TrK C在成年猫脊髓和背根节的分布
作者：顾玲 高玉陪 唐太昆 李斌 陈彦红 王廷华
单位：顾玲(昆明市延安医院神经科，昆明 650051)；高玉陪(昆明市延安医院神经科，昆明 650051)；唐太昆(昆明市延安医院神经科，昆明 650051)； 李斌(昆明市延安医院神经科，昆明 650051)； 陈彦红(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：猫脊髓；背根节；免疫组化；分布
昆明医学院学学报000108 摘 要：采用免疫组织化学方法探讨trKC在成年猫脊髓L3，L5节段和L6背根节的分布. 结果：trKC的免疫阳性反应物(trKC-IR)主要分布于脊髓腹角、中间带、背角深部以及背根节(DRG)的大神经元胞浆内. 此外，脊髓Ⅱ板层还可见均质状的trKC-IR，染色明显深于其它各层；而DRG的少数中、小神经元亦呈trKC阳性反应. 提示，trKC可能与成年猫脊髓和DRG某些神经元的生理功能有关.
, 百拇医药
分类号：Q 426；R 651.2 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0034-03
The Immunohistochemical Study for the Distribution of TrK C in Spinal Cord and Dorsal Root Ganglion of Adult Cats
GU Ling GAO Yu-pei TANG Tai-kun LI Bin
( Dept. of Neuroscience，Yanan Hospital,Kunming 650032)
CHEN Yan-hong WANG Ting-hua
, 百拇医药
(Institute for Research on Neuroscience,Kunming Medical College ， Kunming 650031)
Abstract：TrKC was designated as the functional receptor of neurotrophin-3. In this study，we investigated the distribution of trKC-like immunoreactivity (trKC-IR) in spinal cord and dorsal root ganglion of adult cats using specific antiserum for trKC by immmunohistochemistry ABC method. The results were as following: In spinal cord，trKC-IR was mainly distributed in neurons including ventrolateral horn，intermedius zone，and the deep of dorsal horn. The subcellular localization of positive product was mainly in cytoplasm. In addition，homogenous trKC-IR was also found in lamina II. In dorsal root ganglion (DRG)，trKC-IR was mainly distributed in large neurons and a few small to medium sized neurons. Our results give morphological evidence on the distribution of trKC in DRG and spinal cord of adult cats. It indicated that the role of trKC involves in physiological function of DRG and spinal cord of adult cat.
, 百拇医药
Key words：Spinal cord of cat; Dorsal root ganglion; Immunohistochemistry; Distribution▲
TrKC是trK受体家族的重要成员，1991年由Lamballe等克隆并鉴定为NT-3的功能受体. 之后，诸多证据提供了trKC 及其mRNA在成年大鼠周围和中枢神经系统分布的资料[1～3]. 提示其与正常成年大鼠周围和中枢神经系统的某些生理功能有关. 由于至今未见trKC在成年猫脊髓和背根节分布的报道，本文用免疫组织化学方法探讨trKC在成年猫脊髓和背根节(dorsal root ganglion，DRG)的表达以了解其与脊髓和DRG的关系.
1 材料方法
1.1 标本获取
成年雄猫(体重3～3.5 kg)5只，用3.5%戊巴比妥钠(1.3 mL/kg)腹腔注射麻醉. 4%多聚甲醛心内灌注固定2 h，取L6 DRG，L3节段脊髓后固定6 h，入20%蔗糖PBS下沉过夜. 制作20 μm厚的冰冻切片. 间断取片备用.
, 百拇医药
1. 2 免疫组织化学染色
用trKC抗血清(滴度为1：1 000，Santa Cruz)对切片行ABC免疫组织化学染色，DAB棕色反应呈色. 裱片，脱水，树胶封片.
1.3 结果观察及阴性对照实验
在Olympus 显微镜下，观察trKC样免疫阳性产物(trKC-IR)在DRG和脊髓的分布. 用PBS代替trKC抗血清作阴性对照.
2 结果
2.1 脊髓
trKC的免疫阳性反应物(trKC immunoreactivity，trKC-IR)主要定位于灰质腹角、中间带(包括背核)及后角深部的神经元，胞浆染色(图1). 后角浅层trKC-IR阳性细胞少见. 但Ⅱ板层呈均质状trKC-IR阳性染色，明显深于其它各层(图1)
, 百拇医药
图1 脊髓trKC免疫组化染色
a：腹角阳性神经元(200×)；b：背角II板层阳性染色(↑，40×)
2.2 背根节
trKC-IR主要定位于DRG胞体偏大的神经元(>57 μm)，但少数中小细胞(13～57 μm)亦见trKC-IR阳性反应. 阳性反应定位于细胞浆(图2).
