肿瘤坏死因子壳聚糖微球的制备及抗癌活性
作者：方华丰 周宜开 任恕
单位：同济医科大学公共卫生学院环境医学研究所，武汉 430030
关键词：肿瘤坏死因子；壳聚糖；微球
同济医科大学学报000118 摘要 采用Berthold法制备肿瘤坏死因子(TNFα)壳聚糖微球，并测定微球的一些基本特征参数。结果表明，微球粒径主要 分布在1.2～3.5 μm内，载药量为4500U/mg，包封率为 95.4%。体外释放实验表明，壳聚糖微球具有显著的缓释作用，是生物大分子药物很好的载体。TNFα壳聚糖微球能显著减轻小鼠瘤重，延长小鼠存活期，降低药物的毒副作用，与空白组及TNFα组比较，均有极显著意义(均为P<0.01)。
中图法分类号 R730.3， R943
Preparation of Chitosan Microspheres Loading TN Fα and
, http://www.100md.com
the Anti-tumorActivity
Fang Huafeng Zhou Yikai Ren Shu
(Institute of Environmental Medicine, School of Public Health, Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Abstract Chitosan microspheres loading TNFαwere prepared by Berthold method, and the features such as the size distribution, in-vitro release, drug content, werestudied. The diameter of microspheres were estimated to be about 1.2 to 3.5 μm. The drug content was 4500 U/mg.Release rate of TNFα fro m chitosan microspheres was prolonged. The antitumor activity was evaluated by injection ofTNFα-loaded microspheres into H22 mice. The results demons trated the potentials of TNFα-loaded chitosanmicrospheres for sustained drug delivery to minimize drug toxicity and maximize therapeutic efficacy, with the difference beingvery significant as compared with those in b lank group and TNFα group (P<0.01).
, 百拇医药
Keywords tumor necrosis factor; chitosan; microsphere
肿瘤坏死因子(TNFα)是迄今为止所发现具有直接杀伤肿瘤细胞作用最强的生物活性因子之一[1]。已证实TNFα对肿瘤有一定疗效，但全身治疗时毒副作用较大，限制了其用 药剂量，单独使用TNFα还可引起肿瘤细胞对TNFα的耐受，加之TNFα对环境耐受力较差，在体内很快失活，全身用药很难在肿瘤部位达到有效浓度[2]，以小剂量TNFα靶向治疗不失为解决上述问题的一种好方法[3]。
壳聚糖无毒，具有很好的生物相容性、生物可降解性，作为一种新型药用辅料在缓释给药系统的应用引起了人们浓厚兴趣[4,5]。近年来壳聚糖微球已用来运载生物大分子活性物质[6]。1996年Berthold针对壳聚糖的特征提出了一种新的制备微球的方法[7]，包封小分子抗炎药物，我们对此方法进行改进，用于制备生物大分子壳聚糖微球。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα, 5×105 U/ml,活性6×106 U/mg)，TNFα 酶联免疫检测试剂盒(军事医学科学院邦定生物医学公司产品)，壳聚糖(脱乙酰度80%，自制)。
DG3022酶联免疫检测仪，CPS-1A超声波粉碎机，显微镜，S-520型扫描电镜，TS14-2型分析天平，751-G紫外分光光度计。
小鼠：昆明种，18～20g，雌雄各半，由同济医科大学实验动物学部提供； 瘤源小鼠：H22，由同济医科大学药学院提供。
1.2 空白壳聚糖微球的制备
取壳聚糖约0.25 g溶于20ml/L 冰醋酸溶液中，加吐温-80 1.0 ml，磁 力搅拌和超声处理，滴加200 g/LNa2SO4溶液，至出现浑浊，通过分光光 度计于500nm处测定其浊度来判断微球的形成，微球形成后继续搅拌及 超声处理1 h，10 000～12 000 r/min，离心15min，分离所得的微球，重新 悬浮水中，洗涤纯化，冷冻干燥。
