口服香菇多糖脂质体激活鼠胃肠淋巴系统自然杀伤细胞及其抑瘤作用
作者：盛剑秋 段芳龄 张红光 杨淑英
单位：(北京军区总院 消化内科，北京 100700)
关键词：香菇多糖；脂质体；NK活性；肠系膜淋巴结
中国新药杂志990607
摘要 目的：为口服生物反应调节剂脂质体阻断某些胃肠道肿瘤的形成及术后转移复发提供实验依据。方法：Balb/c小鼠腹腔接种H22肝癌细胞前后按不同分组分别灌胃香菇多糖脂质体、香菇多糖、空白脂质体+香菇多糖及生理盐水19 d，结束治疗后检测腹水量和肠系膜淋巴结及脾脏NK细胞活性。结果：香菇多糖脂质体组腹水量显著减少P<0.01，肠系膜淋巴结及脾脏NK活性显著提高 ，香菇多糖和香菇多糖+空白脂质体组NK活性略升高，但不能抑制腹水生成。结论：香菇多糖脂质体可显著提高荷瘤小鼠肠系膜淋巴结和脾脏NK细胞活性，口服这种新型的免疫调节剂对NK细胞的激活可能为其体内抑瘤作用机制之一，表现了长期口服给药抑瘤优势。
, http://www.100md.com
EFFECT OF ORAL LENTINAN-LIPOSOME ON NK CELLS OF GI LYMPHATIC
TISSUE AND ITS ANTITUMOR ACTIVITY
Sheng Jianqiu,Duan Fangling,Zhang Hongguang,et al.
(Department of Gastroenterology,General Hospital of PLA,Beijing 100700)
ABSTRACT OBJECTIVE：To provide evidence for oral liposomes entrapping bio-reaction modifier to block the development of some GI tumor and postoperative metastasis and recurrence.METHODS:Balb/c mice were adopted in the study.They were divided to receive oral lentinan(LNT),lentinan-liposome or liposome and lentinan for 19 d. Then the H22 tumor cells were injected for all animals on the fourth day of treatment.The NK activity of lymphoglandulae messentericae and spleen,and the volume of ascites were measured.RESULTS:The NK activity of lymphoglandulae mestericae and spleen,and the volume of ascties were significantly increased after treatment with lentinan-liposome.CONCLUSION:The NK activity of lymohoglandulae mesentericae and spleen can be enhanced by oral lentinan-liposome which may be an important mechanism of its in vivo anti-tumor effect.
, 百拇医药
KEY WORDS Oral adminis tration;Letinan;Liposomes;NK activity;Lymphoglanduue
某些胃肠道的慢性病变从良性衍变成恶性肿瘤的时间较长，长期合理用药阻止恶变是治疗的关键。口服生物反应调节剂脂质体适合长期应用，通过调节胃肠道淋巴组织及全身免疫功能，而达到防治肿瘤的目的。基于上述观点，制备口服剂型的香菇多糖脂质体，观察口服后对肠系膜淋巴结及脾脏NK活性，以及对体内抑瘤作用的影响，为口服生物反应调节剂脂质体阻断某些胃肠道肿瘤的形成及术后转移复发，提供间接的实验依据。
材料与方法
1 材料与主要试剂
H22小鼠肝癌细胞由Balb/c小鼠腹腔传代，河南省肿瘤研究所提供；Yac-1细胞购于上海生物细胞研究所，体外传代；二棕榈磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇(CH) 购于美国Sigma公司；香菇多糖(LNT)为日本味之素株式会社产品。
, 百拇医药
2 脂质体的制备
逆向蒸发法[1，2]，DPPC∶CH 按7∶2制备香菇多糖脂质体(Lip-LNT)和空白脂质体(Free-Lip)。
3 体内NK活性的诱导及体内抑瘤作用的监测