图2 背根节trKC阳性神经元(↑大细胞)200×
3 讨论
3.1 trKC在脊髓
腹角：本文在脊髓腹角神经元观察到trKC的免疫阳性反应物，表明trKC主要分布于脊髓腹角神经元. 而这可能为NT3提供了必要的结合位点. 由于有研究已发现脊髓运动神经元和其靶组织均表达NT-3mRNA[4～6]. 因而，脊髓运动神经元表达trKC提示前角运动神经元不仅可摄取NT3，而且NT3在脊髓前角运动细胞可能存在自分泌作用方式. 此外，最近的研究还证实脊髓运动神经元还表达trKC mRNA[3]，提示脊髓运动神经元有可能合成trKC. 本文在腹角运动神经元观察到的trKC的免疫阳性反应物为此提供了进一步的免疫组织化学证据.
, http://www.100md.com
背角神经元与脊髓II板层：除腹角神经元表达trKC外，后角深部神经元亦呈trKC-IR阳性反应. 另外，后角Ⅱ板层亦见均质状的trKC-IR. 表明该两部位亦有trKC分布. 进而提示，trKC可能与这些部位的NT-3发挥作用有关. 由于至今未见脊髓后角有trKC mRNA的报道. 因此，背角内trKC的来源尚待探讨. 基于文献报道背根节大、小细胞分别发出粗有髓和无髓纤维到达脊髓后角深部(包括中间带)及后角浅部，结合背根节细胞表达trKC mRNA，推测脊髓后角的trKC可能与DRG有关. 事实上，一种蛋白质在DRG细胞内合成，然后经中枢突末端并释放入脊髓是完全可能的. 研究表明，BDNF和P物质等均可在背根节合成并经中枢支转运并进入脊髓后角[7]. 此外，其它研究还报道神经生长因子受体trKA亦可在坐骨神经发生逆行运输[8]. 综合之，受体在神经突起转运并不是不可能的.
3.2 trKC在DRG
本文观察到背根节的大细胞及少数中小细胞均有trKC-IR，提示，DRG的大神经元和少数中、小神经元均含有trKC. 由于至今大多数文献报道NT3主要对DRG的大神经元有营养作用，而本文发现NT3的功能受体trKC主要定位于DRG大神经元的结果亦支持上述已知的结论. 即NT3通过与其受体结合而对大神经元发挥作用. 然而，与已知文献报道有所不同的是，本文在少数中小神经元亦观察到trKC-IR. 提示成年猫DRG少数中小神经元亦表达trKC. 该结果提示NT3在DRG的作用可能不仅仅局限于大神经元，但详情尚有待于进一步深入研究.
, 百拇医药
本文的结果为trKC在成年猫脊髓和背根节的分布提供了重要的免疫组织化学证据.trKC在成年猫脊髓和背根节的存在为NT3与之结合发挥相应功能提供了可能的结合位点.今后进一步探讨NT3在成年猫脊髓和DRG中的生理作用将是一项有趣的工作.■
基金项目：云南省自然科学基金资助课题(99C0006R)
作者简介：顾玲，(1966～)，女，昆明人.主治医师. 研究方向：神经损伤修复.
参考文献：
[1] MARTIN Z D，BARBACID M. Expression of the trK proto-oncogen is restricted to the sensory cranial and spinal ganglion of neural crest original in mouse development[J]. Genes,1990，4:683
, 百拇医药
[2] MERLIO J P，ERNFORS P. Molecular cloning of rat trKC and distribution of cells expression messenger RNAs for members of the trK family in the rat central nervous system[J]. Neurosci,1992，51(3:513
[3] FUNAKOSHI H，FRISEN J. Diffrential expression of mRNAs for neurotrophins and their receptors after axotomy of the sciatic nerve[J]. The Journal of Cell Biology,1993，123:455
[4] ERNFORS P，WETMORE C. Identification of cells in rat brain and peripheral tissues expressing mRNA for members of nerve growth factor family[J]. Neuron，1990，5:511
, http://www.100md.com
[5] HOHN A，LEIBROCEK J. Indentification and characterization of a novel member of the nerve growth factor，brain-derived neurotrophic factor family[J]. Nature,1990，344: 339
[6] MAISONPIERRE P C，BELLOUSCIO L. Neurotrophin-3: a neurotrophic factor related to NGF and BDNF[J]. Science, 1990，247:1446
[7] ZHOU X-F, RUSH R A. Endogenous brain-derived neurotrophic factor is anterogradely transported in primary sensory neurons[J]. Neurosci, 1996，74(4):945
[8] MICHAEL D E，DAVID R K. NGF-stimulated retrograde transport of trKA in the mammalian nervous system[J]. The Journal of Cell Biology,1995，130:149
收稿日期：1999-10-26, 百拇医药
单位：顾玲(昆明市延安医院神经科，昆明 650051)；高玉陪(昆明市延安医院神经科，昆明 650051)；唐太昆(昆明市延安医院神经科，昆明 650051)； 李斌(昆明市延安医院神经科，昆明 650051)； 陈彦红(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：猫脊髓；背根节；免疫组化；分布
昆明医学院学学报000108 摘 要：采用免疫组织化学方法探讨trKC在成年猫脊髓L3，L5节段和L6背根节的分布. 结果：trKC的免疫阳性反应物(trKC-IR)主要分布于脊髓腹角、中间带、背角深部以及背根节(DRG)的大神经元胞浆内. 此外，脊髓Ⅱ板层还可见均质状的trKC-IR，染色明显深于其它各层；而DRG的少数中、小神经元亦呈trKC阳性反应. 提示，trKC可能与成年猫脊髓和DRG某些神经元的生理功能有关.
