前列腺素E2对跨膜型和分泌型肿瘤坏死因子胞毒作用的影响
作者：石文芳 李卓娅 李清芬 龚非力 徐勇 熊平
单位：同济医科大学基础医学院免疫学教研室， 武汉 430030
关键词：肿瘤坏死因子；跨膜型；分泌型；胞毒效应；前列腺素E类
同济医科大学学报000105 摘要 研究比较前列腺素E2(PGE2)对两型肿瘤坏死因子(TNF-α)胞毒效应。结果：跨膜型TNFα(TM-TNFα)和分泌型TNFα(S-TNFα)在杀伤靶细胞的同时，可引起靶细胞释放大量PGE2(P<0.01)。用环氧化酶抑制剂消炎痛可部分或大部分阻断TM-TNF α诱导靶细胞产生的PGE2(P<0.01)，并且也可抑制TM-TNFα的胞毒效应(P<0.01 )，其抑制程度与PGE2阻断程度一致。但消炎痛却不能阻断S-TNFα诱导其敏感靶细胞产生 PGE2，也不能抑制S-TNFα对其敏感靶细胞的杀伤作用。结果提示，PGE2可能参与二型T NFα胞毒效应的信号传导，但是二型TNFα引起靶细胞PGE2水平升高的作用环节可能存在差异 。
, 百拇医药
中图法分类号 R730.3， R329.2， R977.6
The Effect of PGE2 on the Cytotoxicity of Transmembrane and SecretoryTNFα
Shi Wenfang Li Zhuoya Li Qingfen et al
(Department of Immunology, School of Basic Medical Scie nces,Tongji Medical University, Wuhan430030)
Abstract It has been shown in the present study that transmembrane tumor necrosis factor (TM- TNFα)and secretory TNFα(S-TNFα) could induc e a large amounts of PGE2release from target cell lines (P<0.01),as they were exerting their cytotoxic activity. I ndomethacin, an inhibitor ofcyclooxygenase (COX),was able not only to block par tially or most TM-TNFα induced PGE2 synthesis in the targetcells (P<0.0 1), but also to inhibit its cytocidal effect. The trend of inhibitory effect on the PGE2 release induced byTM-TNFα was consistent with that on the cytotoxi city of TM-TNFα. In contrast to TM-TNFα, these effects ofS-TNFα remained unchanged, whether indomethacin was present or not. These results suggested that PGE2 may beinvolved in the signal transduction pathway of both forms of TNF -α to cause target cell death, but the action levels of bothin enhancing PGE 2 synthesis may be different.
, 百拇医药
Key words tumor necrosisfactor； transmembrane； secr etory； cytotoxicity； prostaglandins E
跨膜型TNFα(transmembrane tumor necrosis factor-α ,TM-TNFα)是分泌型TNFα(S-TNFα)的前体，二者均有生物学效应。近来我们证实TM-TNFα可有效杀伤对S-TNFα耐受的肿瘤细胞，而且二型TNF引起同一种靶细胞的死亡方式也不同[1]。提示二型TNF的受体后信号传导有差异。本研究旨在比较前列腺素E2(PGE2)对二型TNF胞毒效应的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,E.coli 0127:B8,Difco,美国);TNF- α单克隆抗体(邦定公司); 消炎痛。
