自体外周血干细胞移植中造血干细胞的程控冷冻与液氮保存的初步研究
作者：常伟荣 夏学鸣 吴德沛 岑建农
单位：江苏省血液研究所，苏州医学院附属一院血液科，苏州，215006
关键词：自体外周血干细胞移植；恶性血液病；程控冷冻；细胞复苏
摘要 14例自体外周血干细胞移植中 摘要 14例自体外周血干细胞移植中，用程控冷冻仪冷冻、液氮保存造血干细胞，在病人预处理方案结束后，经静脉回输复苏之造血干细胞。结果：细胞植活及造血功能恢复良好，中性粒细胞>0.5×109/L，平均为11天，Plt>30×109/L，平均为21天。
中图法分类 R733；R318.52
Preliminary Study on the Programmed Freezing and Liquid Nitrogen Preservation of Autologous Peripheral Blood Hematopoietic Stem Cells
, 百拇医药
Chang Weirong，Xia Xueming,Wu Depei,et al
(Department of Hematology,First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou,215006)
Abstract The peripheral blood hematopoietic stem cells from 14 patients receiving autologous peripheral blood stem cell transplantation underwent programmed freezing and liquid nitrogen preserving.After conditioning regimen,the recovered stem cells were infused through vein,and hematopoietic reconstitution was good.The concentration of neutrophil was over 0.5×109/L and platelet over 30×109/L,and the survival time in average for neutrophil and platelet was 11 and 21 days respecticely.
, 百拇医药
Key words autologous peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation;hematologic malgnancies;programmed freezing;cell recovery
自体外周血造血干细胞移植中，造血干细胞的体外冷冻保存是移植成功的关键。我科自1995年以来对14例患者施行APBSCT，造血干细胞通过程控冷冻、液氮保存，均成功地进行了移植，初步报告如下。
1 资料和方法
1.1 病例：男10例，女4例。急性非淋巴细胞性白血病6例，急性淋巴细胞性白血病2例，霍奇金淋巴瘤4例，非霍奇金淋巴瘤1例，杂合型急性白血病1例。
1.2 冷冻保存液：①TC199培养基9.8g,EDTA-Na2 2.0g，NaHCO3 2.0g，加双蒸水至1000ml，pH 6.8～7.0，正压过滤，细菌、热源检测合格。②冷冻保存液：TCE保养液占70%，二甲亚砜(DMSO)占20%，人类同型或AB型血清占10%，使用前按上述比例配置混匀后置冰箱备用。
, http://www.100md.com
1.3 方法
1.3.1 造血干细胞采集：患者经大剂量米妥蒽醌、阿糖胞苷动员方案处理后，待白细胞数降至1.0×109/L以下时，以惠尔血(G-CSF)300μg/d皮下注射，待白细胞数回升时，用流式细胞仪监测CD34+细胞量，待CD34+细胞明显升高时，用CS-3000plus血细胞分离机采集造血干细胞，每次采集血量8000～14000ml，采集数量按MNC(4～6)×108/kg，CD34+细胞(2～4)×106/kg。
1.3.2 造血干细胞的冷冻保存：血细胞分离机采集之造血干细胞按(0.5～1.0)×108ml细胞浓度分装入深低温冷冻袋中，其中取出少许进行MNC计数，粒—单祖细胞(CFU-GM)培养及CD34+细胞测定，其余分别在冰浴内加入等量的冷冻保存液(终浓度分别为TC199保养液为35%，DMSO为10%，人类同型血清为5%)，充分混匀后封口，并立即放入Cryomed程控冷冻仪内冷冻至-90℃后移入液氮内长期保存。
, 百拇医药
1.4 结果
1.4.1 14例患者冷冻前后测定结果见表1。
表1 14例患者冷冻前后测定结果
例号
诊断
冷冻前细胞量
冷冻后回输细胞量
MNC
(×108/kg)
CD34+
(×106/kg)
, 百拇医药
CFU-GM
(×105/kg)
细胞活力
(%)
MNC
(×108/kg)
CD34+
(×106/kg)
CFU-GM
(×105/kg)
1
, http://www.100md.com
NHL
6.0
43.5
3.9
80
4.8
24.1
2.5
2
HD
1.6
8.8
1.6
, http://www.100md.com
63
1.0
6.1
0.5
3
HD
1.7
26.7
4.1
47
0.8
9.8
2.3
, http://www.100md.com 4
HD
1.7
4.3
1.2
86
1.5
3.5
1.0
5
HD
2.0
6.4
1.1
, 百拇医药
70
1.5
5.2
/
6
M3
2.6
8.8
1.1
54
1.3
4.5
0.6
, 百拇医药
7
M5
16.0
7.2
39
65
14.4
