乌头碱羟基琥珀酰亚胺酯及其BSA结合物的制备
作者：赵怀清 服部征雄
单位：赵怀清(沈阳药科大学基础部，沈阳 110015；); 服部征雄(日本富山医科药科大学和汉药研究所，930—01 日本富山)
关键词：乌头碱；半抗原；N-羟基琥珀酰亚胺酯；抗原性BSA结合物；合成
沈阳药科大学学报000108 摘 要：为建立乌头碱酶免疫测定法，合成了乌头碱衍生物，用羟基琥珀酰亚胺酯的方法制备半抗原(活性酯)，并用其半抗原与BSA(Bovine Serum Albumin)在有机溶媒/磷酸缓冲液(pH7.3)的条件下制备了抗原性BSA结合物.结果显示，这种活性酯的方法可用于乌头碱酶免疫测定法中与BSA或酶交联的有效方法.
分类号：R914.4
The Preparation of Aconitine N-Hydroxysuccinimide Esters and Their Reactivities with Bovine Serum Albumin
, 百拇医药
Zhao Huaiqing,(Department of Basic Courses,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015;)
Hattori Masao
(Toyama Medical and Pharmaceutical University,Toyama,930～01,Japan)
Abstract：In order to establish the enzyme immunoassay of aconitine,aconitine derivatives were synthesized,which is called the chemical bridge.The preparation of the hapten of aconitine was carried out by the N-hydroxysuccinimide esters method.These activated esters were covalently linked to BSA(Bovine Serum Albunin)in an organic solvent/phosphate buffer(pH 7.3) employing 1∶30 molar ratio of the aconitine to protein.The results indicated that the activated ester method would be useful for enzyme labeling in enzyme immunoassay of aconitine in respect of simplicity and reproducibility.
, 百拇医药
Key words：aconitine;hapten;N-hydroxysuccinimide ester;immunogenic conjugate；synthesis▲
乌头碱(aconitine)是附子(aconiti Tuber)中的主要成分，也是毒性很强的成分，但经肠内代谢之后可以转变为无毒的次乌头碱(lipoaconitine)〔1〕.为建立乌头碱酶免疫测定法，以测定其肠内代谢产物含量，合成了乌头碱的衍生物，并用羟基琥珀酰亚胺酯与BSA交联制备乌头碱的抗原性BSA结合物(immunogenic conjugate).
1 合成路线设计
乌头碱8位羟基的醋酸酯易与长链脂肪酸发生置换反应〔2〕，基于此，合成了2种衍生物.以乌头碱为原料，三甲基吡啶为催化剂，分别与十六碳二酸和琥珀酸反应，得到的衍生物1(AH)和衍生物2(AS)，在DCC(N，N′-Dicyclohexyl-carbodiimide)的存在下，与羟基琥珀酰亚胺缩合，得到了2种羟基琥珀酰亚胺酯(半抗原A(AHHS)和B(ASHS)，也称活性酯).得到的半抗原A和B，分别在pH 7.3的水溶液中与BSA反应，生成抗原性BSA结合物Ⅰ(AHHS-BSA)和Ⅱ(ASHS-BSA).见图1.
, 百拇医药
Fig.1 Synthesis of the derivatives of aconitine and its immungenic conjugate
2 实验部分
熔点用Yanagimoto显微熔点测定仪测定，未校正；旋光度用JASCO DIP-360型旋光仪在20℃下测定；IR光谱用JASCO FT/IR-230红外分光光度计测定；核磁共振光谱用Varian Unitityplus 500及Gemini-300型核磁共振仪测定，CDCl3为溶媒，TMS为内标；AP-MS用Perkin-Elmer SCIEX APIⅢ型质谱仪测定.