Balb/c纯系小鼠50只，4～8周龄，体重16～18 g，随机分为5组，即正常组(A),对照组(B),游离香菇多糖组(C)，空白脂质体+游离香菇多糖组(D)和香菇多糖脂质体组(E)。A组及B组小鼠分别ig生理盐水(NS)0.5 ml，C组ig LNT 5 mg/kg，D组 ig Free-Lip 0.5 μmol/只，E组 ig Lip-LNT 5 mg/kg(含脂质体0.5 μmol/只)，qd，连续7 d。d8，除正常组腹腔注射等量的生理盐水外，每只实验动物腹腔接种H22肝癌细胞5×105/0.4 ml，继续上述治疗12 d。结束治疗后次日，脱颈处死全部小鼠，分别测量腹水，摘取肠系膜淋巴节及脾脏。
, 百拇医药
4 效应细胞的制备
以钳夹法制备肠系膜淋巴结细胞悬液，过300目不锈钢网，淋巴细胞梯度离心，取淋巴细胞层，离心洗涤后，细胞浓度调至107/ml备用。于尼龙网上研磨脾脏，再以Tris-NH4CL破坏红细胞，离心洗涤后，制备脾脏单个核细胞悬液，浓度调至107/ml备用。
5 靶细胞的制备
常规3H-TDR掺入法标记，取传代24 h的Yac-1靶细胞3 ml(106/ml)，加入3H-TDR 10 μci ,37℃培养3 h，离心洗涤3次，浓度调至105/ml备用。
6 NK细胞活性的检测
参照冯化作[3]等的方法，效靶比按100∶1，取靶细胞和效应细胞悬液各100 μl, 共同培养12 h，多头细胞仪收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上，经液闪仪测定CPM值，NK细胞活性百分率计算如下式：
, http://www.100md.com
7 统计学处理
采用两样本间的t或t'检验。
结 果
1 Lip-LNT灌胃对肠系淋巴结及脾脏NK活性的影响
荷瘤小鼠对照组肠系膜淋巴结NK细胞活性比正常组显著下降,接种瘤细胞前后Lip-LNT灌胃可阻止这种作用，使NK细胞活性显著升高，而LNT或Free-LNT+LNT灌胃也可使NK活性提高,但尚未达到正常组水平，结果详见表1。
表1 Lip-LNT，LNT及Free-Lip对肠系膜及
脾脏淋巴结NK活性的影响(x±s,n=10) 组别
处理
, http://www.100md.com
NK活性
脾脏NK活性
正常
NS
6.01±0.52b
6.35±1.12b
对照
NS
4.82±1.08
5.28±0.17
C
LNT
, 百拇医药
5.68±1.05a
6.06±0.86a
D
Free-Lip+LNT
5.79±0.77a
6.25±0.94a
E
Lip-LNT
17.63±2.42c
14.43±2.09c
, http://www.100md.com
与对照组比较 a:P<0.05；b:P<0.01；c:P<0.0012 Lip-LNT灌胃对体内抑瘤作用影响
接种瘤细胞前后Lip-LNT 灌胃可显著抑制H22肝癌小鼠腹水的生成，而LNT或Free-LNT+LNT灌胃均不能抑制腹水形成，由于正常组未接种瘤细胞无水生长，结果详见表2。
表2 Lip-LNT，LNT及Free-Lip对H22腹水型
肝癌荷瘤鼠的影响(±s,n=10) 组别
处理
腹水量(ml)/只
P值
范围
, 百拇医药
平均量
对照
NS
7.2～12
9.49±2.07
C
LNT
6.8～12.1
8.91±1.92
>0.05
D
Free-Lip+LNT
6.3～14.2
, http://www.100md.com
9.08±2.36
>0.05
E
Lip+LNT
3.0～10.4
6.43±2.38
<0.01
讨 论
由二棕榈磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)等人工合成的、含有饱和脂肪酸侧连的脂质体，能抵抗胃肠道消化液，被完整地吸收[1]，吸收后大部分累积于胃肠道，少部分滞留在网状内皮系统[4]。其中体积较大的滞留于Payer's结，较小的进入血液循环或被转送到肠系膜淋巴结和脾脏[5]。故推测口服剂型的生物反应调节剂脂质体口服后，可激活胃肠道淋巴及全身免疫系统而发挥抗肿瘤作用。本研究用DPPC等脂质制备香菇多糖脂质体，并灌胃小鼠，肠系膜淋巴结和脾脏NK细胞活性提高，同时产生了较强的体内抑瘤作用，进一步证明了这个论点。此外，胃肠道淋巴系统和脾脏NK细胞的激活也可能为其体内抑瘤机制之一。我们对NK活性检测的结果还表明，相对于正常鼠而言，荷瘤小鼠肠系膜淋巴结及脾脏NK细胞活性降低，接种瘤细胞前后灌胃香菇多糖脂质体，可阻止这种作用 ,并显著提高NK活性。这对于胃肠道肿瘤术后转移、复发的防治有重要意义，Payer's结多集中于回盲部，且该部位肿瘤形成时间过长，对于该部位肿瘤的防治有重要价值。
, 百拇医药
关于口服脂质体在免疫方面的研究多集中于粘膜免疫，而激活胃肠道淋巴系统抗肿瘤作用方面的研究尚未见报道。口服给药简便易行，适合长期应用，结合某些胃肠道肿瘤形成较长，必须长期用药才能阻止其发生等特点，口服生物反应调节剂脂质体在肿瘤治疗方面的应用可能会有较好的临床前景。
段芳龄 杨淑英 河南医科大学消化病研究所
参考文献