5.4
12.3
8
M2
4.7
6.1
, 百拇医药
1.3
82
1.9
0.6
0.2
9
M5
4.0
13.0
3.3
48
2.0
2.0
, 百拇医药
/
10
M3
3.4
31
1.7
75
2.5
25.1
1.2
11
HAL
5.1
, 百拇医药
7.3
2.0
54
2.7
3.0
1.1
12
M3
2.0
5.5
0.9
49
0.9
, http://www.100md.com
1.7
/
13
L3
1.1
12.0
2.2
74
0.8
6.8
0.6
14
L2
, 百拇医药
4.4
4.8
1.6
80
3.5
3.9
1.3
1.4.2 复苏和回输：冷冻袋从液氮中取出后，立即放入40℃恒温水浴中并不断轻轻摇晃，直至溶解(此过程一般为1～2min)，立即回输给病人，为了减少DMSO对造血干细胞的毒性，应在床边进行复苏解冻，并在5～10min内回输完毕，并取少许细胞进行CFU-GM培养，CD34+细胞检测及细胞活力测定。
1.4.3 移植后造血功能恢复情况：病人入净化病房，按不同病种进行预处理，一般在预处理方案结束24h左右回输解冻之造血干细胞。回输时仅部分病人口鼻中有DMSO气味及有刺痛感。移植后造血功能恢复(N≥0.5×109/L,Plt≥30×109/L)，结果见表2。表2 移植后造血功能恢复情况
, 百拇医药
例
号
诊断
采集日血象
造血功能恢复(d)
WBC(×109/L)
Plt(×109/L)
N≥0.5×109/L
Plt≥30×109/L
1
NHL
, 百拇医药
5.4
18
13
19
2
HD
7.7
29
10
22
3
HD
4.4
21
, 百拇医药
8
12
4
HD
5.3
60
9
11
5
HD
2.4
18
9
15
, 百拇医药
6
M3
6.2
37
9
12
7
M5
1.2
12
29
>120
8
, http://www.100md.com
M2
2.4
58
12
18
9
M5
7.0
16
8
11
10
M3
, 百拇医药
4.9
70
8
9
11
HAL
4.2
8
10
15
12
M3
2.8
, 百拇医药
34
11
15
13
L3
2.4
32
8
11
14
L2
1.8
26
, 百拇医药
10
10
=11=21
2 讨论
造血干细胞采集的成功与否与所用动员方案直接相关，但部分患者动员不出，外周血中造血干细胞的量比正常略高，不足以采集，这与患者对动员方案不敏感或多次大剂量化疗后骨髓损伤有关，本组中2例分别采集4、7次，但CD34+细胞的量仍属低水平[1]。本组中细胞活力大多≥60%，且回输后造血功能均能恢复，但复苏后细胞的CFU-GM培养结果偏低，可能与细胞留置时间过长，DMSO对造血干细胞产生的毒性有关[2]。
, 百拇医药
液氮保存造血干细胞可持续数年，在冷冻过程中影响CFU-GM存活率的因素主要为冷冻过程中两个损伤因素，即细胞从液态转为固态细胞释放出的“融解热”，及细胞内冰晶的形成，程控冷冻使用“超冷”来抵消“融解热”，从而使细胞的降温曲线保持在以1℃/min降温，使细胞形成微细的冰晶不致于形成对细胞的损伤[3]。许多学者认为[4]，-80℃冰箱保存造血干细胞和液氮保存无显著差异。本文认为，液氮保存较为安全，但费用、设备条件要求高。-80℃冰箱保存比较方便。
参考文献
1 Mijovic A,et al.Blast Counts in blood progenitor cell(BPC) correlate with CD34+ cells and CFU-GM and are a useful predictor of haemopoietic recovery after autologous BPC transplantation collection.Bone Marrow Transplantation,1998,21∶869
, 百拇医药
2 Lowenthal RM,et al.Factors influencing haemopoietic recovery following chemotherapymobilised autologous peripheral blood progenitor cell transplantation for haematological malignancies∶a retrospective analysis of a 10-year single institution experience.Bone Marrow Transplantation,1998,22∶763
3 徐国珠，等.自体骨髓细胞的分离和冷冻保存.中华血液学杂志，1989，10∶547
4 范华骅，等.骨髓单个核细胞-80℃保存.中华血液学杂志，1996，17∶382
(1998年11月2日收稿), 百拇医药
单位：江苏省血液研究所，苏州医学院附属一院血液科，苏州，215006
关键词：自体外周血干细胞移植；恶性血液病；程控冷冻；细胞复苏
摘要 14例自体外周血干细胞移植中 摘要 14例自体外周血干细胞移植中，用程控冷冻仪冷冻、液氮保存造血干细胞，在病人预处理方案结束后，经静脉回输复苏之造血干细胞。结果：细胞植活及造血功能恢复良好，中性粒细胞>0.5×109/L，平均为11天，Plt>30×109/L，平均为21天。
中图法分类 R733；R318.52
Preliminary Study on the Programmed Freezing and Liquid Nitrogen Preservation of Autologous Peripheral Blood Hematopoietic Stem Cells
, 百拇医药