2.1 衍生物的制备
2.1.1 衍生物1(AH)的制备
称取乌头碱(标准品)12.3 mg(0.019 mmol)，溶解于THF(0.5 mL)中，另取Hexadecanedionic Acid 93.1 mg(0.33 mmol)，加入三甲基吡啶(0.5 mL)，将两溶液混合，搅拌下于70℃回流5 h，减压除去溶媒，白色残渣经硅胶柱层析(CHCl3—MeOH=8∶2)精制，得到无色油状物1(14.2 mg，回收率85.5%).[α]20D+4.0(C=0.7，CHCl3).IRνKBrmaxcm-1：3482(OH)，1722()，1606，1582，1450(—C6H5).1H-NMR(CDCl3)δ：1.12(3H，t，J=7.0 N—CH2—CH3)，3.17(3H,s,6—OCH3)，3.28(3H,s，1—OCH3)，3.30(3H,s,18—OCH3)，3.77(3H，s，16—OCH3)，3.33(1H，d，J=6 Hz，C16—H)，4.87(1H,d，J=5.5 Hz，C14—H)，7.44～7.48(2H)，7.56～7.59(1H)，8.02～8.04(2H)(—C6H5)，2.35(2H，t，J=7.5 Hz，—COCH2—CH2—)，1.65(2H，t,J=7.5 Hz，—CH2—CH2—COOH).13C-NMR(CDCl3)δ：175.2(—COOH).API—MS m/z：(positive)872(M+H)+，(negative)870(M-H)+.
, 百拇医药
2.1.2 衍生物2(AS)的合成
称取乌头碱29.6 mg(0.046mmol)，溶解于THF(1.5mL)中，另取琥珀酸123.5 mg(1.05 mmol)，加入三甲基吡啶(0.12mL)，70℃搅拌下回流20h，减压除去溶媒.残渣用硅胶柱(CHCl3—MeOH=7∶3)层析精制，得无色油状物2(21.8mg，收率为67.7%).[α]20D-0.5°(C=0.8，CHCl3).IRνKBrmaxcm-1：3450(OH)，1729()，1660，1582，1455(—C6H5).1H-NMR(CDCl3)δ：1.11(3H,t,J=7.0 Hz，N—CH2—H3)，3.17(3H，s，6—OCH3)，3.28(3H，s，1—OCH3)，3.30(3H，s，18—OCH3)，3.77(3H，s，16—OCH3)，3.34(1H，d，J=5.5 Hz，C16—H)，4.87(1H，d，J=5.5 Hz，C14—H)，7.44～7.47(2H)，7.56～7.59(1H)，8.02～8.04(2H)(—C6H5)，2.61(2H，t，J=7.5 Hz)，—CO—CH3—CH2—)，1.75(2H，t，J=7.5 Hz，—CH2—CH2—COOH).13C-NMR(CDCl3)δ：175.3(—COOH)，API—MS m/z(positive)704(M+H)+，(negative)702(M-H)+.
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2.2 半抗原的制备
2.2.1 半抗原A的制备
方法1 取衍生物HA 23.5 mg(0.027 mmol)，溶解于CH2Cl2(3 mL)中，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺5.2 mg(0.05 mmol)和DCC 9.8 mg(0.05 mmol)，在室温下搅拌24 h，过滤，去除沉淀，减压除去滤液中的溶媒，残渣用硅胶柱(CHCl3—MeOH=19∶1)层析精制，得无色油状的羟基琥珀酰亚胺酯即半抗原A(17.2 mg，收率为65.9%).[α]20D+2.4(C=1.7，CHCl3).IRνKBrmaxcm-1：3450(—OH)，1780，1720()，1600，1582，1455(—C6H5).1H-NMR(CDCl3)δ：1.22(3H,t,J=7.0 Hz，N—CH2—CH3)，3.22(3H，s，6—OCH3)，3.28(3H，s，1—OCH3)，3.29(3H，s，18—OCH3)，3.76(3H，s，16—OCH3)，3.34(1H，d，J=5.5 Hz，C6—H)，4.91(1H，d，J=5.5 Hz)，7.44～7.48(2H)，7.56～7.59(1H)，8.02～8.04(2H)(—C6H5)，2.85(4H，s，8—succinimidyl).13C-NMR(CDCl3)δ：173.2(4C,8—succinimidyl).
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方法2 称取衍生物HA 24.7 mg(0.028 mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺3.91 mg(0.034 mmol)，溶解于二氧六环(2 ml)中，在0℃搅拌下加入EDC[1-Ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodimide HCl]6.52 mg(0.034 mmol)，然后，室温下搅拌24 h.反应液用醋酸乙酯稀释后，再用水洗，无水硫酸钠干燥，减压除去溶媒，残渣用硅胶柱(CHCl3-MeOH=19∶1)层析精制，得到无色油状的羟基琥珀酰亚胺酯即半抗原A(20.1 mg，收率为73.3%).