, http://www.100md.com
1.2 细胞培养
用以下细胞系作为靶细胞:HepG2(人肝母细胞瘤)、MCF-7(人乳腺癌)、HL-60(人急性前髓细胞性白血病)、K562(红白血病)、Raji(B淋巴细胞性白血病)、L929(鼠成纤维母细胞)。全部细胞均用含150 ml/L FCS的RPMI 1640完整培养基 培养。
1.3 TNF-α的诱生及二型TNF-α的获得
取健康成人静脉血,用常规方法分离单核细胞。105单核细胞与LPS(100 ng/ml)共培养16h,取上清(含sTNF-α)待用;而细胞则用0.3 mol/L甘氨酸、 0.15 mol/L NaCl(pH3.0)室温下作用20min,以去除结合在单核细胞膜TNFR上的 sTNF-α，再用10 g/L多聚甲醛室温下固定15min,用PBS洗3次细胞后,继续在 培养液中培养12 h,以去除残留的sTNF-α,从而获得mTNF-α。
, http://www.100md.com
1.4 TNF-α生物活性检测
将104靶细胞加入96孔培养板,再加入稀释培养上清,以检测sTNF-α;测定mTNF-α,则按效∶靶比例10∶1,向固定效应细胞加入靶细胞,总反应体积为100 μl /孔,37 ℃培养48h后,每孔加入25 μl 的5 g/L MTT,继续培养4 h,弃上清,向孔 内加入100 μl裂解液(500 ml/L二甲基甲酰胺,200 g/LSDS),37 ℃摇荡16 h后,在 波长570 nm下测吸光度(A)。按以下公式计算TNF-α的胞毒效应(即细胞死亡百分率):
用抗TNF-α的单克隆抗体(1∶50)可完全拮抗二型TNF-α的胞毒效应,从而证实TNF-α生物活性检测的特异性。
1.5 PGE2的测定
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用放射免疫方法测定。PGE2试剂盒购自邦定公司，按试剂盒说明书操作。1.6 统计学处理
结果数值以5～6次实验结果的均值表示,差异显著性检测用t检验。
2 结果
2.1 PGE2对S-TNFα胞毒作用的影响
图1显示S-TNFα仅对L929和MCF-7有明显的胞毒作用(P<0.01)，而对其它4种细胞株则无杀伤效应。同时测定靶细胞释放PGE2水平(图2)，发现S-TNFα仅能引起其敏感靶细胞(L929和MCF-7)的PGE2产生增加(P<0.01)，对其耐受细胞株则无影响。值得注意的是，用环氧化酶抑制剂消炎痛企图阻断PGE2的产生，以观察对S-TNFα胞毒效应的影响。结果消炎痛既未阻断S-TNFα诱导其敏感靶细胞的PGE2释放(图2)，也未影响S-TNFα对它们的杀伤作用(图1)。
, 百拇医药
图1 PGE2对S-TNFα细胞毒作用的影响
图2 S-TNFα或消炎痛作用靶细胞产生的PGE2水平
2.2 PGE2对TM-TNFα胞毒作用的影响
图3显示TM-TNFα对实验所用的6株靶细胞均有明显的胞毒作用(P<0.01)，同时也能诱导这6株靶细胞释放大量的PGE2(P<0.01，图4)。用消炎痛既可使TM-TNFα作用靶细胞产生PGE2的水平显著下降(P<0.01)，也可明显抑制TM-TNFα对靶细胞的杀伤作用(P<0.01)。虽然消炎痛对TM-TNFα诱导的PGE2产生的抑制程度，随作用的靶细胞不同而不同，如对Raji抑制了几乎4/5的PGE2，而对MCF-7则仅抑制了约1/3。但是，消炎痛对TM-TNFα诱导不同靶细胞产生PGE2的抑制程度与其对TM-TNFα杀伤不同靶细胞的抑制程度呈一 致的趋势(图3，4)。
, 百拇医药
图3 PGE2对TM-TNFα细胞毒作用的影响
与对照比较P<0.01； △ 与TM-TNFα比较P<0.01
图4 TM-TNFα或消炎痛作用靶细胞产生PGE2的水平
与对照比较P<0.01； △ 与TM-TNFα比较P<0.01
3 讨论
我们的实验证实TM-TNFα比S-TNFα有更广的杀瘤谱，即TM-TNFα可以有效杀伤S-TNFα耐受靶细胞(图1，3)，其原因可能与它们作用受体的特征[2]及受体后信号传导通路有关。关于S-TNFα胞毒信号传导通路已有大量研究和报道，认为可能涉及的途径包括磷脂酶A2/花生四烯酸代谢产物，磷脂酶D、C/DAG、PKC，鞘磷脂酶/神经酰胺等。但是，对于TM-TNFα胞毒作用的信号通路则了解 甚少。
, http://www.100md.com
