广西、海南和云南三地微小按蚊DNA的限制酶切片段长度多态性分析
作者：田春林 石焕焕 何登贤 黄若密 李艳文
单位：广西医科大学寄生虫学教研室 南宁 530021
关键词：微小按蚊；DNA；限制酶切片段长度多态性分析
广西医科大学学报990404
摘要 目的：探讨广西、海南和云南三地微小按蚊之间的基因差异。方法：从三地单雌线蚊虫提取DNA，然后分别用Ava I、Bam HI、Pst I、Bgl I、Hinf I和Hae Ⅲ 6种限制性核酸内切酶消化，进行琼脂电泳分析。结果：三地微小按蚊的Ava I、Bam HI和Pst I酶切区带有差异，Bgl I的酶切区带完全相同，而Hinf I和Hae Ⅲ两种酶不显区带。结论：三地微小按蚊有基因结构差异，Ava I、Bam HI和Pst I 3种限制酶有鉴别意义。
中国图书资料分类法分类号 R38
, 百拇医药
RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM STUDIES ON THE ANOPHELES MINIMUS DNA FROM GUANGXI，HAINAN AND YUNNAN
Tian Chunlin，Shi Huanhuan，He Dengxian，et al
(Department of Parasitology，Guangxi Medical University，Nanning 530021)
Abstract Objective：To observe the variation in repetitive DNA of the An.Minimus from Guangxi，Hainan and Yunnan.Method：Total DNA was extracted from isofemale lines of the three strains and digested respectively with six restriction endonucleases (Ava I，Bam HI，Pst I，Bgl I，Hinf I and Hae Ⅲ).The DNA fragments were analysed by agarose gel electrophoresis coupled with ethidium bromide staining.The fluorescent DNA bands were visualized under a UV lamp and photographed.Results:Banding patterns produced by Ava I,Bam HI and Pst I show some unique DNA fragments.Bgl I digestion generally gave similar patterns.The latter two enzymes gave vague patterns (results not shown).Conclusion:In view of the variation in repetitive DNA of different area strains of An.minimus,Three enzymes(Ava I,Bam HI and Pst I) were capable of distinguishing among the three area strains.
, 百拇医药
Key words AN.minimus;DNA;RFLD
微小按蚊是东南亚和我国南方山区重要的传疟媒介，许多研究表明：微小按蚊种群内在形态、生态习性、传疟作用和对杀虫剂的敏感性等方面存在差异[1，2]。1988年Sucharit[3] 发现泰国的微小按蚊是一个复合体，含有A和C两个亲缘种，而广泛分布于我国南方山区的微小按蚊是否存在种间差异，这是我国抗疟工作者非常关心的问题。近年来，我国学者用同工酶、细胞遗传学和杂交试验等方法进行了比较研究[4～6]，但用分子生物学方法进行研究未见报道。本研究采用限制酶切片段长度多态性分析(RFLD)分析方法，对有地理间隔和海拔高度差异的广西、海南和云南三地微小按蚊，直接从基因结构上探讨它们之间的差异，为明确我国南方微小按蚊的分类和种群分布提供更多的证据。
1 材料和方法
1.1 微小按蚊：广西微小按蚊(A.m.G)采自广西凌云县伶站乡。海南微小按蚊(A.m.H)采自海南儋州市八一农场。云南微小按蚊(A.m.Y)采自云南元江县甘庄乡。在微小按蚊繁殖高峰期(6～10月)从以上三地牛房采集饱血雌蚊，鉴定后带回实验室单只产卵，按常规方法饲养驯化，建立单雌繁殖线。
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1.2 蚊DNA的提取与鉴定：分别收集三地微小按蚊新羽化成蚊，-20℃冻死，按李本文[7]方法，将蚊虫在冰浴下匀浆，然后依次用酚、氯仿和乙醇抽提，获得的基因组DNA经PE缓冲液溶解后，用紫外分光光度计测定DNA浓度，用体积分数为0.4%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA纯度。
1.3 蚊DNA限制酶消化及电泳分析：三地微小按蚊基因组DNA，分别用Ava I、Pst I、Bam HI、Bgl I、Hinf I和Hae Ⅲ 6种限制酶消化，消化条件参照文献[8]。反应体积为20 μl，温度为37℃，消化时间为1 h，每μg DNA的酶用量5～10单位，消化完毕后采用0.85%含0.5 μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物,用紫外分析仪观察结果并照相。
