丙肝病毒非结构4区和5区抗原的克隆表达及纯化鉴定
作者：李越希 周宗安 陶开华 乔仁良 邓小昭 郑纪山 仲晓萍
单位：南京军区军事医学研究所，南京210002
关键词：丙型肝炎病毒；非结构区蛋白；基因表达；蛋白纯化
药物生物技术990402
摘 要 通过分析丙肝病毒(HCV)的非结构4区(NS4)和5区(NS5)蛋白的氨基酸序列，推测确定抗原决定簇位点。用RT-PCR技术从中国丙肝病人血清中扩增克隆含抗原决定簇基因的NS4及NS5基因，将该两段基因分别克隆至质粒表达载体pET28a(+)内，转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建成功了高效表达NS4和NS5蛋白的工程菌，IPTG诱导后两蛋白在工程菌内的表达量分别约占菌体蛋白的33%和28%。经Sepharcryl S-200分子筛及Ni-NTA Sepharose螯合层析纯化，获得了较纯的重组NS4和NS5蛋白。用纯化的NS4和NS5蛋白作抗原ELISA法检测HCV抗体阴、阳性血清，证实它们有较好的抗原性和特异性。
, 百拇医药
Expression of HCV NS4 and NS5 Gene Fragments and
Identification of the Expressed Proteins
Li Yuexi， Zhou Zongan， Tao Kaihua， et al
(East-China Institute for Medical Biotechniques, Nanjing 210002)
Abstract The NS4 and NS5 gene fragments of hepatitis C virus were cloned from anti-HCV positive sera by RT-PCR, the recombinant plasmids expressing NS4 or NS5protein were constructed by inserting the cloned NS4 or NS5 gene fragme nts into plasmid vector pET28a(+), the expressed NS4 protein is about 33% of total host (E.coli BL21) proteins, and the NS5 is about 28%. After purification, the expressed NS4 and NS5 protein were used to detect 87 anti-HCV (anti-HCV core and or NS3 antigen) positive sera and 160 a nti-HCV(anti-core and NS3 antigens) negative sera, of the 87 positive sera, 28(31%) sera are anti-NS4 positive and 62(70%) sera are anti-NS5positive; of the 160 negative sera, 2 sera are anti-NS4 weak positive and 1 serum is anti-NS5 weak positive. The results suggest that the NS4 and NS5 prot eins have excellent antigenicity and specificity, and may increase the detection rate of anti-HCV when being added in ELISA kit for detection of anti-HCV.
, 百拇医药
Key Words Hepatitis C virus, Non-structural protein, Gene expression, Protein purification
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, 简写HCV)在我国人群中的感染率约为2%，其主要传播途径是经血传播。由于目前无治疗HCV感染的特效药物，所以对HCV的感染者进行早期检测，防止其经血或其它途径传播HCV，是目前阻断HCV传播、降低HCV感染率的主要途径。
目前检测HCV感染的主要方法是检测血清中的HCV抗体。而检测HCV抗体需要优质HCV抗原。从1989年Choo⑴首次证实HCV为一种单股正链RNA病毒至今，检测HCV抗体的ELISA试剂已经历了三代，这三代试剂的主要差别是使用的抗原逐代增加，1990年Chiron公司研制成功的第一代HCV抗体检测试剂仅用了一个HCV抗原片段(融合有人SOD的部分NS4抗原)，第二代试剂(1992年)以重组HCV核心抗原和非结构3区(NS3)抗原为主，第三代试剂(1995年)则使用了四种重组抗原(核心抗原，NS3、NS4及NS5抗原)，因此试剂的敏感性和特异性逐步提高。
, 百拇医药
从1990年开始，我们开始对HCV的分子生物学及检测技术进行系列研究，先后克隆表达了重组HCV核心抗原⑵和NS3抗原⑶，并用之研制成功第二代HCV抗体检测试剂(1993年)。为了研制第三代HCV抗体检测试剂，1995年，我们开始筛选克隆表达HCVNS4及NS5抗原，并进行了纯化应用。
1 材料与方法
