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编号:10498979
丹参提取物F对胃粘膜主细胞的保护作用*
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 1999年第10期
     作者:周平 李和泉 永田博司

    单位:李和泉:中国医科大学病理生理教研室(沈阳110001);周平:现在日本滋贺医科大学解剖教研室

    关键词:胃粘膜;乙醇;钙

    中国病理生理杂志991021 摘要 目的:探讨丹参提取物F对胃粘膜主细胞的保护作用。方法:采用Pronase-EDTA法分离大鼠胃粘膜主细胞,观察乙醇对细胞的损伤作用及丹参提取物F对它的影响。结果:乙醇可使胃粘膜主细胞生存率下降,乳酸脱氢酶漏出增加及细胞内游离钙升高;丹参提取物F可减轻乙醇诱发的胃粘膜主细胞生存率下降,乳酸脱氢酶漏出增加及细胞内游离钙的升高。结论:丹参提取物F对乙醇诱发的胃粘膜主细胞损伤具有直接的细胞保护作用。其机制可能与减轻细胞内钙超载有关。

    Protective effect of Dan Shen extract-F on rat gastric
, 百拇医药
    chief cells in vitro

    ZHOU-Ping,LI He-Quan HIROSHI

    Department of Internal Medicine,Saiseikai Central Hospital,Tokyo,Japan(108)

    Nagata

    Department of Pathophysiology,China Medical University,Shenyang (110001)

    Abstract AIM:To study the protective effect of DSE-F on gastric chief cells.METHOD:Gastric chief cells were isolated from the rats with Pronase-EDTA.The effects of the injury by ethanol and DSE-F on the injured cells were observed respectively.RESULTS:Ethanol could cause a decline in cells survival and an increase in LDH release and the increase of [Ca2+]i concentration.DSE-F may reduced the effect caused by ethanol.CONCLUSION:DSE-F has protective effect on ethanol-induced cell injury.The mechanism may have something to do with cutting down intracellular Ca2+ overload.
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    MeSH Gastric mucosa;Alcohol,ethyl;Calcium

    临床上常可以见到乙醇引起的急性胃粘膜损伤,动物实验也证明了乙醇对胃功能及组织形态方面的破坏作用[1、2]。目前,很多学者致力于研究乙醇的损伤机制及其预防药物。丹参为常用的活血化瘀中药,在急慢性胃粘膜损伤的防治上已取得了满意的疗效,并已证明其有效部位是丹参提取物F(dan shen extract-F,DSE-F)[3]。但是,迄今DSE-F防治胃粘膜损伤的研究仍停留在整体实验阶段,尚需排除血液、神经、粘液等细胞外因素的作用以确定DSE-F能否直接保护胃粘膜细胞。本研究首先分离出大鼠胃粘膜主细胞,然后加入乙醇和/或DSE-F,观察乙醇对游离主细胞的损伤作用及DSE-F对主细胞的直接保护作用。

    材料与方法

    (一)动物:健康Wistar雄性大鼠,体重(250±20) g,中国医科大学动物部提供。
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    (二)主要药品:DSE-F(每毫升含1g生药)由中国医科大学检测中心提供。Pronase、HEPES、Fura-2/AM、DMSO为美国Sigma公司产品;Percoll为日本フャルマシヤバィオテワ公司生产。

    (三)仪器:日立-850型荧光分光光度计。

    (四)胃粘膜主细胞悬液制备[4]: (1)溶液的配制,A液:NaH2PO4 0.5、Na2HPO4 1、NaHCO3 20、NaCl80、KCl5、HEPES50、glucose11和EDTA2mmol/L,2%BSA。B液:基本同A液,但不加EDTA,而加CaCl21和MgCl21.5 mmol/L,BSA浓度为1%。C液:BSA浓度为0.1%,余同B 液。消化液:在A液中加入Pronase(1000 U/mL)。(2)分离方法:将大鼠脱颈处死取胃,制成粘膜外翻的腺胃胃囊,囊内注入Pronase消化液,通入含5% CO2,95%O2的混合气体,在37℃振荡水浴中孵育90 min→室温下磁力搅拌30 min→置于27% percoll溶液中离心(190×g,15 min),去上清即得到胃粘膜主细胞,将其制成每毫升为2×106个细胞的细胞悬液。
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    (五)观察指标及方法:

    (1) 细胞生存率的测定:用台盼蓝拒染法测定细胞生存率,10 min内计数200个以上细胞。

    (2) 乳酸脱氢酶(LDH)测定:将细胞孵育液离心(3000 r/min,10 min),上清含细胞漏出的LDH,按2,4-二硝基苯肼显示法[5] 测定孵育液中LDH活性。结果以U/106 cell表示。

    (3) Fura-2负载及荧光测定[6]:将上述细胞悬液37℃预温5 min后,加入Fura-2/AM(终浓度为3 μmol.L-1)37℃水浴中振荡孵育45 min,洗涤,调整负载后的细胞悬液仍为每毫升2×106个细胞。荧光测定条件:光栅10 nm,激发波长345 nm,发射波长490 nm。观察不同实验条件下荧光强度的变化。根据Grynkiewicz公式算出[Ca2+]i浓度。
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    (六) 数据处理:实验数据均以平均数±标准差(±s)表示,组间差异的比较采用t检验法。

    结果

    一、 乙醇对胃粘膜主细胞生存率的影响:

    孵育液中分别加入磷酸盐缓冲液(对照组)和不同浓度的乙醇,结果为1%乙醇组的细胞生存率是90.44%±3.27%,与对照组的93.92%±2.18%相比,P>0.05;但5%和10%乙醇的细胞生存率分别为69.19%±3.12%和25.36%±5.45%,明显低于对照组,P均<0.01。

    二、 乙醇对胃粘膜主细胞LDH漏出量的影响:

    对照组LDH的漏出量为(0.3339±0.0333) U/106 cell;1%乙醇组为(0.3180±0.0340) U/106 cell,与对照组相比,P>0.05;而5%和10%乙醇组分别为(0.4912±0.0306) U/106 cell和(0.5515±0.0304) U/106 cell,均明显高于对照组,P<0.01。
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    细胞生存率与细胞LDH漏出量之间存在显著的负相关关系,r=-0.8945,P<0.01。表明细胞生存率和LDH漏出量均可反映细胞的损伤程度。

    三、乙醇对胃粘膜主细胞内游离钙([Ca2+]i)的影响:

    在细胞外钙浓度为1mmol.L-1条件下,应用本法分离的胃粘膜主细胞静息状态时[Ca2+]i为(239.1±34.8) nmol.L-1(n=24)。加入乙醇后,可以引起[Ca2+]i上升,并呈剂量依赖关系,1.5%乙醇组的[Ca2+]i为(289.2±17.2) nmol.L-1;3%乙醇组的[Ca2+]i为(396.3±43.0) nmol.L-1;5%乙醇组的[Ca2+]i为(447.8±37.6) nmol.L-1;与静息状态[Ca2+]i比较,P均<0.01。
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    四、 DSE-F对5%乙醇诱发胃粘膜主细胞损伤时的细胞生存率的影响:

    在细胞孵育液中分别加入磷酸盐缓冲液(对照组),0.5%(Ⅰ)、1%(Ⅱ)、4%(Ⅲ)的DSE-F。15 min后加乙醇,浓度为5%。1 h后,对照组的细胞生存率为72.45%±3.35%;DSE-FⅠ组和DSE-F Ⅱ组的细胞生存率分别为89.26%±2.51%和86.10%±2.92%,与对照组相比,P均<0.01;但DSE-FⅢ组的细胞生存率为73.30%±2.80%,与对照组比较,P>0.05。

    五、 DSE-F对5%乙醇诱发胃粘膜主细胞损伤时的LDH漏出量的影响:

    加入磷酸盐缓冲液和0.5、1、4%的DSE-F后15 min,再加入乙醇,浓度为5%,孵育1 h后,对照组LDH的漏出量为(0.4823±0.049) U/106 cell;DSE-FⅠ组和DSE-FⅡ组的漏出量分别为(0.3735±0.050和0.4074±0.026) U/106 cell,与对照组相比,P均<0.01;而DSE-FⅢ组的漏出量为(0.4894±0.084) U/106 cell,与对照组比,P>0.05。
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    六、 DSE-F对乙醇所致[Ca2+]i升高的影响:

    加入5%乙醇后,[Ca2+]i上升为(447.80±37.57) nmol.L-1,与静息状态(232.30±32.94) nmol.L-1相比,P<0.01。1 min后再加入0.5% DSE-F,[Ca2+]i下降到(208.0±25.92) nmol.L-1,与5%乙醇组比较,P<0.01,与静息状态相比,P>0.05。

    讨论

    丹参具有明显地促进消化性溃疡愈合的作用,DSE-F是其抗溃疡作用的有效部位[7]。DSE-F抗溃疡作用的机制已从多方面进行了探讨,但迄今仍未完全阐明[8]。本文采用Pronase-EDTA法分离大鼠胃粘膜主细胞,用乙醇造成损伤,然后观察DSE-F的作用。结果是:1%乙醇对细胞生存率和LDH漏出量无明显影响;5%和10%乙醇细胞生存率明显降低,LDH显著增高,且与乙醇浓度呈依从关系,两指标间存在着显著的负相关,与文献报道相近[9]。其次,本实验看到:0.5%和1%DSE-F组能显著提高5%乙醇诱发的胃粘膜主细胞损伤时的细胞生存率,降低LDH漏出量,表明DSE-F对乙醇性胃粘膜主细胞有直接保护作用。但是,4%DSE-F组并未显示这种保护作用,原因未明,有待进一步研究。
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    细胞内Ca2+浓度的变化是维持细胞生理功能的重要物质基础之一。乙醇损伤胃粘膜细胞的机制可能在于引起细胞钙超载[10]。本实验采用Fura-2技术测定了胃粘膜主细胞内游离钙浓度([Ca2+]i),发现DSE-F能显著地降低5%乙醇诱发的[Ca2+]i升高,提示DSE-F对胃粘膜主细胞的保护作用的机制之一与减轻细胞内钙超载有关。

    (致谢:本实验得到北京医科大学生理教研室李铁教授的热情帮助,在此表示衷心的感谢。)

    * 国家自然科学基金资助

    日本庆大学医学部济生会中央病院内科(东京108) 永田博司
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    参考文献

    1 Bravo ML,Escolar G,Navarro C,et al.Morphological study of gastric lesions developing in the rat under several damaging conditions: modifications induced by pretreatment with zine acexamate.Scanning Microsc,1992,6:855.

    2 Cherner JA,Naik L,Tarnawski A,et al.Ability of prostaglandin to ethanol injury to dispersed chief cells form guinea pig stomach.Am J Physiol,1989,256(4 Pt 1):G 704.

    3 周平,李和泉.丹参提取物F对大鼠乙酸一消炎痛胃溃疡愈合的影响.中国病理生理杂志,1997,3:479.
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    4 漆谷 郎.ラツト胃粘膜细胞の单离并ぴに避细胞の精制.见:罔部进编集.脏器机能测定法.东京庆川书店,1992.724~728.

    5 湖南医学院第二附医院检验科.乳酸脱氢酶测定.临床生化检验.湖南科技出版社,1981.227~229.

    6 Grynkiewicz G,Poenic M,Tsien RY.A new generatioin of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properities.J Biol Chem,1985,260:3440.

    7 李和泉,等.丹参抗溃疡作用的实验研究.中国医科大学学报,1985, 14:89.

    8 高明奇,李和泉.丹参提取物F对大鼠乙醇性胃粘膜损伤的影响及其机制的研究.中国病理生理杂志,1993,9:644.
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    9 Kobayashi K,Arakawa T,Nakamura A,et al.Protective effect of sofalcone and 16,16-dimethyl-PGE2 on isolated rat gastric cells.J Clin Gastrocenterol,1990,12(Suppl.1):S177.

    10 二木修司,六反一仁,中村圭也,他.エタノ一ルによる[Ca2+]i上声に伴うモルモツト单离胃壁细胞の酸分泌机构の变化.日本消化器病学杂志,1992,89:1484

    (1998年5月25日收稿,1999年3月1日修回), 百拇医药