2 结 果
2.1纯化DNA:三地微小按蚊DNA,经琼脂糖电泳观察,均产生小部分降解的DNA碎片,小批量(50只以下)提取的蚊DNA较完整。测定纯化DNA的浓度后可推算50只成蚊可获约30 μg基因组DNA。
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2.2 6种限制酶切结果：见图1、表1。
图1 三地微小按蚊DNA的酶切带型
a 三地微小按蚊DNA的酶切带型：1 A.m.G; 2 A.m.Y; 3 A.m.H;M EcoR I；b 三地微小按蚊DNA的Pst I酶切带型：1 A.m.G; 2 A.m.Y; 3 A.m.H;M EcoR I；c 三地微小按蚊DNA的Bam HI(1,2,3)和Bgl I (4,5,6)酶切带型：M EcoR I;1,4 A.m.G; 2,5 A.m.Y 3,6 A.m.H
表1 三地微小按蚊DNA酶切片段的电泳分析 样品
限制性核酸内切酶
Ava I
Pst I
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Bam HI
Bgl I
Hinf I
Hae Ⅲ
A.m.G
1(0.85)
1(1.25)
2(0.7,0.25)
4(5.7,3.5,0.75,0.5)
-
-
A.m.Y
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3(3.5,0.85,0.5)
-
3(6.6,0.7,0.25)
4(5.7,3.5,0.75,0.5)
-
-
A.m.H
1(3.5)
1(1.25)
-
4(5.7,3.5,0.75,0.5)
-
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-
注：DNA酶切片段长度单位为Kb 在Ava I的酶切带型中，可见A.m.G显一条区带(0.85 Kb),A.m.H显一条区带(3.5 Kb),而A.m.Y显三条区带(3.5，0.85，0.5 Kb)。Pst I酶切带型中，A.m.G和A.m.H均显一条区带(1.25 Kb),而A.m.Y不显区带。Bam HI的酶切带型中，A.m.G显二条区带(0.7，0.25 Kb)，A.m.H不显区带,A.m.Y可见三条区带(6.6，0.7,0.25 Kb)。用Bgl I消化，可见三地微小按蚊均显四条区带(5.7,3.5,0.75,0.5 Kb)。用Hinf I和Hae Ⅲ消化，三地微小按蚊未见重复DNA区带。
3 讨 论
随着分子生物学技术的发展，以DNA为基础的媒介昆虫鉴定方法已得到推广应用。对蚊虫的核酸进行限制酶切片段长度多态性(RFLD)分析，就是利用媒介昆虫具有高度的DNA重复序列，在限制性核酸内切酶的作用下，可产生一系列大小不同的DNA酶切片段，用电泳分析消化产物，比较带型差异，将不同虫种区分开来。Sukkid等[9]应用7种限制酶对大劣按蚊4个姐妹种进行RFLD分析，具有明显鉴别意义。李本文等[10]用3种限制酶对赫坎按蚊种内5个亲缘种进行RFLD比较，结果显示重复DNA序列的带型完全能够将其区别。
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微小按蚊广泛分布于我国南方，是否存在种间差异，是我国抗疟工作者非常关心的问题。本实验选用有地理间隔和海拔高度差异的广西、海南和云南三地微小按蚊进行RFLD分析，从结果中可以看出：三地微小按蚊的Bgl I酶切区带完全相同，均显四条区带，并且在其他的限制酶切区带中，相互之间具有共同区带，这表明三地微小按蚊在分类上具有密切的亲缘关系。Hinf I和Hae Ⅲ限制酶消化不显区带，可能是生物学原因，也可能是技术原因。在Ava I和Bam HI酶切区带中，三地微小按蚊之间有明显差异，完全可以将它们互相区分开来。因此，这两种限制酶在三地微小按蚊的鉴别上有很重要的应用价值。此外，三地蚊虫区带的差异也说明了它们之间已有基因分化。在Pst I酶切区带中，可以看到广西和海南微小按蚊均显一条相同的区带，而云南微小按蚊不显区带，提示广西与海南微小按蚊的基因差异小些，而云南微小按蚊具有较明显的基因分化。三地微小按蚊之间的基因差异，是否达到种间差异，需待进一步证实。Curran等[11]认为，重复DNA序列的RFLD与种间自然杂交的能力直接有关。叶奕英[6]曾对广西和云南两地的微小按蚊作杂交试验，结果显示两地微小按蚊有部分生殖隔离现象，这一结果与本实验结果相符，提示了广西和云南两地微小按蚊很可能出现种间分化。
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参考文献
1 愈 渊,李明馨.海南岛微小按蚊Anopheles (cellia) Minimus Theobald,1901类型的研究.寄生虫学与寄生虫病杂志,1984,2(2):95
2 吴开琛,陈文江,王志光,等.海南省当前微小按蚊的分布特征、生态习性和传疟作用的研究.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1993，11(2)：120
3 Sucharit S,Komalamisra N，Leemingsawat S，et al.Population genetic studies of the Anopheles minimus complex in Thailand.Southeast Asian J Trop Pub Hlth,1988,19(4)717