2.2.2 半抗原B的制备
称取衍生物SA 83.3 mg(0.12 mmol)，溶解于CH2Cl2(3 mL)中，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺21.5 mg(0.19 mmol)，DCC 31.7 mg(0.19 mmol)，室温下搅拌24 h，过滤，减压除去溶媒，残渣用硅胶柱(CHCl3-MeOH=19∶1)层析精制，得到无色油状的羟基琥珀酰亚胺酯即半抗原B(61.5 mg，收率为64.9%).[α]20D-1.4°(C=1.7，CHCl3).IRνKBrmax cm-1：3480(OH)，1780，1720()，1600，1582，1455(—C6H5).1H-NMR(CDCl3)δ：1.14(3H,t,J=7.0 Hz，N—CH2—CH3)，3.19(3H，s，6—OCH3)，3.28(3H，s，1—OCH3)，3.30(3H，s，18—OCH3)，3.76(3H，s，16—OCH3)，3.14(1H，C6—H)，4.89(1H，d，J=5.5 Hz，C14—H)，7.44～7.49(2H)，7.56～7.60(1H)，8.02～8.04(2H)(—C6H5)，2.86(4H，s，8-succinimidyl).13C-NMR(CDCl3)δ：174.2，173.6(4C 8-succinimidyl).
, 百拇医药
2.3 抗原性BSA结合物的制备
分别称取半抗原A和B适量(6.7 μmol)，溶解于吡啶中(0.2 mL)中，另称取BSA适量(0.23 μmol)，溶解于磷酸缓冲液(pH 7.3，3 mL)中，将上述两溶液混合，在4℃下搅拌24 h，反应液用10，5，2.5%吡啶-H2O及H2O透析一周，冷冻干燥，得半抗原性BSA结合物.
3 结果与讨论
参照北川 熊等人〔2〕的方法合成了乌头碱衍生物1(AH)和2(AS)，并初步尝试以N-羟基琥珀酰亚胺酯的方法合成乌头碱的半抗原A和B.这些化合物的合成是用于酶免疫测定法中，制备抗乌头碱抗血清必需的抗原性BSA结合物的一种“化学桥”(chemical bridge)化合物.采用2种方法制备了半抗原A和B.以方法1制备的半抗原A和B，回收率尚可，但稳定性较差；以方法2制备的半抗原A和B，收率可达60%～70%，并且稳定性较好.
, 百拇医药
实验中还发现，在合成衍生物时，作为催化剂的吡啶或三甲基吡啶的用量，对收率影响很大，量少影响反应，量多收率反而降低.经多次实验结果表明，三甲基吡啶与原料的克分子比30∶1为最佳.
羟基琥珀酰亚胺酯与BSA的交联反应是以克分子比1∶30进行的.制得的抗原性BSA结合物分别免疫注射给实验动物后，半抗原A-BSA结合物得到了高效价的抗血清，而半抗原B-BSA结合物形成的抗血清效价很低.可能原因是抗血清的效价与“化学桥”化合物的碳链长短有关.
尽管用于酶免疫测定中的“化学桥”化合物的合成方法有很多报道〔3，4〕，但作为乌头碱型衍生物的合成方法尚未见报道.羟基琥珀酰亚胺酯法可为乌头碱型化合物酶免疫测定法提供一个简单的制备方法.■
参考文献：
[1]服部征雄.ヒト肠内细菌による和汉药成分の代谢.ビフィズス，1991，5：27～40
, http://www.100md.com
[2]Kitagawa Isao,Chen Zhaolong,Yoshihala Minoru,et al.生药修治の化学解明(第二报)附子(Aconiti Tuber)その1：川乌头(Aconitum carmicheali Debx.干燥根の含有成分.药学杂，1984，104(8)：848～857
[3]井上谦一郎，八政彦，村松武治，等.イムノアッセイ法による植物成分の微量定量法に关する研究(第一报)アトロピンの4种のハフ°テンの合成とそれらのラジオイムノアッセイヘの应用.药学杂，1988，108(10)：951～963
[4]Hosoda Hiroshi,Sakai Yasuo,Yoshida Hiroko，et al.The preparation of steroid N-hydroxysuccinimide esters and their reactivities with bovine serum albumin.Chem Pharm Bull,1979,27(3):742～746
收稿日期：1999-04-05, http://www.100md.com
单位：赵怀清(沈阳药科大学基础部，沈阳 110015；); 服部征雄(日本富山医科药科大学和汉药研究所，930—01 日本富山)
关键词：乌头碱；半抗原；N-羟基琥珀酰亚胺酯；抗原性BSA结合物；合成
沈阳药科大学学报000108 摘 要：为建立乌头碱酶免疫测定法，合成了乌头碱衍生物，用羟基琥珀酰亚胺酯的方法制备半抗原(活性酯)，并用其半抗原与BSA(Bovine Serum Albumin)在有机溶媒/磷酸缓冲液(pH7.3)的条件下制备了抗原性BSA结合物.结果显示，这种活性酯的方法可用于乌头碱酶免疫测定法中与BSA或酶交联的有效方法.