Chang Weirong，Xia Xueming,Wu Depei,et al
(Department of Hematology,First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou,215006)
Abstract The peripheral blood hematopoietic stem cells from 14 patients receiving autologous peripheral blood stem cell transplantation underwent programmed freezing and liquid nitrogen preserving.After conditioning regimen,the recovered stem cells were infused through vein,and hematopoietic reconstitution was good.The concentration of neutrophil was over 0.5×109/L and platelet over 30×109/L,and the survival time in average for neutrophil and platelet was 11 and 21 days respecticely.
, 百拇医药
Key words autologous peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation;hematologic malgnancies;programmed freezing;cell recovery
自体外周血造血干细胞移植中，造血干细胞的体外冷冻保存是移植成功的关键。我科自1995年以来对14例患者施行APBSCT，造血干细胞通过程控冷冻、液氮保存，均成功地进行了移植，初步报告如下。
1 资料和方法
1.1 病例：男10例，女4例。急性非淋巴细胞性白血病6例，急性淋巴细胞性白血病2例，霍奇金淋巴瘤4例，非霍奇金淋巴瘤1例，杂合型急性白血病1例。
1.2 冷冻保存液：①TC199培养基9.8g,EDTA-Na2 2.0g，NaHCO3 2.0g，加双蒸水至1000ml，pH 6.8～7.0，正压过滤，细菌、热源检测合格。②冷冻保存液：TCE保养液占70%，二甲亚砜(DMSO)占20%，人类同型或AB型血清占10%，使用前按上述比例配置混匀后置冰箱备用。
, http://www.100md.com
1.3 方法
1.3.1 造血干细胞采集：患者经大剂量米妥蒽醌、阿糖胞苷动员方案处理后，待白细胞数降至1.0×109/L以下时，以惠尔血(G-CSF)300μg/d皮下注射，待白细胞数回升时，用流式细胞仪监测CD34+细胞量，待CD34+细胞明显升高时，用CS-3000plus血细胞分离机采集造血干细胞，每次采集血量8000～14000ml，采集数量按MNC(4～6)×108/kg，CD34+细胞(2～4)×106/kg。
1.3.2 造血干细胞的冷冻保存：血细胞分离机采集之造血干细胞按(0.5～1.0)×108ml细胞浓度分装入深低温冷冻袋中，其中取出少许进行MNC计数，粒—单祖细胞(CFU-GM)培养及CD34+细胞测定，其余分别在冰浴内加入等量的冷冻保存液(终浓度分别为TC199保养液为35%，DMSO为10%，人类同型血清为5%)，充分混匀后封口，并立即放入Cryomed程控冷冻仪内冷冻至-90℃后移入液氮内长期保存。
, 百拇医药
1.4 结果
1.4.1 14例患者冷冻前后测定结果见表1。
表1 14例患者冷冻前后测定结果
例号
诊断
冷冻前细胞量
冷冻后回输细胞量
MNC
(×108/kg)
CD34+
(×106/kg)
, 百拇医药
CFU-GM
(×105/kg)
细胞活力
(%)
MNC
(×108/kg)
CD34+
(×106/kg)
CFU-GM
(×105/kg)
1
, http://www.100md.com
NHL
6.0
43.5
3.9
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4.8
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2.5
2
HD
1.6
8.8
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26.7
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2.3
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70
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5.2
/
6
M3
2.6
8.8
1.1
54
1.3
4.5
0.6
, 百拇医药
7
M5
16.0
7.2
39
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5.4
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8
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4.7
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10
M3
3.4
31
1.7
75
2.5
25.1
1.2
11
HAL
5.1