4 蒋成山,刘祖洞,愈 渊,等.微小按蚊非特异性酯酶同工酶的研究.昆虫学报,1987,30(3):229
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5 石裕明,叶奕英.广西微小按蚊卵巢营养细胞多线染色体的观察.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1990,8(2):117
6 叶奕英,许政拱,黄若密,等.广西和云南两地微小按蚊的杂交试验.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1992,10(4):287
7 李本文,潘家复,卢惠霖,等.介绍一种检测蚊虫DNA重复序列的方法.湖南医科大学学报,1989,14(4):402
8 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:A Lab manual New York.Cold Spring Harbor Laboratory,1986,468
9 Sukkid Y,Sakol P,Ronald R,et al.Diagnostic restriction fragment patterns of DNA from the four isomorphic species of anopheles dirus.Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth,1988,9(4)：703
10 李本文,卢惠霖,姚开泰,等.赫坎按蚊种团各亲缘种间基因组重复DNA的限制酶切长度差异.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ,1991,8(1):8
11 Curran J,Baillie DL,Webster JM.Use of genomic Dna Restriction fragment length differences to identify nematode species.Parasitology,1985,90:137
收稿日期：1999-01-21, 百拇医药
单位：广西医科大学寄生虫学教研室 南宁 530021
关键词：微小按蚊；DNA；限制酶切片段长度多态性分析
广西医科大学学报990404
摘要 目的：探讨广西、海南和云南三地微小按蚊之间的基因差异。方法：从三地单雌线蚊虫提取DNA，然后分别用Ava I、Bam HI、Pst I、Bgl I、Hinf I和Hae Ⅲ 6种限制性核酸内切酶消化，进行琼脂电泳分析。结果：三地微小按蚊的Ava I、Bam HI和Pst I酶切区带有差异，Bgl I的酶切区带完全相同，而Hinf I和Hae Ⅲ两种酶不显区带。结论：三地微小按蚊有基因结构差异，Ava I、Bam HI和Pst I 3种限制酶有鉴别意义。
中国图书资料分类法分类号 R38
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RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM STUDIES ON THE ANOPHELES MINIMUS DNA FROM GUANGXI，HAINAN AND YUNNAN
Tian Chunlin，Shi Huanhuan，He Dengxian，et al
(Department of Parasitology，Guangxi Medical University，Nanning 530021)
Abstract Objective：To observe the variation in repetitive DNA of the An.Minimus from Guangxi，Hainan and Yunnan.Method：Total DNA was extracted from isofemale lines of the three strains and digested respectively with six restriction endonucleases (Ava I，Bam HI，Pst I，Bgl I，Hinf I and Hae Ⅲ).The DNA fragments were analysed by agarose gel electrophoresis coupled with ethidium bromide staining.The fluorescent DNA bands were visualized under a UV lamp and photographed.Results:Banding patterns produced by Ava I,Bam HI and Pst I show some unique DNA fragments.Bgl I digestion generally gave similar patterns.The latter two enzymes gave vague patterns (results not shown).Conclusion:In view of the variation in repetitive DNA of different area strains of An.minimus,Three enzymes(Ava I,Bam HI and Pst I) were capable of distinguishing among the three area strains.
