蛋白糖化终产物与糖尿病慢性并发症
作者：张美和 徐瑞兴
单位：张美和(首都医科大学附属北京儿童医院 邮政编码 100045)；徐瑞兴(首都医科大学化学教研组)
关键词：
蛋白糖化终产物 蛋白糖化终产物(AGE)是机体内蛋白和还原性糖经非酶缩合后生成的带有特殊荧光的褐色物质。AGE在糖尿病患者组织内蓄积是造成糖尿病慢性合并症的原因之一。AGE是一种多样态物质，目前可以根据各种AGE性质用分析仪器、荧光测定、免疫化学等不同方法进行定量测定。AGE的测定技术目前还不普遍，但有希望普及。
糖尿病由于慢性高血糖状态而继发各种合并症[1～3]。通常认为，要预防合并症必须严格控制血糖，但美国DCCT临床试验证明，即使血糖能得到严格控制，也不能完全阻止合并症的发生[4]。因而，糖尿病的治疗不能仅仅依赖严格的血糖控制，而是应该考虑合并症的成因及对症的治疗方法。
, 百拇医药
慢性高血糖状态引起的AGE在体内的蓄积是导致糖尿病慢性并发症原因之一，我们将近年来有关AGE研究的进展综述如下。
一、AGE的研究史
AGE是氨基酸与还原性糖的混合物加热生成的褐色物质。这个反应1912年法国的Maillard曾有过报告，称为Maillard反应[4]，一般做为食品化学部门的研究课题。反应中的酮胺结构是Maillard的前期生成物，这个反应不受酶的调节限制，只按质量作用法则在分子内重新分配，酮胺的生成量与血糖及蛋白在血中的浓度呈正比[1，2，5]。濑田等[6]根据质量分析法研究发现，糖耐量正常的健康者血浆中1分子白蛋白只与1分子葡萄糖结合，而糖尿病患者则可以与数个葡萄糖分子结合。当初糖化反应只在试管中能看到，到1960年前后才发现该反应也在生物体内存在，从而引起医学界的广泛注意。
二、AGE的结构及糖化反应
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糖化反应可分为前期及后期二个阶段。前期反应指葡萄糖等还原糖所带的醛基与氨基酸或蛋白质的游离氨基进行非酶缩合反应，生成可逆的Schiff碱(醛亚胺或称前A1c)，然后经过Amadori重排，形成稳定的酮胺化合物即糖化血红蛋白(HbA1c)或糖化血清蛋白(FRA)[1～10]，这个反应过程叫Maillard反应，也叫蛋白的糖化(glucation)。后期反应是指Amadori重排产物反复进行再脱水、重排、缩合等一系列反应生成带有特殊荧光的褐色物质，并以此物质为媒介，形成蛋白分子之间的架桥物质。Cevami等把这种糖化的最终产物命名为AGE(advancd glycosylation endproduct)[1，2]。AGE在形成过程中目前尚有许多反应机理不清楚，但是已知生成AGE需要数周至数月的时间。此外，从前期反应物质的分解产生的中间代谢产物3-脱氧葡萄糖酮(3-DG,3-deoxyglucosone)也可以与蛋白再一次结合形成AGE。由于3-DG是一种反应活性较强的物质，可以在短时间内形成AGE而作为生成AGE的另一通路[1]。图1显示AGE的形成过程。
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从AGE生成过程来看，它不是单一的而是多样态的物质。至今已知的AGE候选物质有2-(2-呋喃甲酰基)-4(5)-(2-呋喃基)-1H-咪唑〔FFI.2-(2-furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-H-imidazole〕；吡拉啉(pyrraline)；哌脱西啶(pentosidine)；克咯斯啉A&B(crosslines A&B)及羧甲基赖氨酸(carboxymethyllysine)等[1，2，9]。
三、AGE与糖尿病合并症[1～3，5～9]
慢性高血糖状态在组织内引起障碍的机制尚不太清楚，但AGE的蓄积与合并症的发生、发展的关系是肯定的。用特异性的识别AGE抗体通过ELISA方法及组织免疫化学染色法研究，发现在糖尿病患者的晶状体、皮肤、肾小球、血管壁、心肌、血液中都出现了AGE测定值的升高。生物体内的蛋白接受糖化的主要靶器官是赖氨酸上的ε氨基。由于糖化引起蛋白质结构的硬化变性，活性受到抑制，从而该组织发生病变。