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7.3
2.0
54
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3.0
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12
M3
2.0
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0.9
49
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13
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12.0
2.2
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0.6
14
L2
, 百拇医药
4.4
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1.6
80
3.5
3.9
1.3
1.4.2 复苏和回输：冷冻袋从液氮中取出后，立即放入40℃恒温水浴中并不断轻轻摇晃，直至溶解(此过程一般为1～2min)，立即回输给病人，为了减少DMSO对造血干细胞的毒性，应在床边进行复苏解冻，并在5～10min内回输完毕，并取少许细胞进行CFU-GM培养，CD34+细胞检测及细胞活力测定。
1.4.3 移植后造血功能恢复情况：病人入净化病房，按不同病种进行预处理，一般在预处理方案结束24h左右回输解冻之造血干细胞。回输时仅部分病人口鼻中有DMSO气味及有刺痛感。移植后造血功能恢复(N≥0.5×109/L,Plt≥30×109/L)，结果见表2。表2 移植后造血功能恢复情况
, 百拇医药
例
号
诊断
采集日血象
造血功能恢复(d)
WBC(×109/L)
Plt(×109/L)
N≥0.5×109/L
Plt≥30×109/L
1
NHL
, 百拇医药
5.4
18
13
19
2
HD
7.7
29
10
22
3
HD
4.4
21
, 百拇医药
8
12
4
HD
5.3
60
9
11
5
HD
2.4
18
9
15
, 百拇医药
6
M3
6.2
37
9
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7
M5
1.2
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4.2
8
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34
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15
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L3
2.4
32
8
11
14
L2
1.8
26
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10
10
=11=212 讨论
造血干细胞采集的成功与否与所用动员方案直接相关，但部分患者动员不出，外周血中造血干细胞的量比正常略高，不足以采集，这与患者对动员方案不敏感或多次大剂量化疗后骨髓损伤有关，本组中2例分别采集4、7次，但CD34+细胞的量仍属低水平[1]。本组中细胞活力大多≥60%，且回输后造血功能均能恢复，但复苏后细胞的CFU-GM培养结果偏低，可能与细胞留置时间过长，DMSO对造血干细胞产生的毒性有关[2]。
, 百拇医药
液氮保存造血干细胞可持续数年，在冷冻过程中影响CFU-GM存活率的因素主要为冷冻过程中两个损伤因素，即细胞从液态转为固态细胞释放出的“融解热”，及细胞内冰晶的形成，程控冷冻使用“超冷”来抵消“融解热”，从而使细胞的降温曲线保持在以1℃/min降温，使细胞形成微细的冰晶不致于形成对细胞的损伤[3]。许多学者认为[4]，-80℃冰箱保存造血干细胞和液氮保存无显著差异。本文认为，液氮保存较为安全，但费用、设备条件要求高。-80℃冰箱保存比较方便。
参考文献
1 Mijovic A,et al.Blast Counts in blood progenitor cell(BPC) correlate with CD34+ cells and CFU-GM and are a useful predictor of haemopoietic recovery after autologous BPC transplantation collection.Bone Marrow Transplantation,1998,21∶869
, 百拇医药
2 Lowenthal RM,et al.Factors influencing haemopoietic recovery following chemotherapymobilised autologous peripheral blood progenitor cell transplantation for haematological malignancies∶a retrospective analysis of a 10-year single institution experience.Bone Marrow Transplantation,1998,22∶763
3 徐国珠，等.自体骨髓细胞的分离和冷冻保存.中华血液学杂志，1989，10∶547
4 范华骅，等.骨髓单个核细胞-80℃保存.中华血液学杂志，1996，17∶382
(1998年11月2日收稿), 百拇医药