人β-NGF基因的体外扩增、克隆及其序列的分析
作者：韩晓枫 张澜生 朱寿彭
单位：韩晓枫(无锡市第二人民医院中心实验室，无锡，214002)；张澜生 朱寿彭(苏州医学院细胞免疫研究中心)
关键词：β-神经生长因子；聚合酶链反应；克隆；序列分析
苏州医学院学报991209 摘要 目的 对人β-NGF基因进行体外扩增和克隆及其序列分析，为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法 本实验设计并合成一对特异性引物，采用聚合酶链反应分别从人脑cDNA和人睾丸cDNA以及人脑基因组DNA中扩增出β-神经生长因子(β-NGF)基因，并和T4载体相连接，经筛选得到人β-NGF克隆，并用Sanger双脱氧末端终止法进行序列分析。结果 凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论 阳性克隆经序列分析证明克隆基因序列正确。
中图分类 R392.2
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Amplification,Cloning in Vitro and Sequence Analysis of Hu man β-NGF Gene
Han Xiaofeng, Zhang Lansheng, Zhu Shoupeng
(The Central Lab.of Wuxi Second people′s Hospital, Wuxi, 214002 )
Abstract Objective To amplificate，clone in vitro and analyse sequence of human β-NGF gene for its expression in the mammalian cells and the clinical application. Methods In this paper,a pair of specific primers has been designed and synthesizied. The cDNA encoding for mature β-NGF was successfully obtained from human brain cDNA、human testis cDNA library and h uman brain genomic DNA respectively by using polymerase chain reaction.Then,the cDNA of β-NGF gene was inserted in to pGEM-T4 vector and did its sequencing analysis by Sanger's method. Results Gel electrophoresis shows that the positive bands appear in the p rospective place.Conclusion right cloned gene sequence is confi rmed by sequence analysis.
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Key words β-NGF; PCR; Cloning; Sequencing Analysis
神经生长因子是最早被发现，也是被了解最多的细胞生长调节因子。它不仅在神经元的存活、生长、发育和分化及损伤修复与再生等方面具有重要的作用，还参与免疫反应，促进伤口愈合和血细胞生长，并具有抑制肿瘤生长和防止神经元退变的作用[1，2]。神经生长因子的生物学活性主要表现在β-亚基上。而β-NGF是由两条含118个氨基酸残基以非共价键组成的同源二聚体。其氨基酸和cDNA序列也已确定[3]。鉴于β-NGF的生理作用，使其在临床治疗神经损伤及Alzheimer病等方面有一定的应用前景。因而，本研究根据β-NGF基因的全长序列，设计并合成特异性引物，从人脑基因组DNA，人脑cDNA文库和人睾丸cDNA文库中，克隆筛选出全长β-NGFcDNA片段，经连接反应，转化宿主细胞后筛选出阳性克隆，并进行序列分析和论证。旨在为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。
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1 材料和方法
1.1 材料：人脑cDNA和人睾丸cNDA文库购自Clontech公司；限制性内切酶BamHI和XbaI购自Boehringer Mannheim公司； PGEM-T4 Vector System、Tag DNA Polymerase和Cycle Se quencing Kit购自Promega公司； dNTP购自Amersham公司； 32P-dATP为 杜邦公司产品；QIA- Plasmid Kit和QIAquick Gel Extraction Kit购自Gene公司；人DNA/ECOR I + Hind III Ma rker, x-Gal,IPTG购自GIBCO BRL公司。DH5α为复旦大学生命科学院提供。
1.2 方法：
1.2.1 引物设计：按Ullrich等报告的β-NGF的cDNA序列，输入基因库(Genbank)，从中选择最佳引物序列P1、P2,并合成之。
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1.2.2 人脑组织基因组DNA的制备：按文献[4]取新鲜正常的尸脑组织，剪碎后，于10倍体积SSC-EDTA缓冲液(0.15mol/LNaCl，0.15mol/L柠檬酸三钠，1mmol/LEDTA，pH7.6)中制成匀浆。并加入SDS至终浓度为2%。用终浓度为50μg/ml的ProteinaseK进行消化。用酚-氯仿抽提，收集DNA后，以无水乙醇洗涤。干燥后，溶于消毒双蒸水中，4℃贮存备用。