本研究首次证实PGE2不但参与S-TNFα胞毒效应，而且也与TM-TNFα的杀伤作用有关。其实验证据是：(1)二型TNFα在发挥胞毒效应时，均可引起靶细胞释放大量PGE2(图2，4)；(2)S-TNFα不能杀伤其余4株耐受细胞，也不能引起这4株耐受细胞产生PGE2(图2)；(3)用环氧化酶抑制剂消炎痛能阻断TM-TNFα诱导PGE2的产生，就可以使之胞毒效应减弱，且其抑制程度与PGE2阻断的程度一致。消炎痛不能阻断S-TNFα诱导的PGE2的产生，也对其胞毒效应毫无影响。MacEwan[3]报道PLA2的激活可使花生四烯酸增多，继而导致PGE2水平上升，引起细胞凋亡增加。Bonta[4]和Ben-Efraim[5]等发现PGE2与S-TNF α的胞毒效应密切相关。上述报道与我们的实验结果相似。
, http://www.100md.com
二型TNFα虽然发挥胞毒效应时都可引起靶细胞PGE2释放增加，但是环氧化酶抑制剂消炎痛却仅能阻断TM-TNFα诱导的PGE2产生及其胞毒效应，而不能影响S-TNFα的作用。提示二型TNFα促使靶细胞产生PGE2的机制可能不同。文献报道[6]S-TNFα可诱导环氧化酶2(COX2)表达，并使该酶活性增强，导致PGE2产生增加。虽然消炎痛对COX1和COX2都有抑制作用，但对COX1作用更大。因此，这可能是它不能有效阻断S-TNFα诱导PGE2产生的原因。值得注意的是与S-TNFα不同，TM-TNFα诱导的PGE2及其胞毒作用均可被消炎痛有效抑制。提示(1)TM-TNFα对COX型别选择偏重性可能不同于S-TNFα；(2)或二型TNFα诱导PGE2合成的作用环节不同。关于二型TNFα胞毒效应时引起PGE2释放增加的不同机制还有待进一步研究。
, 百拇医药
综上所述，我们的实验首次证实PGE2不但参与S-TNFα胞毒效应的信号传导，也与TM-TNFα杀伤作用有关。但是，二型TNFα引起PGE2增加的机制或作用环节可能不同，因为TM-TNFα诱导的PGE2可以被消炎痛阻断；而S-TNFα诱导的PGE2则不能。
国家自然科学基金资助项目(No.39570796)
石文芳，女，1972年生，博士
参 考 文 献
1，石文芳，李卓娅，龚非力等. 跨膜型与分泌型TNF-α细胞毒效应的比较. 中华微生物学和免疫学杂志, 1998, 18(6): 9
2，石文芳，李卓娅，龚非力.跨膜型和分泌型TNF-α对TNF受体作用的比较. 中国免疫学杂志, 1998, 14(4): 243
, http://www.100md.com
3 MacEwan D J. Elevated cPLA2 level as a mechanism by which the p70 an d p75 NGF receptors enhanceapoptosis. FEBS Lett, 1996, 379: 77
4，Bonta I L, Ben-Efraim S. Involvement of inflammatorymediators in m acrophage antitumor activity. J Leukoc Biol, 1993, 54:613
5，Ben-Efraim S, TakC, Fieren M J. Activity of human peritoneal macro phages against a human tumor: role of tumor necrosis factor-alpha,PGE2 and n itrite, in vitro studies. Immunol Lett, 1993, 37:27
6，Fournier T, Fadok V, Henson PM. Tumor necrosis factor-alpha invers ely regulates prostaglandin D2 and prostaglandin E2 production in murine macroph ages. Synergistic action of cyclic AMP on cyclooxygenase-2 expression and prost aglandin E2 synthesis. J Biol Chem,1997, 272: 31 065
(1999-04-28 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院免疫学教研室， 武汉 430030
关键词：肿瘤坏死因子；跨膜型；分泌型；胞毒效应；前列腺素E类