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最近发现在生物体内存在AGE的受体。一般认为AGE受体存在于巨噬细胞、内皮细胞及肾小球系膜细胞的表面。AGE与内皮细胞的受体(RAGE)结合后，细胞即可分泌游离基及细胞因子(cytokine)。由细胞分泌的白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生成因子(TGF-β)等cytokine，引起一系列的细胞增殖异常和血管通透性的变化。由于高血糖状态，加上二酰基丙三醇-蛋白激酶[DAG(diacylglycerol)-PKC(protein Kinase C)]的活性，血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、吞噬细胞等血管壁组织的各种增殖因子及增殖因子的受体(PDGF-β受体)和细胞因子受到调节，促进了动脉硬化的发生，也促进了糖尿病视网膜病变和肾病的发生。
图1 AGE的生成过程
在糖尿病患者被氧化的低密度脂蛋白(LDL)也可以受到糖化，使糖化低密度脂蛋白增加。这些变性的LDL被吞噬细胞摄取，促进了动脉硬化的发生。被吞噬细胞摄取后的糖化蛋白被消化成小分子的AGE肽，经血液由肾脏排出体外。当肾功能减低时，来自血中的AGE肽和3-DG等中间产物的清除率减低，使这些中间产物在血管和组织内沉积再生成AGE。因此糖尿病肾功能不全患者的血液及组织中的AGE值明显增高。
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四、AGE的测定法[1，2，6～12]
测定糖化前期产物中HbA1c最普遍使用的是高效液相色谱法(HPLC)、电泳法及用硫代巴比妥酸(TBA)反应的比色法和免疫测定法。由于AGE是多样态物质，其测定方法根据AGE性质不同而不同。AGE一般在结缔组织的胶原生成，如果把组织分解即可得到带有荧光的AGE，因为是损伤性检查而不适用于临床。
1.荧光测定法：利用AGE带有荧光的特征，可采用在370nm的激发光和440nm的发射光测定荧光强度，可以得到带有荧光的AGE组分。
2.色谱法：AGE中一部分结构加酸水解后较稳定，可以将组织、蛋白等标本加酸水解后用仪器分析其含量。也可用二种层析柱在HPLC上分离再进行定量测定。
气相色谱/质谱(gas chromatography/mass sperotrometry GC/MS)是目前较为公认的、理想的测定仪器，可以测定AGE中的成分。
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3.免疫学测定：最近许多部门制备了AGE特异性抗体，利用这些抗体通过ELISA法及组织免疫化学染色法来测定AGE。至今，已制备出的抗体均是已明确结构和特异性强的AGE物质抗体。但由于AGE生成过程复杂而产物多样态，肯定还有未知的AGE物质。为了得到抗AGE抗体，葡萄糖与蛋白需要反应相当长的时间才能形成AGE化蛋白，再作为免疫原用来免疫大鼠等动物。问题在于新得到的抗体是否能够识别AGE物质内部的某一结构。因此，抗体制备成功与否要以抗体是否能识别抗原为基点，首先必须进行对AGE各种物质结构的认定，明确各种抗体的抗原决定基点，使AGE测定易于临床应用。
五、AGE阻断剂——氨基胍[13，14]
如果有一种可以阻断AGE合成的物质，就可以设想这种物质能够阻断糖尿病合并症的发生。1986年有人报告了如果把一种叫氨基胍的物质结合在酮胺化合物上，就能阻止AGE的生成。氨基胍是比较简单的、带有联胺的诱导体。氨基胍不仅能抑制AGE的生成，而且能阻断胶原间的架桥作用(图2)。
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图2 氨基胍结构
在糖尿病动物模型大鼠的试验中看到，投以氨基胍后，大鼠的视网膜病变、肾病、神经障碍等均有明显的改善，证明了氨基胍对糖尿病合并症的治疗有一定的效果，有可能成为防止糖尿病合并症的新药[1，14]。由于这种药物有一定的毒性，尚未进行临床使用，但国外已有人开始进行小范围的临床试验。
六、尚需解决的问题
由于对AGE的了解还不完善，各部门制备的抗体还是多克隆抗体，因此，当AGE结构明确后应该开发单克隆抗体。
目前的AGE测定还没有完全走出研究室范围，由于关系到糖尿病合并症的发生及治疗问题，AGE有可能成为糖尿病合并症的评价指标及药物治疗效果的判定。■
参考文献：
, 百拇医药
[1]藤井涉,牧田善二.AGE.临床检查,1996,40:1161.