1.2.3 聚合酶链反应(PCR)：取上述人脑基因组DNA，人脑cDNA和人睾丸cDNA文库为模板，以P1和P2进行PCR扩增。25μl反应体系，10×Reaction Buffer 2.5μl，MgCl21.0μl，dNTP0.5μl，P10.3μl，P20.3μl，TagDNA酶0.2μl，模板1μl(1μgDNA)，ddH2O19.2μl，石腊油1滴，离心机混匀。93℃变性3min，93℃1min、59℃1min、72℃1.5min循环35周期，72℃延伸10min，4℃保存。取5μlPCR产物经1%琼脂糖电泳，加入DNA/EcoRI+HindIII为Marker，紫外灯下观察。以低熔点胶回收并纯化扩增片段。
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1.2.4 DNA片段与T4载体的连接和转化及其筛选：取PGEM-T4载体1μl，10×Buffer1μl，T4DNAligase(3U/μl)1μl，PCR产物4μl，ddH2O9μl，混匀，于14℃连接过夜。取连接产物10μl于1.5ml的Eppendorf管中，加入200μlDH5α感受态细胞悬液，冰浴30min，42℃休克90s。加入400μlLB培养基，37℃200r/min，45～60min。5000r/min离心15min。弃部分上清，留200μl重悬细胞，均匀涂于含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的琼脂平皿上，37℃培养过夜。利用Lac基因插入失活显色反应，筛选出含有插入片段的白色阳性克隆。并抽提质粒，1%琼脂糖电泳。
1.2.5 DNA序列分析：取10×PNKBuffer0.3μl，γ-32P-dATP0.5μl;载体引物1.5μl;ddH2O1.1μl于0.5mlEppendorf管中，混匀，37℃10min，65℃10min标记引物(有效标记反应的放射性核素标记率应≥70%)。按下列体系进行测序反应：10×Sequence Buffer2.4μl，DNA多聚酶1μl，质粒模板2μl(100ng)，标记引物3μl，ddH2O8.6μl于0.5ml的Eppendorf管中，加入石腊油1滴。93℃变性3min，93℃1min，60℃1min，72℃1.5min，循环35周期。72℃延伸5min，加入反应中止液，高速离心30s，弃去石腊油。95℃10min变性，立即置冰上。上样3μl，电压1800V，进行测序电泳，待电泳至指示剂达适当位置。下胶，以保鲜膜封胶，压片，-80℃放射自显影[5]。按放射性活度，进行曝光处理后冲片，读出序列。
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2 结果
2.1 β-NGF基因PCR扩增结果：应用PCR技术，分别从人脑组织基因组DNA、人脑cDNA和人睾丸cDNA文库中，克隆筛选出目的DNA片段。图1所示，在预期位置出现目的DNA泳动区带。
图1 PCR电泳结果图
1 DNA/EcoRⅠ+HindⅢMaker
2 人脑基因组PCR扩增产物
3 人脑cDNA文库PCR扩增产物
4 人睾丸cDNA文库PCR扩增产物
2.2 重组载体(pGEM-T4-NGF)阳性克隆的筛选结果：挑选白色单克隆菌落，沸水浴10min。离心后取上清作模板，以特异性引物P1和P2行PCR筛选。结果如图2所示，在预期位置出现阳性条带。
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图2 阳性克隆PCR产物电泳图
1.5 阳性克隆PCR扩增产物
6. DNA/EcoRⅠ+HindⅢMaker
2.3 Sanger双脱氧末端终止法序列分析结果：以载体通用正、反引物，对重组载体T4-PGEM-NGF进行插入片段的序列分析。测序结果和文献报告一致[2]，图3为部分序列读片结果。
图3 插入片段部分序列读片结果
3 讨论
NGF基因自Scott首次克隆出来后，多种动物的编码NGF的基因克隆也相继获得[6]，经序列比较，不同种属来源的β-NGF基因序列高度同源最高可达98%[7，8]。已有研究表明，NGF基因为单拷贝基因，定位于第一染色体短臂，为编码307个氨基酸残基的前体。而成熟的β-NGF仅由单一外显子编码，即无内含子[9]。为给基因治疗和临床研究提供依据，我们在β-NGF的5′端和3′端根据碱基互补的原则，设计并合成了特异性寡核苷酸。并以3种材料作为PCR扩增β-NGF基因编码序列的模板，其中2种分别为人脑cDNA和人睾丸cDNA文库，另一种是易获得的人脑基因组DNA(A260/280≥1.9)，且蛋白含量较低。因而使β-NGF基因片段的扩增能顺利进行。在PCR反应时，考虑到基因组DNA分子较大，变性困难，因而在第1个PCR循环时，可将样品沸水浴5min，以使基因组DNA充分变性。
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经1%琼脂糖电泳结果表明，本实验以3种材料为模板进行PCR体外扩增中，结果均获得一条长度相同的扩增区带，且条带出现在预期的位置，这与理论上分析β-NGF编码序列的长度相同。同时，也进一步证实β-NGF是由单一外显子编码的。
Sanger双脱氧末端终止法[10]主要是在测序反应中加入了2′,3′-双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)。因而在DNA聚合酶催化合成过程中，遇到应该dNTP掺入的位置就有两种情况发生：如果正常dNTP掺入，则链可以延伸。如果ddNTP掺入，则合成反应中止。因而可得出一系列不同长度的以ddA、ddC、ddG和ddT结尾的片段。经过能分辨相差一个核苷酸长度的聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影后，即可在凝胶片上直接“读出”碱基序列。而载体引物是化学合成的一小段与紧邻多切口接头的质粒序列互补的寡核苷酸。因此，本实验用载体引物对重组载体插入片段的序列进行分析，证实结果的可靠性。同时，也为进一步探讨和研究β-NGF基因的克隆和表达提供了提供了科学的依据。