同济医科大学学报000105 摘要 研究比较前列腺素E2(PGE2)对两型肿瘤坏死因子(TNF-α)胞毒效应。结果：跨膜型TNFα(TM-TNFα)和分泌型TNFα(S-TNFα)在杀伤靶细胞的同时，可引起靶细胞释放大量PGE2(P<0.01)。用环氧化酶抑制剂消炎痛可部分或大部分阻断TM-TNF α诱导靶细胞产生的PGE2(P<0.01)，并且也可抑制TM-TNFα的胞毒效应(P<0.01 )，其抑制程度与PGE2阻断程度一致。但消炎痛却不能阻断S-TNFα诱导其敏感靶细胞产生 PGE2，也不能抑制S-TNFα对其敏感靶细胞的杀伤作用。结果提示，PGE2可能参与二型T NFα胞毒效应的信号传导，但是二型TNFα引起靶细胞PGE2水平升高的作用环节可能存在差异 。
, 百拇医药
中图法分类号 R730.3， R329.2， R977.6
The Effect of PGE2 on the Cytotoxicity of Transmembrane and SecretoryTNFα
Shi Wenfang Li Zhuoya Li Qingfen et al
(Department of Immunology, School of Basic Medical Scie nces,Tongji Medical University, Wuhan430030)
Abstract It has been shown in the present study that transmembrane tumor necrosis factor (TM- TNFα)and secretory TNFα(S-TNFα) could induc e a large amounts of PGE2release from target cell lines (P<0.01),as they were exerting their cytotoxic activity. I ndomethacin, an inhibitor ofcyclooxygenase (COX),was able not only to block par tially or most TM-TNFα induced PGE2 synthesis in the targetcells (P<0.0 1), but also to inhibit its cytocidal effect. The trend of inhibitory effect on the PGE2 release induced byTM-TNFα was consistent with that on the cytotoxi city of TM-TNFα. In contrast to TM-TNFα, these effects ofS-TNFα remained unchanged, whether indomethacin was present or not. These results suggested that PGE2 may beinvolved in the signal transduction pathway of both forms of TNF -α to cause target cell death, but the action levels of bothin enhancing PGE 2 synthesis may be different.
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Key words tumor necrosisfactor； transmembrane； secr etory； cytotoxicity； prostaglandins E
跨膜型TNFα(transmembrane tumor necrosis factor-α ,TM-TNFα)是分泌型TNFα(S-TNFα)的前体，二者均有生物学效应。近来我们证实TM-TNFα可有效杀伤对S-TNFα耐受的肿瘤细胞，而且二型TNF引起同一种靶细胞的死亡方式也不同[1]。提示二型TNF的受体后信号传导有差异。本研究旨在比较前列腺素E2(PGE2)对二型TNF胞毒效应的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,E.coli 0127:B8,Difco,美国);TNF- α单克隆抗体(邦定公司); 消炎痛。
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1.2 细胞培养