分类号：R914.4
The Preparation of Aconitine N-Hydroxysuccinimide Esters and Their Reactivities with Bovine Serum Albumin
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Zhao Huaiqing,(Department of Basic Courses,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015;)
Hattori Masao
(Toyama Medical and Pharmaceutical University,Toyama,930～01,Japan)
Abstract：In order to establish the enzyme immunoassay of aconitine,aconitine derivatives were synthesized,which is called the chemical bridge.The preparation of the hapten of aconitine was carried out by the N-hydroxysuccinimide esters method.These activated esters were covalently linked to BSA(Bovine Serum Albunin)in an organic solvent/phosphate buffer(pH 7.3) employing 1∶30 molar ratio of the aconitine to protein.The results indicated that the activated ester method would be useful for enzyme labeling in enzyme immunoassay of aconitine in respect of simplicity and reproducibility.
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Key words：aconitine;hapten;N-hydroxysuccinimide ester;immunogenic conjugate；synthesis▲
乌头碱(aconitine)是附子(aconiti Tuber)中的主要成分，也是毒性很强的成分，但经肠内代谢之后可以转变为无毒的次乌头碱(lipoaconitine)〔1〕.为建立乌头碱酶免疫测定法，以测定其肠内代谢产物含量，合成了乌头碱的衍生物，并用羟基琥珀酰亚胺酯与BSA交联制备乌头碱的抗原性BSA结合物(immunogenic conjugate).
1 合成路线设计
乌头碱8位羟基的醋酸酯易与长链脂肪酸发生置换反应〔2〕，基于此，合成了2种衍生物.以乌头碱为原料，三甲基吡啶为催化剂，分别与十六碳二酸和琥珀酸反应，得到的衍生物1(AH)和衍生物2(AS)，在DCC(N，N′-Dicyclohexyl-carbodiimide)的存在下，与羟基琥珀酰亚胺缩合，得到了2种羟基琥珀酰亚胺酯(半抗原A(AHHS)和B(ASHS)，也称活性酯).得到的半抗原A和B，分别在pH 7.3的水溶液中与BSA反应，生成抗原性BSA结合物Ⅰ(AHHS-BSA)和Ⅱ(ASHS-BSA).见图1.
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Fig.1 Synthesis of the derivatives of aconitine and its immungenic conjugate
2 实验部分
熔点用Yanagimoto显微熔点测定仪测定，未校正；旋光度用JASCO DIP-360型旋光仪在20℃下测定；IR光谱用JASCO FT/IR-230红外分光光度计测定；核磁共振光谱用Varian Unitityplus 500及Gemini-300型核磁共振仪测定，CDCl3为溶媒，TMS为内标；AP-MS用Perkin-Elmer SCIEX APIⅢ型质谱仪测定.