1.1 菌种与质粒
表达载体pET28a(+)和宿主菌BL21(DE3)由本实验室保存。
1.2 分子生物学试剂
各种限制性内切酶、T4DNA连接酶为美国Biolabs公司或Promega公司产品。DeepVentTaqDNA聚合酶为Biolabs公司产品。dNTP、IPTG、琼脂糖及逆转录酶(AMV)为Promega公司产品。质粒纯化试剂盒、DNA电泳产物纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、及Ni-NTASepharose凝胶为德国QIAGEN公司产品。SepharcrylS-200凝胶为瑞典Pharmacia公司产品。其余使用的分子生物学试剂均为进口或国产分析纯以上级产品。
, 百拇医药
1.3 酶联反应材料
酶联反应板为丹麦产NuncC-8板，酶标(HRP)鼠抗人IgG单抗由军事医学科学院三所提供，底物TMB为苏州大学产品。
1.4 HCV抗体阳性血清
由江苏省卫生防疫站、安徽省高桥血站及南京军区总医院提供。
1.5 HCVRNA纯化
按异硫氰酸胍/酚/氯仿法纯化，纯化的HCVRNA溶于DEPC处理过的去离子水中，置-20℃冻存。
1.6 RT-PCR引物的设计合成
用于扩增NS4基因片段的外引物对为:P1:5′-GTAGGATTGTCTTGTCCGG-3'(5050～5069bp),P2:5'-ATCAGCCGGTTCATCCACTG-3'(5740～5759bp)；内引物对为：P3:5'-ACAGGGAAGTTCTTTACCAAG-3'(5090～5110bp)，P4:5'-ACGTGTCGGCGCAGTATTGC-3'(5698～5717bp)。用于扩增NS5基因片段的外引物对为P5:5'-TCCACTTCGTGACGGGCATG-3'(6296～6315bp)，P6:5'-ACTCACGGTAGACCAGGACCC-3'(7207～7227bp)；内引物对为：P7:5'-CAGTACCTGGTCGGGTCACAG-3'(6458～6478bp)，P8:5'-GGAGGAGTACGACTCAACGTC-3'(7140～7160bp)。
, 百拇医药
1.7 RT-PCR反应
以提取的HCVRNA为模板，加逆转录酶(AMV)后，先置37℃30min，再置42℃逆转录2h。置95℃10min灭活逆转录酶。扩增NS4基因时逆转录引物用P2，扩增NS5基因时逆转录引物用P6。分别取少量逆转录产物(5μl)，用于套式PCR扩增NS4和NS5基因片段。扩增NS4基因时，先用外引物对P1和P2扩增，取少量PCR产物(2μl)，以此为模板再用内引物对P3和P4进行扩增，两次扩增条件相同，均为94℃30s、55℃30s、72℃30s，扩增30个循环，最后一轮72℃延伸14min。PCR扩增NS5基因片段时，以引物P6的逆转录产物(5.0μl)为模板，先用P5和P6外引物对扩增，取少量PCR产物(2.0μl)，再用P7和P8内引物对扩增。扩增条件同扩增NS4基因的条件。
, 百拇医药
1.8 常规分子生物学方法
DNA的酶切、连接、电泳，质粒的纯化、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法参照“MolecularCloning”一书⑷。
1.9 表达HCVNS4和NS5蛋白的纯化
表达的NS4和NS5蛋白均分别先用SepharcrylS-200分子筛纯化，再用Ni-NTASepharose螯合层析纯化(具体纯化条件另文发表)。
1.10 纯化NS4和NS5抗原的鉴定
将纯化获得的NS4和NS5抗原梯度稀释后包被酶联板，封闭后用常规间接ELISA检测HCV抗体阴、阳性血清，检测其抗原性和特异性。
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2 结 果
2.1 RT-PCR扩增结果
将NS4和NS5基因的PCR扩增产物用2%琼脂糖(内含EB染料)电泳检测，紫外灯下观察，均扩增出了一条特异的DNA片段，大小与预期结果相符合。见图1。
A：1.Amplyfied NS4 gene fragment by RT-PCR
2.DNA markers
B：1.Amplyfied NS5 gene fragment by RT-PCR
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2.DNA markers
Fig 1 Analysis of PCR products in 2% agarose
2.2 表达NS4或NS5基因片段的重组质粒构建
纯化扩增的NS4和NS5基因片段，首先克隆至质粒T载体内，分别用引物对P3、P4和引物对P7、P8，PCR扩增筛选含NS4或NS5基因片段的重组载体。转化宿主菌，提取制备含NS4或NS5基因片段的T载体。
为了使NS4基因和NS5基因克隆至表达载体PET28a(+)内，重新合成了两对PCR引物，分别在上游引物上增加了NdeI酶切位点及起始密码子ATG，在下游引物上增加了BamHI酶切位点及终止密码子TAA，用于扩增NS4基因的引物对为：P9:5'-GATCTCATATGAGGGAAGTTCTTTACCAAG-3'、P10:5'-GCGGATCCTTAGTGTCGGCGCAGTATTGC-3'；用于扩增NS5基因的引物对为：P11:5'-GATCTCATATGTACCTGGTCGGGTCACAG-3',P12:5'-AACGTCGGATCCTTAGTCGCC-3'。