用以下细胞系作为靶细胞:HepG2(人肝母细胞瘤)、MCF-7(人乳腺癌)、HL-60(人急性前髓细胞性白血病)、K562(红白血病)、Raji(B淋巴细胞性白血病)、L929(鼠成纤维母细胞)。全部细胞均用含150 ml/L FCS的RPMI 1640完整培养基 培养。
1.3 TNF-α的诱生及二型TNF-α的获得
取健康成人静脉血,用常规方法分离单核细胞。105单核细胞与LPS(100 ng/ml)共培养16h,取上清(含sTNF-α)待用;而细胞则用0.3 mol/L甘氨酸、 0.15 mol/L NaCl(pH3.0)室温下作用20min,以去除结合在单核细胞膜TNFR上的 sTNF-α，再用10 g/L多聚甲醛室温下固定15min,用PBS洗3次细胞后,继续在 培养液中培养12 h,以去除残留的sTNF-α,从而获得mTNF-α。
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1.4 TNF-α生物活性检测
将104靶细胞加入96孔培养板,再加入稀释培养上清,以检测sTNF-α;测定mTNF-α,则按效∶靶比例10∶1,向固定效应细胞加入靶细胞,总反应体积为100 μl /孔,37 ℃培养48h后,每孔加入25 μl 的5 g/L MTT,继续培养4 h,弃上清,向孔 内加入100 μl裂解液(500 ml/L二甲基甲酰胺,200 g/LSDS),37 ℃摇荡16 h后,在 波长570 nm下测吸光度(A)。按以下公式计算TNF-α的胞毒效应(即细胞死亡百分率):
用抗TNF-α的单克隆抗体(1∶50)可完全拮抗二型TNF-α的胞毒效应,从而证实TNF-α生物活性检测的特异性。
1.5 PGE2的测定
, http://www.100md.com
用放射免疫方法测定。PGE2试剂盒购自邦定公司，按试剂盒说明书操作。1.6 统计学处理
结果数值以5～6次实验结果的均值表示,差异显著性检测用t检验。
2 结果
2.1 PGE2对S-TNFα胞毒作用的影响
图1显示S-TNFα仅对L929和MCF-7有明显的胞毒作用(P<0.01)，而对其它4种细胞株则无杀伤效应。同时测定靶细胞释放PGE2水平(图2)，发现S-TNFα仅能引起其敏感靶细胞(L929和MCF-7)的PGE2产生增加(P<0.01)，对其耐受细胞株则无影响。值得注意的是，用环氧化酶抑制剂消炎痛企图阻断PGE2的产生，以观察对S-TNFα胞毒效应的影响。结果消炎痛既未阻断S-TNFα诱导其敏感靶细胞的PGE2释放(图2)，也未影响S-TNFα对它们的杀伤作用(图1)。
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图1 PGE2对S-TNFα细胞毒作用的影响
图2 S-TNFα或消炎痛作用靶细胞产生的PGE2水平
2.2 PGE2对TM-TNFα胞毒作用的影响
图3显示TM-TNFα对实验所用的6株靶细胞均有明显的胞毒作用(P<0.01)，同时也能诱导这6株靶细胞释放大量的PGE2(P<0.01，图4)。用消炎痛既可使TM-TNFα作用靶细胞产生PGE2的水平显著下降(P<0.01)，也可明显抑制TM-TNFα对靶细胞的杀伤作用(P<0.01)。虽然消炎痛对TM-TNFα诱导的PGE2产生的抑制程度，随作用的靶细胞不同而不同，如对Raji抑制了几乎4/5的PGE2，而对MCF-7则仅抑制了约1/3。但是，消炎痛对TM-TNFα诱导不同靶细胞产生PGE2的抑制程度与其对TM-TNFα杀伤不同靶细胞的抑制程度呈一 致的趋势(图3，4)。
, 百拇医药
图3 PGE2对TM-TNFα细胞毒作用的影响
与对照比较P<0.01； △ 与TM-TNFα比较P<0.01
图4 TM-TNFα或消炎痛作用靶细胞产生PGE2的水平
与对照比较P<0.01； △ 与TM-TNFα比较P<0.01
3 讨论
我们的实验证实TM-TNFα比S-TNFα有更广的杀瘤谱，即TM-TNFα可以有效杀伤S-TNFα耐受靶细胞(图1，3)，其原因可能与它们作用受体的特征[2]及受体后信号传导通路有关。关于S-TNFα胞毒信号传导通路已有大量研究和报道，认为可能涉及的途径包括磷脂酶A2/花生四烯酸代谢产物，磷脂酶D、C/DAG、PKC，鞘磷脂酶/神经酰胺等。但是，对于TM-TNFα胞毒作用的信号通路则了解 甚少。