1 Aramaki Y, Hazama M, Tara T,et al. Stability of liposomes in vitro and their uptake by rat Peyer's Patches. Following oral administration. Pharmaceutical Research，1993,10(8)∶1228
2 川腰立之，山下严，田贤.レニチニ包埋ポソムワ肝转移抑制效果(第一报).Biotherapy,1988,6(1)∶1125
, 百拇医药
3 冯化作，陈兆聪.用3H标记的靶细胞及其介导的细胞毒作用.中国免疫杂志，1988，4(2)∶73
4 Tanguay S, Bucana CD, Wilson MR,et al.In vivo modulating of macrophage tumoricida activity by oral administration the liposome encapsulated macrophage activity CGP 19835A.Cancer Research，1994,54(22)∶5882
5 Childer Nk, Deny FR, Megec NF,et al.Ultrastructual study of liposome uptake by M cell of rat Peyer's patch.Reg Immunol,1990,3(1)∶8
(收稿：1998-09-21 修回：1999-04-20), 百拇医药
单位：(北京军区总院 消化内科，北京 100700)
关键词：香菇多糖；脂质体；NK活性；肠系膜淋巴结
中国新药杂志990607
摘要 目的：为口服生物反应调节剂脂质体阻断某些胃肠道肿瘤的形成及术后转移复发提供实验依据。方法：Balb/c小鼠腹腔接种H22肝癌细胞前后按不同分组分别灌胃香菇多糖脂质体、香菇多糖、空白脂质体+香菇多糖及生理盐水19 d，结束治疗后检测腹水量和肠系膜淋巴结及脾脏NK细胞活性。结果：香菇多糖脂质体组腹水量显著减少P<0.01，肠系膜淋巴结及脾脏NK活性显著提高 ，香菇多糖和香菇多糖+空白脂质体组NK活性略升高，但不能抑制腹水生成。结论：香菇多糖脂质体可显著提高荷瘤小鼠肠系膜淋巴结和脾脏NK细胞活性，口服这种新型的免疫调节剂对NK细胞的激活可能为其体内抑瘤作用机制之一，表现了长期口服给药抑瘤优势。
, http://www.100md.com
EFFECT OF ORAL LENTINAN-LIPOSOME ON NK CELLS OF GI LYMPHATIC
TISSUE AND ITS ANTITUMOR ACTIVITY
Sheng Jianqiu,Duan Fangling,Zhang Hongguang,et al.
(Department of Gastroenterology,General Hospital of PLA,Beijing 100700)
ABSTRACT OBJECTIVE：To provide evidence for oral liposomes entrapping bio-reaction modifier to block the development of some GI tumor and postoperative metastasis and recurrence.METHODS:Balb/c mice were adopted in the study.They were divided to receive oral lentinan(LNT),lentinan-liposome or liposome and lentinan for 19 d. Then the H22 tumor cells were injected for all animals on the fourth day of treatment.The NK activity of lymphoglandulae messentericae and spleen,and the volume of ascites were measured.RESULTS:The NK activity of lymphoglandulae mestericae and spleen,and the volume of ascties were significantly increased after treatment with lentinan-liposome.CONCLUSION:The NK activity of lymohoglandulae mesentericae and spleen can be enhanced by oral lentinan-liposome which may be an important mechanism of its in vivo anti-tumor effect.