[2]松山辰南,片山善章，藤田诚一.糖尿病コントロ—ル指标测定法の新たな展开.临床病理，1995,43:445.
[3]柏木厚典,安田齐,羽田胜计.糖尿病.内科,1996,78:1089.
[4]The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus.N Engl J Med,1993,329:977.
, http://www.100md.com
[5]河田浩一,石田俊彦,梶川达志.フルクトサミン.日本临床,1995,53:546.
[6]濑田和夫,矶部俊明,安川惠子.糖化蛋白の糖化度の测定.临床化学,1995,2:36b.
[7]安川惠子,西村理.グリコアルブミン.临床检查,1996,40:1275.
[8]山内俊一.1.5アンヒドログルシト-ル.临床检查,1996,40:1143.
[9]荒木令江,堀内正公.AGEの生化学.Diabete Frontier,1993,4:403.
[10]河原玲子.グリコヒモグロビン.日本临床,1995,53:543.
[11]岛健二.グリコヒモグロビンの标准化に关する委员会报告.糖尿病,1994,37:855.
[12]松冈瑛.糖尿病と临床检查.Medical Technology,1996,24:509.
[13]老籾宗忠,坂井诚，岩谷逸平.HbA1c.フルクトサミン.诊断と治疗,1996,84:1877.
[14]山内俊一.1.5アンビドログルシト-ル(1.5AG).诊断と治疗,1996,84:1881.
收稿日期：1997-05-23 修回日期：1999-07-29, http://www.100md.com
单位：张美和(首都医科大学附属北京儿童医院 邮政编码 100045)；徐瑞兴(首都医科大学化学教研组)
关键词：
蛋白糖化终产物 蛋白糖化终产物(AGE)是机体内蛋白和还原性糖经非酶缩合后生成的带有特殊荧光的褐色物质。AGE在糖尿病患者组织内蓄积是造成糖尿病慢性合并症的原因之一。AGE是一种多样态物质，目前可以根据各种AGE性质用分析仪器、荧光测定、免疫化学等不同方法进行定量测定。AGE的测定技术目前还不普遍，但有希望普及。
糖尿病由于慢性高血糖状态而继发各种合并症[1～3]。通常认为，要预防合并症必须严格控制血糖，但美国DCCT临床试验证明，即使血糖能得到严格控制，也不能完全阻止合并症的发生[4]。因而，糖尿病的治疗不能仅仅依赖严格的血糖控制，而是应该考虑合并症的成因及对症的治疗方法。
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慢性高血糖状态引起的AGE在体内的蓄积是导致糖尿病慢性并发症原因之一，我们将近年来有关AGE研究的进展综述如下。
一、AGE的研究史
AGE是氨基酸与还原性糖的混合物加热生成的褐色物质。这个反应1912年法国的Maillard曾有过报告，称为Maillard反应[4]，一般做为食品化学部门的研究课题。反应中的酮胺结构是Maillard的前期生成物，这个反应不受酶的调节限制，只按质量作用法则在分子内重新分配，酮胺的生成量与血糖及蛋白在血中的浓度呈正比[1，2，5]。濑田等[6]根据质量分析法研究发现，糖耐量正常的健康者血浆中1分子白蛋白只与1分子葡萄糖结合，而糖尿病患者则可以与数个葡萄糖分子结合。当初糖化反应只在试管中能看到，到1960年前后才发现该反应也在生物体内存在，从而引起医学界的广泛注意。
二、AGE的结构及糖化反应
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糖化反应可分为前期及后期二个阶段。前期反应指葡萄糖等还原糖所带的醛基与氨基酸或蛋白质的游离氨基进行非酶缩合反应，生成可逆的Schiff碱(醛亚胺或称前A1c)，然后经过Amadori重排，形成稳定的酮胺化合物即糖化血红蛋白(HbA1c)或糖化血清蛋白(FRA)[1～10]，这个反应过程叫Maillard反应，也叫蛋白的糖化(glucation)。后期反应是指Amadori重排产物反复进行再脱水、重排、缩合等一系列反应生成带有特殊荧光的褐色物质，并以此物质为媒介，形成蛋白分子之间的架桥物质。