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用P9和P10引物对，以含有NS4基因片段的T载体为模板，PCR扩增NS4基因片段；用P11和P12引物对，以含有NS5基因片段的T载体为模板，PCR扩增出NS5基因片段。将扩增的NS4和NS5基因片段，纯化后分别用NdeI和BamHI双酶切，分别克隆至质粒表达载体pET28a(+)的NdeI和BamHI位点(见图2)。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用PCR扩增筛选获得含重组质粒的工程菌。
Fig 2 Construction of the recombinant plasmid
2.3 工程菌的诱导表达
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将PCR扩增筛选获得的含有NS4基因或含有NS5基因的重组菌接种LB培养基培养(37℃)，培养液A600值约为0.6时，加1mmol/LIPTG诱导5h。取培养菌1ml离心收菌，用12%SDS-PAGE检测NS4蛋白或NS5蛋白的表达水平。结果显示，NS4蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的33%(见图3)，NS5蛋白的表达量为28%(见图4)。
1.Protein markers
2.The control E.coli
3.～5.The E.coli expressing NS4 protein
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Fig 3 Analysis of the E coli expressing NS4 protein by 12%SDS-PAGE
1.Protein markers
2.The purified NS5 protein
3.The E.coli expressing NS5 protein
4.The control E.coli
Fig 4 Analysis of the E coli expressing NS5 protein by 12%SDS-PAGE
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2.4 表达NS4及NS5蛋白的纯化及鉴定
表达的NS4和NS5蛋白经Sephacryl S-200分子筛和Ni-NTA Sepharose螯合层析纯化后，包被酶联反应板，检测已确定的87份HCV抗体血清(HCV核心抗体和NS3抗体单独或共同阳性)和160份阴性血清(核心抗体及NS3抗体阴性)，87份阳性血清中NS4抗体阳性28份(阳性率31%)，NS5抗体慢性62份(阳性率70%)。而160份阴性血清中，检出2份NS4抗体弱阳性，1份NS5抗体弱阳性。说明纯化的NS4和NS5蛋白均有较好的抗原性和特异性。
3 讨 论
国外研制成功的第三代丙肝病毒抗体检测试剂中增加了NS4及NS5抗原，使试剂的检出率有所提高，说明丙肝病人血清中可能存在单独NS4或NS5抗体阳性的血清。所以我国HCV抗体检测试剂也应增加NS4及NS5抗原。
, 百拇医药
本研究克隆表达的HCV NS4及NS5抗原，在两个抗原的N端均增加了载体上的6个组氨酸，这6个组氨酸不会引起非特异性，并且使表达的NS4及NS5抗原较易纯化。
用纯化的NS4抗原或NS5抗原分别检测已知HCV核心抗体或NS3抗体阳性的血清，阳性率分别为31%和70%，提示NS5抗原比NS4抗原的抗原性强，对HCV抗体的检出率高。本文中的160份阴性血清，是由第二代试剂盒检测过的高值阴性血清，我们用HCV核心抗原和NS3抗原共同检测亦为阴性，而用表达的NS4抗原检出2份弱阳性，用表达的NS5抗原检出1份弱阳性，提示丙肝病人血清中存在有单独NS4或单独NS5抗体阳性的血清。初步说明，试剂盒增加表达的NS4抗原和NS5抗原会提高抗体检出率。
, 百拇医药
全军青年基金课题：编号96Q12
参考文献
1 Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA clon ederived from a blood borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 1 989;244:1
2 李越希，唐家琪，史江，等.丙型肝炎病核心蛋白基因在大肠杆菌内的表达及应用，中国病毒学，1994;9(1):18
3 李越希，唐家琪，陶开华，等.丙型肝炎病毒非结构3区基因片段的克隆表达及抗原纯 化鉴定，中国病毒学，1994;9(4):297
4 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular cloning 2nd ed. New York, USA: Cold spring habobly laboratory press, 1989
收稿日期：1999-09-23, 百拇医药
单位：南京军区军事医学研究所，南京210002
关键词：丙型肝炎病毒；非结构区蛋白；基因表达；蛋白纯化
药物生物技术990402