, 百拇医药
分类号：Q 426；R 651.2 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0034-03
The Immunohistochemical Study for the Distribution of TrK C in Spinal Cord and Dorsal Root Ganglion of Adult Cats
GU Ling GAO Yu-pei TANG Tai-kun LI Bin
( Dept. of Neuroscience，Yanan Hospital,Kunming 650032)
CHEN Yan-hong WANG Ting-hua
, 百拇医药
(Institute for Research on Neuroscience,Kunming Medical College ， Kunming 650031)
Abstract：TrKC was designated as the functional receptor of neurotrophin-3. In this study，we investigated the distribution of trKC-like immunoreactivity (trKC-IR) in spinal cord and dorsal root ganglion of adult cats using specific antiserum for trKC by immmunohistochemistry ABC method. The results were as following: In spinal cord，trKC-IR was mainly distributed in neurons including ventrolateral horn，intermedius zone，and the deep of dorsal horn. The subcellular localization of positive product was mainly in cytoplasm. In addition，homogenous trKC-IR was also found in lamina II. In dorsal root ganglion (DRG)，trKC-IR was mainly distributed in large neurons and a few small to medium sized neurons. Our results give morphological evidence on the distribution of trKC in DRG and spinal cord of adult cats. It indicated that the role of trKC involves in physiological function of DRG and spinal cord of adult cat.
, 百拇医药
Key words：Spinal cord of cat; Dorsal root ganglion; Immunohistochemistry; Distribution▲
TrKC是trK受体家族的重要成员，1991年由Lamballe等克隆并鉴定为NT-3的功能受体. 之后，诸多证据提供了trKC 及其mRNA在成年大鼠周围和中枢神经系统分布的资料[1～3]. 提示其与正常成年大鼠周围和中枢神经系统的某些生理功能有关. 由于至今未见trKC在成年猫脊髓和背根节分布的报道，本文用免疫组织化学方法探讨trKC在成年猫脊髓和背根节(dorsal root ganglion，DRG)的表达以了解其与脊髓和DRG的关系.
1 材料方法
1.1 标本获取
成年雄猫(体重3～3.5 kg)5只，用3.5%戊巴比妥钠(1.3 mL/kg)腹腔注射麻醉. 4%多聚甲醛心内灌注固定2 h，取L6 DRG，L3节段脊髓后固定6 h，入20%蔗糖PBS下沉过夜. 制作20 μm厚的冰冻切片. 间断取片备用.
, 百拇医药
1. 2 免疫组织化学染色
用trKC抗血清(滴度为1：1 000，Santa Cruz)对切片行ABC免疫组织化学染色，DAB棕色反应呈色. 裱片，脱水，树胶封片.
1.3 结果观察及阴性对照实验
在Olympus 显微镜下，观察trKC样免疫阳性产物(trKC-IR)在DRG和脊髓的分布. 用PBS代替trKC抗血清作阴性对照.
2 结果
2.1 脊髓
trKC的免疫阳性反应物(trKC immunoreactivity，trKC-IR)主要定位于灰质腹角、中间带(包括背核)及后角深部的神经元，胞浆染色(图1). 后角浅层trKC-IR阳性细胞少见. 但Ⅱ板层呈均质状trKC-IR阳性染色，明显深于其它各层(图1)
, 百拇医药
图1 脊髓trKC免疫组化染色
a：腹角阳性神经元(200×)；b：背角II板层阳性染色(↑，40×)
2.2 背根节
trKC-IR主要定位于DRG胞体偏大的神经元(>57 μm)，但少数中小细胞(13～57 μm)亦见trKC-IR阳性反应. 阳性反应定位于细胞浆(图2).