, 百拇医药
KEY WORDS Oral adminis tration;Letinan;Liposomes;NK activity;Lymphoglanduue
某些胃肠道的慢性病变从良性衍变成恶性肿瘤的时间较长，长期合理用药阻止恶变是治疗的关键。口服生物反应调节剂脂质体适合长期应用，通过调节胃肠道淋巴组织及全身免疫功能，而达到防治肿瘤的目的。基于上述观点，制备口服剂型的香菇多糖脂质体，观察口服后对肠系膜淋巴结及脾脏NK活性，以及对体内抑瘤作用的影响，为口服生物反应调节剂脂质体阻断某些胃肠道肿瘤的形成及术后转移复发，提供间接的实验依据。
材料与方法
1 材料与主要试剂
H22小鼠肝癌细胞由Balb/c小鼠腹腔传代，河南省肿瘤研究所提供；Yac-1细胞购于上海生物细胞研究所，体外传代；二棕榈磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇(CH) 购于美国Sigma公司；香菇多糖(LNT)为日本味之素株式会社产品。
, 百拇医药
2 脂质体的制备
逆向蒸发法[1，2]，DPPC∶CH 按7∶2制备香菇多糖脂质体(Lip-LNT)和空白脂质体(Free-Lip)。
3 体内NK活性的诱导及体内抑瘤作用的监测
Balb/c纯系小鼠50只，4～8周龄，体重16～18 g，随机分为5组，即正常组(A),对照组(B),游离香菇多糖组(C)，空白脂质体+游离香菇多糖组(D)和香菇多糖脂质体组(E)。A组及B组小鼠分别ig生理盐水(NS)0.5 ml，C组ig LNT 5 mg/kg，D组 ig Free-Lip 0.5 μmol/只，E组 ig Lip-LNT 5 mg/kg(含脂质体0.5 μmol/只)，qd，连续7 d。d8，除正常组腹腔注射等量的生理盐水外，每只实验动物腹腔接种H22肝癌细胞5×105/0.4 ml，继续上述治疗12 d。结束治疗后次日，脱颈处死全部小鼠，分别测量腹水，摘取肠系膜淋巴节及脾脏。
, 百拇医药
4 效应细胞的制备
以钳夹法制备肠系膜淋巴结细胞悬液，过300目不锈钢网，淋巴细胞梯度离心，取淋巴细胞层，离心洗涤后，细胞浓度调至107/ml备用。于尼龙网上研磨脾脏，再以Tris-NH4CL破坏红细胞，离心洗涤后，制备脾脏单个核细胞悬液，浓度调至107/ml备用。
5 靶细胞的制备
常规3H-TDR掺入法标记，取传代24 h的Yac-1靶细胞3 ml(106/ml)，加入3H-TDR 10 μci ,37℃培养3 h，离心洗涤3次，浓度调至105/ml备用。
6 NK细胞活性的检测
参照冯化作[3]等的方法，效靶比按100∶1，取靶细胞和效应细胞悬液各100 μl, 共同培养12 h，多头细胞仪收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上，经液闪仪测定CPM值，NK细胞活性百分率计算如下式：
, http://www.100md.com
7 统计学处理
采用两样本间的t或t'检验。
结 果
1 Lip-LNT灌胃对肠系淋巴结及脾脏NK活性的影响
荷瘤小鼠对照组肠系膜淋巴结NK细胞活性比正常组显著下降,接种瘤细胞前后Lip-LNT灌胃可阻止这种作用，使NK细胞活性显著升高，而LNT或Free-LNT+LNT灌胃也可使NK活性提高,但尚未达到正常组水平，结果详见表1。
表1 Lip-LNT，LNT及Free-Lip对肠系膜及
脾脏淋巴结NK活性的影响(x±s,n=10) 组别
处理
, http://www.100md.com
NK活性
脾脏NK活性
正常
NS
6.01±0.52b
6.35±1.12b
对照
NS
4.82±1.08
5.28±0.17
C
LNT
, 百拇医药
5.68±1.05a
6.06±0.86a
D
Free-Lip+LNT
5.79±0.77a
6.25±0.94a
E
Lip-LNT
17.63±2.42c
14.43±2.09c
, http://www.100md.com