摘 要 通过分析丙肝病毒(HCV)的非结构4区(NS4)和5区(NS5)蛋白的氨基酸序列，推测确定抗原决定簇位点。用RT-PCR技术从中国丙肝病人血清中扩增克隆含抗原决定簇基因的NS4及NS5基因，将该两段基因分别克隆至质粒表达载体pET28a(+)内，转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建成功了高效表达NS4和NS5蛋白的工程菌，IPTG诱导后两蛋白在工程菌内的表达量分别约占菌体蛋白的33%和28%。经Sepharcryl S-200分子筛及Ni-NTA Sepharose螯合层析纯化，获得了较纯的重组NS4和NS5蛋白。用纯化的NS4和NS5蛋白作抗原ELISA法检测HCV抗体阴、阳性血清，证实它们有较好的抗原性和特异性。
, 百拇医药
Expression of HCV NS4 and NS5 Gene Fragments and
Identification of the Expressed Proteins
Li Yuexi， Zhou Zongan， Tao Kaihua， et al
(East-China Institute for Medical Biotechniques, Nanjing 210002)
Abstract The NS4 and NS5 gene fragments of hepatitis C virus were cloned from anti-HCV positive sera by RT-PCR, the recombinant plasmids expressing NS4 or NS5protein were constructed by inserting the cloned NS4 or NS5 gene fragme nts into plasmid vector pET28a(+), the expressed NS4 protein is about 33% of total host (E.coli BL21) proteins, and the NS5 is about 28%. After purification, the expressed NS4 and NS5 protein were used to detect 87 anti-HCV (anti-HCV core and or NS3 antigen) positive sera and 160 a nti-HCV(anti-core and NS3 antigens) negative sera, of the 87 positive sera, 28(31%) sera are anti-NS4 positive and 62(70%) sera are anti-NS5positive; of the 160 negative sera, 2 sera are anti-NS4 weak positive and 1 serum is anti-NS5 weak positive. The results suggest that the NS4 and NS5 prot eins have excellent antigenicity and specificity, and may increase the detection rate of anti-HCV when being added in ELISA kit for detection of anti-HCV.
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Key Words Hepatitis C virus, Non-structural protein, Gene expression, Protein purification
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, 简写HCV)在我国人群中的感染率约为2%，其主要传播途径是经血传播。由于目前无治疗HCV感染的特效药物，所以对HCV的感染者进行早期检测，防止其经血或其它途径传播HCV，是目前阻断HCV传播、降低HCV感染率的主要途径。
目前检测HCV感染的主要方法是检测血清中的HCV抗体。而检测HCV抗体需要优质HCV抗原。从1989年Choo⑴首次证实HCV为一种单股正链RNA病毒至今，检测HCV抗体的ELISA试剂已经历了三代，这三代试剂的主要差别是使用的抗原逐代增加，1990年Chiron公司研制成功的第一代HCV抗体检测试剂仅用了一个HCV抗原片段(融合有人SOD的部分NS4抗原)，第二代试剂(1992年)以重组HCV核心抗原和非结构3区(NS3)抗原为主，第三代试剂(1995年)则使用了四种重组抗原(核心抗原，NS3、NS4及NS5抗原)，因此试剂的敏感性和特异性逐步提高。
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从1990年开始，我们开始对HCV的分子生物学及检测技术进行系列研究，先后克隆表达了重组HCV核心抗原⑵和NS3抗原⑶，并用之研制成功第二代HCV抗体检测试剂(1993年)。为了研制第三代HCV抗体检测试剂，1995年，我们开始筛选克隆表达HCVNS4及NS5抗原，并进行了纯化应用。
1 材料与方法
1.1 菌种与质粒
表达载体pET28a(+)和宿主菌BL21(DE3)由本实验室保存。
1.2 分子生物学试剂