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参考文献
1 Levi-Montalcini R,et al. Nerve growth factor: from neurotrophi n to neurokine. TINS, 1996, 19(9)∶514
2 Missale C, et al. Nerve growth factor suppresses the tumoral phenotyp e of human prolactinomas. Horm.Res, 1997, 47∶240
3 Ullrich A, et al. Human β- nerve growth factor gene sequence highly homologus to that of mouse. Nature, 1983, 303∶821
4 陈俊杰，等. 脑的分子生物学技术. 中华神经精神科杂志，1989, 22(6)∶346 ～348
, 百拇医药
5 朱寿彭. 放射自显影示踪学.北京∶原子能出版社， 1995∶20～53
6 Scott J, et al. Isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the precursor of mouse nerve growth factor. Nature, 1983, 302∶538
7 Bax B, et al. Structure of mouse 7SNGF: a complex of nerve growth fac tor with for binding proteins. Structure, 1997, 5(10)∶1275
8 Soderstrom S, Hallbook F, Ibanez CF. et al. Recombinant human β-nerv e growth factor(NGF): biological activity and properties in an enzyme immunoass ay. J Neurosci Res. 1990, 27∶665
9 Levi-Montalcini R. The nerve growth factor 35 years later. Science, 1987, 237∶1154
10Sambrook J, et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989∶629～650
(1999年8月30日收稿), 百拇医药
单位：韩晓枫(无锡市第二人民医院中心实验室，无锡，214002)；张澜生 朱寿彭(苏州医学院细胞免疫研究中心)
关键词：β-神经生长因子；聚合酶链反应；克隆；序列分析
苏州医学院学报991209 摘要 目的 对人β-NGF基因进行体外扩增和克隆及其序列分析，为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法 本实验设计并合成一对特异性引物，采用聚合酶链反应分别从人脑cDNA和人睾丸cDNA以及人脑基因组DNA中扩增出β-神经生长因子(β-NGF)基因，并和T4载体相连接，经筛选得到人β-NGF克隆，并用Sanger双脱氧末端终止法进行序列分析。结果 凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论 阳性克隆经序列分析证明克隆基因序列正确。
中图分类 R392.2
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Amplification,Cloning in Vitro and Sequence Analysis of Hu man β-NGF Gene
Han Xiaofeng, Zhang Lansheng, Zhu Shoupeng
(The Central Lab.of Wuxi Second people′s Hospital, Wuxi, 214002 )
Abstract Objective To amplificate，clone in vitro and analyse sequence of human β-NGF gene for its expression in the mammalian cells and the clinical application. Methods In this paper,a pair of specific primers has been designed and synthesizied. The cDNA encoding for mature β-NGF was successfully obtained from human brain cDNA、human testis cDNA library and h uman brain genomic DNA respectively by using polymerase chain reaction.Then,the cDNA of β-NGF gene was inserted in to pGEM-T4 vector and did its sequencing analysis by Sanger's method. Results Gel electrophoresis shows that the positive bands appear in the p rospective place.Conclusion right cloned gene sequence is confi rmed by sequence analysis.