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Key words AN.minimus;DNA;RFLD
微小按蚊是东南亚和我国南方山区重要的传疟媒介，许多研究表明：微小按蚊种群内在形态、生态习性、传疟作用和对杀虫剂的敏感性等方面存在差异[1，2]。1988年Sucharit[3] 发现泰国的微小按蚊是一个复合体，含有A和C两个亲缘种，而广泛分布于我国南方山区的微小按蚊是否存在种间差异，这是我国抗疟工作者非常关心的问题。近年来，我国学者用同工酶、细胞遗传学和杂交试验等方法进行了比较研究[4～6]，但用分子生物学方法进行研究未见报道。本研究采用限制酶切片段长度多态性分析(RFLD)分析方法，对有地理间隔和海拔高度差异的广西、海南和云南三地微小按蚊，直接从基因结构上探讨它们之间的差异，为明确我国南方微小按蚊的分类和种群分布提供更多的证据。
1 材料和方法
1.1 微小按蚊：广西微小按蚊(A.m.G)采自广西凌云县伶站乡。海南微小按蚊(A.m.H)采自海南儋州市八一农场。云南微小按蚊(A.m.Y)采自云南元江县甘庄乡。在微小按蚊繁殖高峰期(6～10月)从以上三地牛房采集饱血雌蚊，鉴定后带回实验室单只产卵，按常规方法饲养驯化，建立单雌繁殖线。
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1.2 蚊DNA的提取与鉴定：分别收集三地微小按蚊新羽化成蚊，-20℃冻死，按李本文[7]方法，将蚊虫在冰浴下匀浆，然后依次用酚、氯仿和乙醇抽提，获得的基因组DNA经PE缓冲液溶解后，用紫外分光光度计测定DNA浓度，用体积分数为0.4%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA纯度。
1.3 蚊DNA限制酶消化及电泳分析：三地微小按蚊基因组DNA，分别用Ava I、Pst I、Bam HI、Bgl I、Hinf I和Hae Ⅲ 6种限制酶消化，消化条件参照文献[8]。反应体积为20 μl，温度为37℃，消化时间为1 h，每μg DNA的酶用量5～10单位，消化完毕后采用0.85%含0.5 μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物,用紫外分析仪观察结果并照相。
2 结 果
2.1纯化DNA:三地微小按蚊DNA,经琼脂糖电泳观察,均产生小部分降解的DNA碎片,小批量(50只以下)提取的蚊DNA较完整。测定纯化DNA的浓度后可推算50只成蚊可获约30 μg基因组DNA。
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2.2 6种限制酶切结果：见图1、表1。
图1 三地微小按蚊DNA的酶切带型
a 三地微小按蚊DNA的酶切带型：1 A.m.G; 2 A.m.Y; 3 A.m.H;M EcoR I；b 三地微小按蚊DNA的Pst I酶切带型：1 A.m.G; 2 A.m.Y; 3 A.m.H;M EcoR I；c 三地微小按蚊DNA的Bam HI(1,2,3)和Bgl I (4,5,6)酶切带型：M EcoR I;1,4 A.m.G; 2,5 A.m.Y 3,6 A.m.H
表1 三地微小按蚊DNA酶切片段的电泳分析 样品
限制性核酸内切酶
Ava I
Pst I
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Bam HI
Bgl I
Hinf I
Hae Ⅲ
A.m.G
1(0.85)
1(1.25)
2(0.7,0.25)
4(5.7,3.5,0.75,0.5)
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A.m.Y
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3(3.5,0.85,0.5)
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3(6.6,0.7,0.25)
4(5.7,3.5,0.75,0.5)
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A.m.H
1(3.5)
1(1.25)
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4(5.7,3.5,0.75,0.5)
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注：DNA酶切片段长度单位为Kb 在Ava I的酶切带型中，可见A.m.G显一条区带(0.85 Kb),A.m.H显一条区带(3.5 Kb),而A.m.Y显三条区带(3.5，0.85，0.5 Kb)。Pst I酶切带型中，A.m.G和A.m.H均显一条区带(1.25 Kb),而A.m.Y不显区带。Bam HI的酶切带型中，A.m.G显二条区带(0.7，0.25 Kb)，A.m.H不显区带,A.m.Y可见三条区带(6.6，0.7,0.25 Kb)。用Bgl I消化，可见三地微小按蚊均显四条区带(5.7,3.5,0.75,0.5 Kb)。用Hinf I和Hae Ⅲ消化，三地微小按蚊未见重复DNA区带。