2.1 衍生物的制备
2.1.1 衍生物1(AH)的制备
称取乌头碱(标准品)12.3 mg(0.019 mmol)，溶解于THF(0.5 mL)中，另取Hexadecanedionic Acid 93.1 mg(0.33 mmol)，加入三甲基吡啶(0.5 mL)，将两溶液混合，搅拌下于70℃回流5 h，减压除去溶媒，白色残渣经硅胶柱层析(CHCl3—MeOH=8∶2)精制，得到无色油状物1(14.2 mg，回收率85.5%).[α]20D+4.0(C=0.7，CHCl3).IRνKBrmaxcm-1：3482(OH)，1722()，1606，1582，1450(—C6H5).1H-NMR(CDCl3)δ：1.12(3H，t，J=7.0 N—CH2—CH3)，3.17(3H,s,6—OCH3)，3.28(3H,s，1—OCH3)，3.30(3H,s,18—OCH3)，3.77(3H，s，16—OCH3)，3.33(1H，d，J=6 Hz，C16—H)，4.87(1H,d，J=5.5 Hz，C14—H)，7.44～7.48(2H)，7.56～7.59(1H)，8.02～8.04(2H)(—C6H5)，2.35(2H，t，J=7.5 Hz，—COCH2—CH2—)，1.65(2H，t,J=7.5 Hz，—CH2—CH2—COOH).13C-NMR(CDCl3)δ：175.2(—COOH).API—MS m/z：(positive)872(M+H)+，(negative)870(M-H)+.
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2.1.2 衍生物2(AS)的合成
称取乌头碱29.6 mg(0.046mmol)，溶解于THF(1.5mL)中，另取琥珀酸123.5 mg(1.05 mmol)，加入三甲基吡啶(0.12mL)，70℃搅拌下回流20h，减压除去溶媒.残渣用硅胶柱(CHCl3—MeOH=7∶3)层析精制，得无色油状物2(21.8mg，收率为67.7%).[α]20D-0.5°(C=0.8，CHCl3).IRνKBrmaxcm-1：3450(OH)，1729()，1660，1582，1455(—C6H5).1H-NMR(CDCl3)δ：1.11(3H,t,J=7.0 Hz，N—CH2—H3)，3.17(3H，s，6—OCH3)，3.28(3H，s，1—OCH3)，3.30(3H，s，18—OCH3)，3.77(3H，s，16—OCH3)，3.34(1H，d，J=5.5 Hz，C16—H)，4.87(1H，d，J=5.5 Hz，C14—H)，7.44～7.47(2H)，7.56～7.59(1H)，8.02～8.04(2H)(—C6H5)，2.61(2H，t，J=7.5 Hz)，—CO—CH3—CH2—)，1.75(2H，t，J=7.5 Hz，—CH2—CH2—COOH).13C-NMR(CDCl3)δ：175.3(—COOH)，API—MS m/z(positive)704(M+H)+，(negative)702(M-H)+.
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2.2 半抗原的制备
2.2.1 半抗原A的制备
方法1 取衍生物HA 23.5 mg(0.027 mmol)，溶解于CH2Cl2(3 mL)中，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺5.2 mg(0.05 mmol)和DCC 9.8 mg(0.05 mmol)，在室温下搅拌24 h，过滤，去除沉淀，减压除去滤液中的溶媒，残渣用硅胶柱(CHCl3—MeOH=19∶1)层析精制，得无色油状的羟基琥珀酰亚胺酯即半抗原A(17.2 mg，收率为65.9%).[α]20D+2.4(C=1.7，CHCl3).IRνKBrmaxcm-1：3450(—OH)，1780，1720()，1600，1582，1455(—C6H5).1H-NMR(CDCl3)δ：1.22(3H,t,J=7.0 Hz，N—CH2—CH3)，3.22(3H，s，6—OCH3)，3.28(3H，s，1—OCH3)，3.29(3H，s，18—OCH3)，3.76(3H，s，16—OCH3)，3.34(1H，d，J=5.5 Hz，C6—H)，4.91(1H，d，J=5.5 Hz)，7.44～7.48(2H)，7.56～7.59(1H)，8.02～8.04(2H)(—C6H5)，2.85(4H，s，8—succinimidyl).13C-NMR(CDCl3)δ：173.2(4C,8—succinimidyl).
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方法2 称取衍生物HA 24.7 mg(0.028 mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺3.91 mg(0.034 mmol)，溶解于二氧六环(2 ml)中，在0℃搅拌下加入EDC[1-Ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodimide HCl]6.52 mg(0.034 mmol)，然后，室温下搅拌24 h.反应液用醋酸乙酯稀释后，再用水洗，无水硫酸钠干燥，减压除去溶媒，残渣用硅胶柱(CHCl3-MeOH=19∶1)层析精制，得到无色油状的羟基琥珀酰亚胺酯即半抗原A(20.1 mg，收率为73.3%).