Cevami等把这种糖化的最终产物命名为AGE(advancd glycosylation endproduct)[1，2]。AGE在形成过程中目前尚有许多反应机理不清楚，但是已知生成AGE需要数周至数月的时间。此外，从前期反应物质的分解产生的中间代谢产物3-脱氧葡萄糖酮(3-DG,3-deoxyglucosone)也可以与蛋白再一次结合形成AGE。由于3-DG是一种反应活性较强的物质，可以在短时间内形成AGE而作为生成AGE的另一通路[1]。图1显示AGE的形成过程。
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从AGE生成过程来看，它不是单一的而是多样态的物质。至今已知的AGE候选物质有2-(2-呋喃甲酰基)-4(5)-(2-呋喃基)-1H-咪唑〔FFI.2-(2-furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-H-imidazole〕；吡拉啉(pyrraline)；哌脱西啶(pentosidine)；克咯斯啉A&B(crosslines A&B)及羧甲基赖氨酸(carboxymethyllysine)等[1，2，9]。
三、AGE与糖尿病合并症[1～3，5～9]
慢性高血糖状态在组织内引起障碍的机制尚不太清楚，但AGE的蓄积与合并症的发生、发展的关系是肯定的。用特异性的识别AGE抗体通过ELISA方法及组织免疫化学染色法研究，发现在糖尿病患者的晶状体、皮肤、肾小球、血管壁、心肌、血液中都出现了AGE测定值的升高。生物体内的蛋白接受糖化的主要靶器官是赖氨酸上的ε氨基。由于糖化引起蛋白质结构的硬化变性，活性受到抑制，从而该组织发生病变。
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最近发现在生物体内存在AGE的受体。一般认为AGE受体存在于巨噬细胞、内皮细胞及肾小球系膜细胞的表面。AGE与内皮细胞的受体(RAGE)结合后，细胞即可分泌游离基及细胞因子(cytokine)。由细胞分泌的白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生成因子(TGF-β)等cytokine，引起一系列的细胞增殖异常和血管通透性的变化。由于高血糖状态，加上二酰基丙三醇-蛋白激酶[DAG(diacylglycerol)-PKC(protein Kinase C)]的活性，血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、吞噬细胞等血管壁组织的各种增殖因子及增殖因子的受体(PDGF-β受体)和细胞因子受到调节，促进了动脉硬化的发生，也促进了糖尿病视网膜病变和肾病的发生。
图1 AGE的生成过程
在糖尿病患者被氧化的低密度脂蛋白(LDL)也可以受到糖化，使糖化低密度脂蛋白增加。这些变性的LDL被吞噬细胞摄取，促进了动脉硬化的发生。被吞噬细胞摄取后的糖化蛋白被消化成小分子的AGE肽，经血液由肾脏排出体外。当肾功能减低时，来自血中的AGE肽和3-DG等中间产物的清除率减低，使这些中间产物在血管和组织内沉积再生成AGE。因此糖尿病肾功能不全患者的血液及组织中的AGE值明显增高。
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四、AGE的测定法[1，2，6～12]
测定糖化前期产物中HbA1c最普遍使用的是高效液相色谱法(HPLC)、电泳法及用硫代巴比妥酸(TBA)反应的比色法和免疫测定法。由于AGE是多样态物质，其测定方法根据AGE性质不同而不同。AGE一般在结缔组织的胶原生成，如果把组织分解即可得到带有荧光的AGE，因为是损伤性检查而不适用于临床。
1.荧光测定法：利用AGE带有荧光的特征，可采用在370nm的激发光和440nm的发射光测定荧光强度，可以得到带有荧光的AGE组分。