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Key words β-NGF; PCR; Cloning; Sequencing Analysis
神经生长因子是最早被发现，也是被了解最多的细胞生长调节因子。它不仅在神经元的存活、生长、发育和分化及损伤修复与再生等方面具有重要的作用，还参与免疫反应，促进伤口愈合和血细胞生长，并具有抑制肿瘤生长和防止神经元退变的作用[1，2]。神经生长因子的生物学活性主要表现在β-亚基上。而β-NGF是由两条含118个氨基酸残基以非共价键组成的同源二聚体。其氨基酸和cDNA序列也已确定[3]。鉴于β-NGF的生理作用，使其在临床治疗神经损伤及Alzheimer病等方面有一定的应用前景。因而，本研究根据β-NGF基因的全长序列，设计并合成特异性引物，从人脑基因组DNA，人脑cDNA文库和人睾丸cDNA文库中，克隆筛选出全长β-NGFcDNA片段，经连接反应，转化宿主细胞后筛选出阳性克隆，并进行序列分析和论证。旨在为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。
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1 材料和方法
1.1 材料：人脑cDNA和人睾丸cNDA文库购自Clontech公司；限制性内切酶BamHI和XbaI购自Boehringer Mannheim公司； PGEM-T4 Vector System、Tag DNA Polymerase和Cycle Se quencing Kit购自Promega公司； dNTP购自Amersham公司； 32P-dATP为 杜邦公司产品；QIA- Plasmid Kit和QIAquick Gel Extraction Kit购自Gene公司；人DNA/ECOR I + Hind III Ma rker, x-Gal,IPTG购自GIBCO BRL公司。DH5α为复旦大学生命科学院提供。
1.2 方法：
1.2.1 引物设计：按Ullrich等报告的β-NGF的cDNA序列，输入基因库(Genbank)，从中选择最佳引物序列P1、P2,并合成之。
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1.2.2 人脑组织基因组DNA的制备：按文献[4]取新鲜正常的尸脑组织，剪碎后，于10倍体积SSC-EDTA缓冲液(0.15mol/LNaCl，0.15mol/L柠檬酸三钠，1mmol/LEDTA，pH7.6)中制成匀浆。并加入SDS至终浓度为2%。用终浓度为50μg/ml的ProteinaseK进行消化。用酚-氯仿抽提，收集DNA后，以无水乙醇洗涤。干燥后，溶于消毒双蒸水中，4℃贮存备用。
1.2.3 聚合酶链反应(PCR)：取上述人脑基因组DNA，人脑cDNA和人睾丸cDNA文库为模板，以P1和P2进行PCR扩增。25μl反应体系，10×Reaction Buffer 2.5μl，MgCl21.0μl，dNTP0.5μl，P10.3μl，P20.3μl，TagDNA酶0.2μl，模板1μl(1μgDNA)，ddH2O19.2μl，石腊油1滴，离心机混匀。93℃变性3min，93℃1min、59℃1min、72℃1.5min循环35周期，72℃延伸10min，4℃保存。取5μlPCR产物经1%琼脂糖电泳，加入DNA/EcoRI+HindIII为Marker，紫外灯下观察。以低熔点胶回收并纯化扩增片段。
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1.2.4 DNA片段与T4载体的连接和转化及其筛选：取PGEM-T4载体1μl，10×Buffer1μl，T4DNAligase(3U/μl)1μl，PCR产物4μl，ddH2O9μl，混匀，于14℃连接过夜。取连接产物10μl于1.5ml的Eppendorf管中，加入200μlDH5α感受态细胞悬液，冰浴30min，42℃休克90s。加入400μlLB培养基，37℃200r/min，45～60min。5000r/min离心15min。弃部分上清，留200μl重悬细胞，均匀涂于含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的琼脂平皿上，37℃培养过夜。利用Lac基因插入失活显色反应，筛选出含有插入片段的白色阳性克隆。并抽提质粒，1%琼脂糖电泳。
1.2.5 DNA序列分析：取10×PNKBuffer0.3μl，γ-32P-dATP0.5μl;载体引物1.5μl;ddH2O1.1μl于0.5mlEppendorf管中，混匀，37℃10min，65℃10min标记引物(有效标记反应的放射性核素标记率应≥70%)。按下列体系进行测序反应：10×Sequence Buffer2.4μl，DNA多聚酶1μl，质粒模板2μl(100ng)，标记引物3μl，ddH2O8.6μl于0.5ml的Eppendorf管中，加入石腊油1滴。93℃变性3min，93℃1min，60℃1min，72℃1.5min，循环35周期。72℃延伸5min，加入反应中止液，高速离心30s，弃去石腊油。95℃10min变性，立即置冰上。上样3μl，电压1800V，进行测序电泳，待电泳至指示剂达适当位置。下胶，以保鲜膜封胶，压片，-80℃放射自显影[5]。按放射性活度，进行曝光处理后冲片，读出序列。
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2 结果
2.1 β-NGF基因PCR扩增结果：应用PCR技术，分别从人脑组织基因组DNA、人脑cDNA和人睾丸cDNA文库中，克隆筛选出目的DNA片段。图1所示，在预期位置出现目的DNA泳动区带。
图1 PCR电泳结果图
1 DNA/EcoRⅠ+HindⅢMaker