各种限制性内切酶、T4DNA连接酶为美国Biolabs公司或Promega公司产品。DeepVentTaqDNA聚合酶为Biolabs公司产品。dNTP、IPTG、琼脂糖及逆转录酶(AMV)为Promega公司产品。质粒纯化试剂盒、DNA电泳产物纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、及Ni-NTASepharose凝胶为德国QIAGEN公司产品。SepharcrylS-200凝胶为瑞典Pharmacia公司产品。其余使用的分子生物学试剂均为进口或国产分析纯以上级产品。
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1.3 酶联反应材料
酶联反应板为丹麦产NuncC-8板，酶标(HRP)鼠抗人IgG单抗由军事医学科学院三所提供，底物TMB为苏州大学产品。
1.4 HCV抗体阳性血清
由江苏省卫生防疫站、安徽省高桥血站及南京军区总医院提供。
1.5 HCVRNA纯化
按异硫氰酸胍/酚/氯仿法纯化，纯化的HCVRNA溶于DEPC处理过的去离子水中，置-20℃冻存。
1.6 RT-PCR引物的设计合成
用于扩增NS4基因片段的外引物对为:P1:5′-GTAGGATTGTCTTGTCCGG-3'(5050～5069bp),P2:5'-ATCAGCCGGTTCATCCACTG-3'(5740～5759bp)；内引物对为：P3:5'-ACAGGGAAGTTCTTTACCAAG-3'(5090～5110bp)，P4:5'-ACGTGTCGGCGCAGTATTGC-3'(5698～5717bp)。用于扩增NS5基因片段的外引物对为P5:5'-TCCACTTCGTGACGGGCATG-3'(6296～6315bp)，P6:5'-ACTCACGGTAGACCAGGACCC-3'(7207～7227bp)；内引物对为：P7:5'-CAGTACCTGGTCGGGTCACAG-3'(6458～6478bp)，P8:5'-GGAGGAGTACGACTCAACGTC-3'(7140～7160bp)。
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1.7 RT-PCR反应
以提取的HCVRNA为模板，加逆转录酶(AMV)后，先置37℃30min，再置42℃逆转录2h。置95℃10min灭活逆转录酶。扩增NS4基因时逆转录引物用P2，扩增NS5基因时逆转录引物用P6。分别取少量逆转录产物(5μl)，用于套式PCR扩增NS4和NS5基因片段。扩增NS4基因时，先用外引物对P1和P2扩增，取少量PCR产物(2μl)，以此为模板再用内引物对P3和P4进行扩增，两次扩增条件相同，均为94℃30s、55℃30s、72℃30s，扩增30个循环，最后一轮72℃延伸14min。PCR扩增NS5基因片段时，以引物P6的逆转录产物(5.0μl)为模板，先用P5和P6外引物对扩增，取少量PCR产物(2.0μl)，再用P7和P8内引物对扩增。扩增条件同扩增NS4基因的条件。
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1.8 常规分子生物学方法
DNA的酶切、连接、电泳，质粒的纯化、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法参照“MolecularCloning”一书⑷。
1.9 表达HCVNS4和NS5蛋白的纯化
表达的NS4和NS5蛋白均分别先用SepharcrylS-200分子筛纯化，再用Ni-NTASepharose螯合层析纯化(具体纯化条件另文发表)。
1.10 纯化NS4和NS5抗原的鉴定
将纯化获得的NS4和NS5抗原梯度稀释后包被酶联板，封闭后用常规间接ELISA检测HCV抗体阴、阳性血清，检测其抗原性和特异性。
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2 结 果
2.1 RT-PCR扩增结果
将NS4和NS5基因的PCR扩增产物用2%琼脂糖(内含EB染料)电泳检测，紫外灯下观察，均扩增出了一条特异的DNA片段，大小与预期结果相符合。见图1。
A：1.Amplyfied NS4 gene fragment by RT-PCR
2.DNA markers
B：1.Amplyfied NS5 gene fragment by RT-PCR
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2.DNA markers
Fig 1 Analysis of PCR products in 2% agarose
2.2 表达NS4或NS5基因片段的重组质粒构建
纯化扩增的NS4和NS5基因片段，首先克隆至质粒T载体内，分别用引物对P3、P4和引物对P7、P8，PCR扩增筛选含NS4或NS5基因片段的重组载体。转化宿主菌，提取制备含NS4或NS5基因片段的T载体。
为了使NS4基因和NS5基因克隆至表达载体PET28a(+)内，重新合成了两对PCR引物，分别在上游引物上增加了NdeI酶切位点及起始密码子ATG，在下游引物上增加了BamHI酶切位点及终止密码子TAA，用于扩增NS4基因的引物对为：P9:5'-GATCTCATATGAGGGAAGTTCTTTACCAAG-3'、P10:5'-GCGGATCCTTAGTGTCGGCGCAGTATTGC-3'；用于扩增NS5基因的引物对为：P11:5'-GATCTCATATGTACCTGGTCGGGTCACAG-3',P12:5'-AACGTCGGATCCTTAGTCGCC-3'。