2.2.2 半抗原B的制备
称取衍生物SA 83.3 mg(0.12 mmol)，溶解于CH2Cl2(3 mL)中，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺21.5 mg(0.19 mmol)，DCC 31.7 mg(0.19 mmol)，室温下搅拌24 h，过滤，减压除去溶媒，残渣用硅胶柱(CHCl3-MeOH=19∶1)层析精制，得到无色油状的羟基琥珀酰亚胺酯即半抗原B(61.5 mg，收率为64.9%).[α]20D-1.4°(C=1.7，CHCl3).IRνKBrmax cm-1：3480(OH)，1780，1720()，1600，1582，1455(—C6H5).1H-NMR(CDCl3)δ：1.14(3H,t,J=7.0 Hz，N—CH2—CH3)，3.19(3H，s，6—OCH3)，3.28(3H，s，1—OCH3)，3.30(3H，s，18—OCH3)，3.76(3H，s，16—OCH3)，3.14(1H，C6—H)，4.89(1H，d，J=5.5 Hz，C14—H)，7.44～7.49(2H)，7.56～7.60(1H)，8.02～8.04(2H)(—C6H5)，2.86(4H，s，8-succinimidyl).13C-NMR(CDCl3)δ：174.2，173.6(4C 8-succinimidyl).
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2.3 抗原性BSA结合物的制备
分别称取半抗原A和B适量(6.7 μmol)，溶解于吡啶中(0.2 mL)中，另称取BSA适量(0.23 μmol)，溶解于磷酸缓冲液(pH 7.3，3 mL)中，将上述两溶液混合，在4℃下搅拌24 h，反应液用10，5，2.5%吡啶-H2O及H2O透析一周，冷冻干燥，得半抗原性BSA结合物.
3 结果与讨论
参照北川 熊等人〔2〕的方法合成了乌头碱衍生物1(AH)和2(AS)，并初步尝试以N-羟基琥珀酰亚胺酯的方法合成乌头碱的半抗原A和B.这些化合物的合成是用于酶免疫测定法中，制备抗乌头碱抗血清必需的抗原性BSA结合物的一种“化学桥”(chemical bridge)化合物.采用2种方法制备了半抗原A和B.以方法1制备的半抗原A和B，回收率尚可，但稳定性较差；以方法2制备的半抗原A和B，收率可达60%～70%，并且稳定性较好.
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实验中还发现，在合成衍生物时，作为催化剂的吡啶或三甲基吡啶的用量，对收率影响很大，量少影响反应，量多收率反而降低.经多次实验结果表明，三甲基吡啶与原料的克分子比30∶1为最佳.
羟基琥珀酰亚胺酯与BSA的交联反应是以克分子比1∶30进行的.制得的抗原性BSA结合物分别免疫注射给实验动物后，半抗原A-BSA结合物得到了高效价的抗血清，而半抗原B-BSA结合物形成的抗血清效价很低.可能原因是抗血清的效价与“化学桥”化合物的碳链长短有关.
尽管用于酶免疫测定中的“化学桥”化合物的合成方法有很多报道〔3，4〕，但作为乌头碱型衍生物的合成方法尚未见报道.羟基琥珀酰亚胺酯法可为乌头碱型化合物酶免疫测定法提供一个简单的制备方法.■
参考文献：
[1]服部征雄.ヒト肠内细菌による和汉药成分の代谢.ビフィズス，1991，5：27～40
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[2]Kitagawa Isao,Chen Zhaolong,Yoshihala Minoru,et al.生药修治の化学解明(第二报)附子(Aconiti Tuber)その1：川乌头(Aconitum carmicheali Debx.干燥根の含有成分.药学杂，1984，104(8)：848～857
[3]井上谦一郎，八政彦，村松武治，等.イムノアッセイ法による植物成分の微量定量法に关する研究(第一报)アトロピンの4种のハフ°テンの合成とそれらのラジオイムノアッセイヘの应用.药学杂，1988，108(10)：951～963
[4]Hosoda Hiroshi,Sakai Yasuo,Yoshida Hiroko，et al.The preparation of steroid N-hydroxysuccinimide esters and their reactivities with bovine serum albumin.Chem Pharm Bull,1979,27(3):742～746
收稿日期：1999-04-05, http://www.100md.com