2 人脑基因组PCR扩增产物
3 人脑cDNA文库PCR扩增产物
4 人睾丸cDNA文库PCR扩增产物
2.2 重组载体(pGEM-T4-NGF)阳性克隆的筛选结果：挑选白色单克隆菌落，沸水浴10min。离心后取上清作模板，以特异性引物P1和P2行PCR筛选。结果如图2所示，在预期位置出现阳性条带。
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图2 阳性克隆PCR产物电泳图
1.5 阳性克隆PCR扩增产物
6. DNA/EcoRⅠ+HindⅢMaker
2.3 Sanger双脱氧末端终止法序列分析结果：以载体通用正、反引物，对重组载体T4-PGEM-NGF进行插入片段的序列分析。测序结果和文献报告一致[2]，图3为部分序列读片结果。
图3 插入片段部分序列读片结果
3 讨论
NGF基因自Scott首次克隆出来后，多种动物的编码NGF的基因克隆也相继获得[6]，经序列比较，不同种属来源的β-NGF基因序列高度同源最高可达98%[7，8]。已有研究表明，NGF基因为单拷贝基因，定位于第一染色体短臂，为编码307个氨基酸残基的前体。而成熟的β-NGF仅由单一外显子编码，即无内含子[9]。为给基因治疗和临床研究提供依据，我们在β-NGF的5′端和3′端根据碱基互补的原则，设计并合成了特异性寡核苷酸。并以3种材料作为PCR扩增β-NGF基因编码序列的模板，其中2种分别为人脑cDNA和人睾丸cDNA文库，另一种是易获得的人脑基因组DNA(A260/280≥1.9)，且蛋白含量较低。因而使β-NGF基因片段的扩增能顺利进行。在PCR反应时，考虑到基因组DNA分子较大，变性困难，因而在第1个PCR循环时，可将样品沸水浴5min，以使基因组DNA充分变性。
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经1%琼脂糖电泳结果表明，本实验以3种材料为模板进行PCR体外扩增中，结果均获得一条长度相同的扩增区带，且条带出现在预期的位置，这与理论上分析β-NGF编码序列的长度相同。同时，也进一步证实β-NGF是由单一外显子编码的。
Sanger双脱氧末端终止法[10]主要是在测序反应中加入了2′,3′-双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)。因而在DNA聚合酶催化合成过程中，遇到应该dNTP掺入的位置就有两种情况发生：如果正常dNTP掺入，则链可以延伸。如果ddNTP掺入，则合成反应中止。因而可得出一系列不同长度的以ddA、ddC、ddG和ddT结尾的片段。经过能分辨相差一个核苷酸长度的聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影后，即可在凝胶片上直接“读出”碱基序列。而载体引物是化学合成的一小段与紧邻多切口接头的质粒序列互补的寡核苷酸。因此，本实验用载体引物对重组载体插入片段的序列进行分析，证实结果的可靠性。同时，也为进一步探讨和研究β-NGF基因的克隆和表达提供了提供了科学的依据。
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参考文献
1 Levi-Montalcini R,et al. Nerve growth factor: from neurotrophi n to neurokine. TINS, 1996, 19(9)∶514
2 Missale C, et al. Nerve growth factor suppresses the tumoral phenotyp e of human prolactinomas. Horm.Res, 1997, 47∶240
3 Ullrich A, et al. Human β- nerve growth factor gene sequence highly homologus to that of mouse. Nature, 1983, 303∶821
4 陈俊杰，等. 脑的分子生物学技术. 中华神经精神科杂志，1989, 22(6)∶346 ～348
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5 朱寿彭. 放射自显影示踪学.北京∶原子能出版社， 1995∶20～53
6 Scott J, et al. Isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the precursor of mouse nerve growth factor. Nature, 1983, 302∶538
7 Bax B, et al. Structure of mouse 7SNGF: a complex of nerve growth fac tor with for binding proteins. Structure, 1997, 5(10)∶1275
8 Soderstrom S, Hallbook F, Ibanez CF. et al. Recombinant human β-nerv e growth factor(NGF): biological activity and properties in an enzyme immunoass ay. J Neurosci Res. 1990, 27∶665
9 Levi-Montalcini R. The nerve growth factor 35 years later. Science, 1987, 237∶1154
10Sambrook J, et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989∶629～650
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