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用P9和P10引物对，以含有NS4基因片段的T载体为模板，PCR扩增NS4基因片段；用P11和P12引物对，以含有NS5基因片段的T载体为模板，PCR扩增出NS5基因片段。将扩增的NS4和NS5基因片段，纯化后分别用NdeI和BamHI双酶切，分别克隆至质粒表达载体pET28a(+)的NdeI和BamHI位点(见图2)。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用PCR扩增筛选获得含重组质粒的工程菌。
Fig 2 Construction of the recombinant plasmid
2.3 工程菌的诱导表达
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将PCR扩增筛选获得的含有NS4基因或含有NS5基因的重组菌接种LB培养基培养(37℃)，培养液A600值约为0.6时，加1mmol/LIPTG诱导5h。取培养菌1ml离心收菌，用12%SDS-PAGE检测NS4蛋白或NS5蛋白的表达水平。结果显示，NS4蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的33%(见图3)，NS5蛋白的表达量为28%(见图4)。
1.Protein markers
2.The control E.coli
3.～5.The E.coli expressing NS4 protein
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Fig 3 Analysis of the E coli expressing NS4 protein by 12%SDS-PAGE
1.Protein markers
2.The purified NS5 protein
3.The E.coli expressing NS5 protein
4.The control E.coli
Fig 4 Analysis of the E coli expressing NS5 protein by 12%SDS-PAGE
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2.4 表达NS4及NS5蛋白的纯化及鉴定
表达的NS4和NS5蛋白经Sephacryl S-200分子筛和Ni-NTA Sepharose螯合层析纯化后，包被酶联反应板，检测已确定的87份HCV抗体血清(HCV核心抗体和NS3抗体单独或共同阳性)和160份阴性血清(核心抗体及NS3抗体阴性)，87份阳性血清中NS4抗体阳性28份(阳性率31%)，NS5抗体慢性62份(阳性率70%)。而160份阴性血清中，检出2份NS4抗体弱阳性，1份NS5抗体弱阳性。说明纯化的NS4和NS5蛋白均有较好的抗原性和特异性。
3 讨 论
国外研制成功的第三代丙肝病毒抗体检测试剂中增加了NS4及NS5抗原，使试剂的检出率有所提高，说明丙肝病人血清中可能存在单独NS4或NS5抗体阳性的血清。所以我国HCV抗体检测试剂也应增加NS4及NS5抗原。
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本研究克隆表达的HCV NS4及NS5抗原，在两个抗原的N端均增加了载体上的6个组氨酸，这6个组氨酸不会引起非特异性，并且使表达的NS4及NS5抗原较易纯化。
用纯化的NS4抗原或NS5抗原分别检测已知HCV核心抗体或NS3抗体阳性的血清，阳性率分别为31%和70%，提示NS5抗原比NS4抗原的抗原性强，对HCV抗体的检出率高。本文中的160份阴性血清，是由第二代试剂盒检测过的高值阴性血清，我们用HCV核心抗原和NS3抗原共同检测亦为阴性，而用表达的NS4抗原检出2份弱阳性，用表达的NS5抗原检出1份弱阳性，提示丙肝病人血清中存在有单独NS4或单独NS5抗体阳性的血清。初步说明，试剂盒增加表达的NS4抗原和NS5抗原会提高抗体检出率。
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参考文献
1 Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA clon ederived from a blood borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 1 989;244:1
2 李越希，唐家琪，史江，等.丙型肝炎病核心蛋白基因在大肠杆菌内的表达及应用，中国病毒学，1994;9(1):18
3 李越希，唐家琪，陶开华，等.丙型肝炎病毒非结构3区基因片段的克隆表达及抗原纯 化鉴定，中国病毒学，1994;9(4):297
4 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular cloning 2nd ed. New York, USA: Cold spring habobly laboratory press, 1989
收稿日期：1999-09-23, 百拇医药