3 讨 论
随着分子生物学技术的发展，以DNA为基础的媒介昆虫鉴定方法已得到推广应用。对蚊虫的核酸进行限制酶切片段长度多态性(RFLD)分析，就是利用媒介昆虫具有高度的DNA重复序列，在限制性核酸内切酶的作用下，可产生一系列大小不同的DNA酶切片段，用电泳分析消化产物，比较带型差异，将不同虫种区分开来。Sukkid等[9]应用7种限制酶对大劣按蚊4个姐妹种进行RFLD分析，具有明显鉴别意义。李本文等[10]用3种限制酶对赫坎按蚊种内5个亲缘种进行RFLD比较，结果显示重复DNA序列的带型完全能够将其区别。
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微小按蚊广泛分布于我国南方，是否存在种间差异，是我国抗疟工作者非常关心的问题。本实验选用有地理间隔和海拔高度差异的广西、海南和云南三地微小按蚊进行RFLD分析，从结果中可以看出：三地微小按蚊的Bgl I酶切区带完全相同，均显四条区带，并且在其他的限制酶切区带中，相互之间具有共同区带，这表明三地微小按蚊在分类上具有密切的亲缘关系。Hinf I和Hae Ⅲ限制酶消化不显区带，可能是生物学原因，也可能是技术原因。在Ava I和Bam HI酶切区带中，三地微小按蚊之间有明显差异，完全可以将它们互相区分开来。因此，这两种限制酶在三地微小按蚊的鉴别上有很重要的应用价值。此外，三地蚊虫区带的差异也说明了它们之间已有基因分化。在Pst I酶切区带中，可以看到广西和海南微小按蚊均显一条相同的区带，而云南微小按蚊不显区带，提示广西与海南微小按蚊的基因差异小些，而云南微小按蚊具有较明显的基因分化。三地微小按蚊之间的基因差异，是否达到种间差异，需待进一步证实。Curran等[11]认为，重复DNA序列的RFLD与种间自然杂交的能力直接有关。叶奕英[6]曾对广西和云南两地的微小按蚊作杂交试验，结果显示两地微小按蚊有部分生殖隔离现象，这一结果与本实验结果相符，提示了广西和云南两地微小按蚊很可能出现种间分化。
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参考文献
1 愈 渊,李明馨.海南岛微小按蚊Anopheles (cellia) Minimus Theobald,1901类型的研究.寄生虫学与寄生虫病杂志,1984,2(2):95
2 吴开琛,陈文江,王志光,等.海南省当前微小按蚊的分布特征、生态习性和传疟作用的研究.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1993，11(2)：120
3 Sucharit S,Komalamisra N，Leemingsawat S，et al.Population genetic studies of the Anopheles minimus complex in Thailand.Southeast Asian J Trop Pub Hlth,1988,19(4)717
4 蒋成山,刘祖洞,愈 渊,等.微小按蚊非特异性酯酶同工酶的研究.昆虫学报,1987,30(3):229
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5 石裕明,叶奕英.广西微小按蚊卵巢营养细胞多线染色体的观察.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1990,8(2):117
6 叶奕英,许政拱,黄若密,等.广西和云南两地微小按蚊的杂交试验.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1992,10(4):287
7 李本文,潘家复,卢惠霖,等.介绍一种检测蚊虫DNA重复序列的方法.湖南医科大学学报,1989,14(4):402
8 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:A Lab manual New York.Cold Spring Harbor Laboratory,1986,468
9 Sukkid Y,Sakol P,Ronald R,et al.Diagnostic restriction fragment patterns of DNA from the four isomorphic species of anopheles dirus.Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth,1988,9(4)：703
10 李本文,卢惠霖,姚开泰,等.赫坎按蚊种团各亲缘种间基因组重复DNA的限制酶切长度差异.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ,1991,8(1):8
11 Curran J,Baillie DL,Webster JM.Use of genomic Dna Restriction fragment length differences to identify nematode species.Parasitology,1985,90:137
收稿日期：1999-01-21, 百拇医药