与对照组比较 a:P<0.05；b:P<0.01；c:P<0.0012 Lip-LNT灌胃对体内抑瘤作用影响
接种瘤细胞前后Lip-LNT 灌胃可显著抑制H22肝癌小鼠腹水的生成，而LNT或Free-LNT+LNT灌胃均不能抑制腹水形成，由于正常组未接种瘤细胞无水生长，结果详见表2。
表2 Lip-LNT，LNT及Free-Lip对H22腹水型
肝癌荷瘤鼠的影响(±s,n=10) 组别
处理
腹水量(ml)/只
P值
范围
, 百拇医药
平均量
对照
NS
7.2～12
9.49±2.07
C
LNT
6.8～12.1
8.91±1.92
>0.05
D
Free-Lip+LNT
6.3～14.2
, http://www.100md.com
9.08±2.36
>0.05
E
Lip+LNT
3.0～10.4
6.43±2.38
<0.01
讨 论
由二棕榈磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)等人工合成的、含有饱和脂肪酸侧连的脂质体，能抵抗胃肠道消化液，被完整地吸收[1]，吸收后大部分累积于胃肠道，少部分滞留在网状内皮系统[4]。其中体积较大的滞留于Payer's结，较小的进入血液循环或被转送到肠系膜淋巴结和脾脏[5]。故推测口服剂型的生物反应调节剂脂质体口服后，可激活胃肠道淋巴及全身免疫系统而发挥抗肿瘤作用。本研究用DPPC等脂质制备香菇多糖脂质体，并灌胃小鼠，肠系膜淋巴结和脾脏NK细胞活性提高，同时产生了较强的体内抑瘤作用，进一步证明了这个论点。此外，胃肠道淋巴系统和脾脏NK细胞的激活也可能为其体内抑瘤机制之一。我们对NK活性检测的结果还表明，相对于正常鼠而言，荷瘤小鼠肠系膜淋巴结及脾脏NK细胞活性降低，接种瘤细胞前后灌胃香菇多糖脂质体，可阻止这种作用 ,并显著提高NK活性。这对于胃肠道肿瘤术后转移、复发的防治有重要意义，Payer's结多集中于回盲部，且该部位肿瘤形成时间过长，对于该部位肿瘤的防治有重要价值。
, 百拇医药
关于口服脂质体在免疫方面的研究多集中于粘膜免疫，而激活胃肠道淋巴系统抗肿瘤作用方面的研究尚未见报道。口服给药简便易行，适合长期应用，结合某些胃肠道肿瘤形成较长，必须长期用药才能阻止其发生等特点，口服生物反应调节剂脂质体在肿瘤治疗方面的应用可能会有较好的临床前景。
段芳龄 杨淑英 河南医科大学消化病研究所
参考文献
1 Aramaki Y, Hazama M, Tara T,et al. Stability of liposomes in vitro and their uptake by rat Peyer's Patches. Following oral administration. Pharmaceutical Research，1993,10(8)∶1228
2 川腰立之，山下严，田贤.レニチニ包埋ポソムワ肝转移抑制效果(第一报).Biotherapy,1988,6(1)∶1125
, 百拇医药
3 冯化作，陈兆聪.用3H标记的靶细胞及其介导的细胞毒作用.中国免疫杂志，1988，4(2)∶73
4 Tanguay S, Bucana CD, Wilson MR,et al.In vivo modulating of macrophage tumoricida activity by oral administration the liposome encapsulated macrophage activity CGP 19835A.Cancer Research，1994,54(22)∶5882
5 Childer Nk, Deny FR, Megec NF,et al.Ultrastructual study of liposome uptake by M cell of rat Peyer's patch.Reg Immunol,1990,3(1)∶8
(收稿：1998-09-21 修回：1999-04-20), 百拇医药