2.色谱法：AGE中一部分结构加酸水解后较稳定，可以将组织、蛋白等标本加酸水解后用仪器分析其含量。也可用二种层析柱在HPLC上分离再进行定量测定。
气相色谱/质谱(gas chromatography/mass sperotrometry GC/MS)是目前较为公认的、理想的测定仪器，可以测定AGE中的成分。
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3.免疫学测定：最近许多部门制备了AGE特异性抗体，利用这些抗体通过ELISA法及组织免疫化学染色法来测定AGE。至今，已制备出的抗体均是已明确结构和特异性强的AGE物质抗体。但由于AGE生成过程复杂而产物多样态，肯定还有未知的AGE物质。为了得到抗AGE抗体，葡萄糖与蛋白需要反应相当长的时间才能形成AGE化蛋白，再作为免疫原用来免疫大鼠等动物。问题在于新得到的抗体是否能够识别AGE物质内部的某一结构。因此，抗体制备成功与否要以抗体是否能识别抗原为基点，首先必须进行对AGE各种物质结构的认定，明确各种抗体的抗原决定基点，使AGE测定易于临床应用。
五、AGE阻断剂——氨基胍[13，14]
如果有一种可以阻断AGE合成的物质，就可以设想这种物质能够阻断糖尿病合并症的发生。1986年有人报告了如果把一种叫氨基胍的物质结合在酮胺化合物上，就能阻止AGE的生成。氨基胍是比较简单的、带有联胺的诱导体。氨基胍不仅能抑制AGE的生成，而且能阻断胶原间的架桥作用(图2)。
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图2 氨基胍结构
在糖尿病动物模型大鼠的试验中看到，投以氨基胍后，大鼠的视网膜病变、肾病、神经障碍等均有明显的改善，证明了氨基胍对糖尿病合并症的治疗有一定的效果，有可能成为防止糖尿病合并症的新药[1，14]。由于这种药物有一定的毒性，尚未进行临床使用，但国外已有人开始进行小范围的临床试验。
六、尚需解决的问题
由于对AGE的了解还不完善，各部门制备的抗体还是多克隆抗体，因此，当AGE结构明确后应该开发单克隆抗体。
目前的AGE测定还没有完全走出研究室范围，由于关系到糖尿病合并症的发生及治疗问题，AGE有可能成为糖尿病合并症的评价指标及药物治疗效果的判定。■
参考文献：
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[1]藤井涉,牧田善二.AGE.临床检查,1996,40:1161.
[2]松山辰南,片山善章，藤田诚一.糖尿病コントロ—ル指标测定法の新たな展开.临床病理，1995,43:445.
[3]柏木厚典,安田齐,羽田胜计.糖尿病.内科,1996,78:1089.
[4]The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus.N Engl J Med,1993,329:977.
, http://www.100md.com
[5]河田浩一,石田俊彦,梶川达志.フルクトサミン.日本临床,1995,53:546.
[6]濑田和夫,矶部俊明,安川惠子.糖化蛋白の糖化度の测定.临床化学,1995,2:36b.
[7]安川惠子,西村理.グリコアルブミン.临床检查,1996,40:1275.
[8]山内俊一.1.5アンヒドログルシト-ル.临床检查,1996,40:1143.
[9]荒木令江,堀内正公.AGEの生化学.Diabete Frontier,1993,4:403.
[10]河原玲子.グリコヒモグロビン.日本临床,1995,53:543.
[11]岛健二.グリコヒモグロビンの标准化に关する委员会报告.糖尿病,1994,37:855.
[12]松冈瑛.糖尿病と临床检查.Medical Technology,1996,24:509.
[13]老籾宗忠,坂井诚，岩谷逸平.HbA1c.フルクトサミン.诊断と治疗,1996,84:1877.
[14]山内俊一.1.5アンビドログルシト-ル(1.5AG).诊断と治疗,1996,84:1881.
收稿日期：1997-05-23 修回日期：1999-07-29, http://www.100md.com