图2 背根节trKC阳性神经元(↑大细胞)200×
3 讨论
3.1 trKC在脊髓
腹角：本文在脊髓腹角神经元观察到trKC的免疫阳性反应物，表明trKC主要分布于脊髓腹角神经元. 而这可能为NT3提供了必要的结合位点. 由于有研究已发现脊髓运动神经元和其靶组织均表达NT-3mRNA[4～6]. 因而，脊髓运动神经元表达trKC提示前角运动神经元不仅可摄取NT3，而且NT3在脊髓前角运动细胞可能存在自分泌作用方式. 此外，最近的研究还证实脊髓运动神经元还表达trKC mRNA[3]，提示脊髓运动神经元有可能合成trKC. 本文在腹角运动神经元观察到的trKC的免疫阳性反应物为此提供了进一步的免疫组织化学证据.
, http://www.100md.com
背角神经元与脊髓II板层：除腹角神经元表达trKC外，后角深部神经元亦呈trKC-IR阳性反应. 另外，后角Ⅱ板层亦见均质状的trKC-IR. 表明该两部位亦有trKC分布. 进而提示，trKC可能与这些部位的NT-3发挥作用有关. 由于至今未见脊髓后角有trKC mRNA的报道. 因此，背角内trKC的来源尚待探讨. 基于文献报道背根节大、小细胞分别发出粗有髓和无髓纤维到达脊髓后角深部(包括中间带)及后角浅部，结合背根节细胞表达trKC mRNA，推测脊髓后角的trKC可能与DRG有关. 事实上，一种蛋白质在DRG细胞内合成，然后经中枢突末端并释放入脊髓是完全可能的. 研究表明，BDNF和P物质等均可在背根节合成并经中枢支转运并进入脊髓后角[7]. 此外，其它研究还报道神经生长因子受体trKA亦可在坐骨神经发生逆行运输[8]. 综合之，受体在神经突起转运并不是不可能的.
3.2 trKC在DRG
本文观察到背根节的大细胞及少数中小细胞均有trKC-IR，提示，DRG的大神经元和少数中、小神经元均含有trKC. 由于至今大多数文献报道NT3主要对DRG的大神经元有营养作用，而本文发现NT3的功能受体trKC主要定位于DRG大神经元的结果亦支持上述已知的结论. 即NT3通过与其受体结合而对大神经元发挥作用. 然而，与已知文献报道有所不同的是，本文在少数中小神经元亦观察到trKC-IR. 提示成年猫DRG少数中小神经元亦表达trKC. 该结果提示NT3在DRG的作用可能不仅仅局限于大神经元，但详情尚有待于进一步深入研究.
, 百拇医药
本文的结果为trKC在成年猫脊髓和背根节的分布提供了重要的免疫组织化学证据.trKC在成年猫脊髓和背根节的存在为NT3与之结合发挥相应功能提供了可能的结合位点.今后进一步探讨NT3在成年猫脊髓和DRG中的生理作用将是一项有趣的工作.■
基金项目：云南省自然科学基金资助课题(99C0006R)
作者简介：顾玲，(1966～)，女，昆明人.主治医师. 研究方向：神经损伤修复.
参考文献：
[1] MARTIN Z D，BARBACID M. Expression of the trK proto-oncogen is restricted to the sensory cranial and spinal ganglion of neural crest original in mouse development[J]. Genes,1990，4:683
, 百拇医药
[2] MERLIO J P，ERNFORS P. Molecular cloning of rat trKC and distribution of cells expression messenger RNAs for members of the trK family in the rat central nervous system[J]. Neurosci,1992，51(3:513
[3] FUNAKOSHI H，FRISEN J. Diffrential expression of mRNAs for neurotrophins and their receptors after axotomy of the sciatic nerve[J]. The Journal of Cell Biology,1993，123:455
[4] ERNFORS P，WETMORE C. Identification of cells in rat brain and peripheral tissues expressing mRNA for members of nerve growth factor family[J]. Neuron，1990，5:511
, http://www.100md.com
[5] HOHN A，LEIBROCEK J. Indentification and characterization of a novel member of the nerve growth factor，brain-derived neurotrophic factor family[J]. Nature,1990，344: 339
[6] MAISONPIERRE P C，BELLOUSCIO L. Neurotrophin-3: a neurotrophic factor related to NGF and BDNF[J]. Science, 1990，247:1446
[7] ZHOU X-F, RUSH R A. Endogenous brain-derived neurotrophic factor is anterogradely transported in primary sensory neurons[J]. Neurosci, 1996，74(4):945
[8] MICHAEL D E，DAVID R K. NGF-stimulated retrograde transport of trKA in the mammalian nervous system[J]. The Journal of Cell Biology,1995，130:149
收稿日期：1999-10-26, 百拇医药