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本研究首次证实PGE2不但参与S-TNFα胞毒效应，而且也与TM-TNFα的杀伤作用有关。其实验证据是：(1)二型TNFα在发挥胞毒效应时，均可引起靶细胞释放大量PGE2(图2，4)；(2)S-TNFα不能杀伤其余4株耐受细胞，也不能引起这4株耐受细胞产生PGE2(图2)；(3)用环氧化酶抑制剂消炎痛能阻断TM-TNFα诱导PGE2的产生，就可以使之胞毒效应减弱，且其抑制程度与PGE2阻断的程度一致。消炎痛不能阻断S-TNFα诱导的PGE2的产生，也对其胞毒效应毫无影响。MacEwan[3]报道PLA2的激活可使花生四烯酸增多，继而导致PGE2水平上升，引起细胞凋亡增加。Bonta[4]和Ben-Efraim[5]等发现PGE2与S-TNF α的胞毒效应密切相关。上述报道与我们的实验结果相似。
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二型TNFα虽然发挥胞毒效应时都可引起靶细胞PGE2释放增加，但是环氧化酶抑制剂消炎痛却仅能阻断TM-TNFα诱导的PGE2产生及其胞毒效应，而不能影响S-TNFα的作用。提示二型TNFα促使靶细胞产生PGE2的机制可能不同。文献报道[6]S-TNFα可诱导环氧化酶2(COX2)表达，并使该酶活性增强，导致PGE2产生增加。虽然消炎痛对COX1和COX2都有抑制作用，但对COX1作用更大。因此，这可能是它不能有效阻断S-TNFα诱导PGE2产生的原因。值得注意的是与S-TNFα不同，TM-TNFα诱导的PGE2及其胞毒作用均可被消炎痛有效抑制。提示(1)TM-TNFα对COX型别选择偏重性可能不同于S-TNFα；(2)或二型TNFα诱导PGE2合成的作用环节不同。关于二型TNFα胞毒效应时引起PGE2释放增加的不同机制还有待进一步研究。
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综上所述，我们的实验首次证实PGE2不但参与S-TNFα胞毒效应的信号传导，也与TM-TNFα杀伤作用有关。但是，二型TNFα引起PGE2增加的机制或作用环节可能不同，因为TM-TNFα诱导的PGE2可以被消炎痛阻断；而S-TNFα诱导的PGE2则不能。
国家自然科学基金资助项目(No.39570796)
石文芳，女，1972年生，博士
参 考 文 献
1，石文芳，李卓娅，龚非力等. 跨膜型与分泌型TNF-α细胞毒效应的比较. 中华微生物学和免疫学杂志, 1998, 18(6): 9
2，石文芳，李卓娅，龚非力.跨膜型和分泌型TNF-α对TNF受体作用的比较. 中国免疫学杂志, 1998, 14(4): 243
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3 MacEwan D J. Elevated cPLA2 level as a mechanism by which the p70 an d p75 NGF receptors enhanceapoptosis. FEBS Lett, 1996, 379: 77
4，Bonta I L, Ben-Efraim S. Involvement of inflammatorymediators in m acrophage antitumor activity. J Leukoc Biol, 1993, 54:613
5，Ben-Efraim S, TakC, Fieren M J. Activity of human peritoneal macro phages against a human tumor: role of tumor necrosis factor-alpha,PGE2 and n itrite, in vitro studies. Immunol Lett, 1993, 37:27
6，Fournier T, Fadok V, Henson PM. Tumor necrosis factor-alpha invers ely regulates prostaglandin D2 and prostaglandin E2 production in murine macroph ages. Synergistic action of cyclic AMP on cyclooxygenase-2 expression and prost aglandin E2 synthesis. J Biol Chem,1997, 272: 31 065
(1999-04-28 收稿), 百拇医药