永辉，张婉蓉等. 猪肺动脉缺氧内皮细胞条件培养液和DDPH对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响. 同济医科大学学报，1995, 24(6): 405
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4 黄 蓓，车东媛，张婉蓉. 缺氧内皮细胞条件培养液对肺动脉平滑肌细胞表型的影响. 中华病理学杂志，1995，24(5): 306
5 Kurki P, Ogata K ，Tan E M. Monoclonal antibodies to proliferating cell nuclear antigen (PCNA)cyclin as probes for proliferating cells by immunofluorescence microscopy and flow cytometry. J Immunol Methods, 1988, 109: 49
6 Jones R C. Role of interstitial fibroblasts and intermediate cells in microvascular wall remodelling in pulmonary hypertension. Eur Respir Rev, 1993, 3: 569
7 Dawes K E, Peacock A J, Gray A J et al. Characterization of fibroblast mitogens and chemoattractants produced by endothelial cells exposed to hypoxia. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994, 10: 552
(1998-11-19 收稿)
, 百拇医药