, 百拇医药
1.3 空白壳聚糖微球吸水膨胀实验
精密称取3份冷冻干燥的壳聚糖微球约100 mg，分别置于pH6.2醋酸 盐缓冲液中，磁力搅拌(400r/min)，定时离心，称量微球吸水后的重量。
1.4 TNFα壳聚糖微球的制备
取10mg冷冻干燥的壳聚糖微球悬浮于25 ml pH6.2醋酸缓冲液中， 加5×105 U/ml TNFα 1.0 ml，4℃磁力搅拌6 h，离心(10 000～12 000 r/min) 15min，将沉淀重新悬浮水中洗涤，将微球冷冻干燥，并将离心液、洗涤 液收集合并。
1.5 微球的大小、体外分布、形态
取微球少许，用含2.0 g/L 吐温-80的生理盐水分散,在显微镜下观察微球的大小、分布、形态，测定300个微球的粒径，并将所得数据进行统计 处理。
, http://www.100md.com
1.6 TNFα壳聚糖微球载药量及包封率测定
根据TNFα酶联免疫检测试剂盒提供的方法，用DG3022酶联免疫检测 仪，于492nm处测定吸光度(A)值，绘制标准曲线。
将“1.4”所得离心液、洗涤液合并，并用PBS定容至100ml，取10 μl， 另加90 μl PBS共100 μl作为待测样品，测定A492值，按下式计算微球载药量及包封率：
载药量=(投药量-合并液中药物量)/微球重量×100%
包封率=(投药量-合并液中药物量)/投药量×100%
1.7 体外释药实验
用动态透析法进行微球体外释药试验。取5 mg TNFα壳聚糖微球，混 悬于10.0ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4, 0.1 mol/L)，37 ℃恒温磁力搅拌 (120 r/min)，按时取样离心(10 000 r/min) 15min，取上清液15 μl，按一定比 例稀释，按“1.6”测定TNFα浓度。
, http://www.100md.com
1.8 灭菌试验
用辐射剂量为2.5×104 Gy的60Co，对灌封于5 ml安瓿中的微球进行灭菌实验，根据1995版中国药典规定的方法进行厌氧菌、需氧菌的检查。
1.9 稳定性考察
将灌封于5ml安瓿中的冻干微球，于冰箱(3～5 ℃)、室温(20～25 ℃) 和37℃烘箱条件下放置，于0、1、2、3月检查微球的形态、药物含量及 体外释药等。
1.10 体内抗癌活性
取接种6～8d的H22瘤源小鼠，颈椎脱臼致死，用无菌注射器穿过腹壁肌层抽取腹水，放入无菌小瓶，按1∶3加入无菌生理盐水将腹水稀释，作为接种液。分别于小鼠腹腔及右前肢腋下注射接种液0.2 ml。3 d后，分别 注射无菌壳聚糖微球(含TNFα5×104 U/ml)、TNFα、生理盐水0.2 ml， 计算生命延长率及肿瘤抑制率。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 壳聚糖微球的形成
微球的形成依赖于壳聚糖的溶解行为，pH是影响壳聚糖溶解的主要因素，但是溶液中的离子成分也可以影响壳聚糖的溶解，在醋酸盐、乳酸盐、谷氨酸盐中壳聚糖显示良好的溶解性，而磷酸盐、硫酸盐则降低壳聚糖的溶解性，这可能与壳聚糖溶解需要一定量的〔H+〕有关。在本实验中滴加Na2SO4溶液，根据浊度来判断微球的形成，见图1。
图1 Na2SO4溶液的用量及壳聚糖微球的形成
壳聚糖浓度始终控制在2.5 g/L，浓度不宜太高，浓度太高，粘度太大，滴加Na2SO4溶液后，微球粒度分布不均匀，可能引起沉聚，另外，吐温-80的加入对微球的稳定也很有必要。
, 百拇医药
2.2 壳聚糖微球的吸水膨胀实验
空白壳聚糖微球在偏酸的条件下有很强的吸水性能(图2)，显示理想的膨胀效果，水溶性药物因而较易被吸附进入微球内部。
图2 壳聚糖微球吸水曲线(pH6.2)
2.3 壳聚糖微球的基本特征
显微镜及电镜观察，壳聚糖微球外表光滑，粒径大小均匀，在混悬于生理盐水的状态，用光镜观察其分散性和流动性良好，粒径范围1.2～3.5μm，见图3，4。60Co照射灭菌，对其外观、粒径及其分布、药物含量无明显变化。 灌封于5ml安瓿中的冻干微球，于冰箱(3～5 ℃)、室温(20～25 ℃)和 37℃烘箱条件下放置，于0、1、2、3月检查微球的形态、药物含量及体 外释药等，结果均未见明显变化。
, http://www.100md.com
2.4 TNFα壳聚糖微球载药量及包封率
在使用的TNFα中有大量的白蛋白(1 mg/ml) 作为TNFα保护剂，不宜用蛋白质定量的方法测定，TNFα在pH较低时容易失活，因而也不能用盐酸将壳聚糖微球溶解。考虑本微球制备过程反应条件温和，不需有机溶剂，pH近中性，TNFα活性损失很小，我们通过测定制备微球后剩余TNFα量与总投药量来推算微球中TNFα含量。
TNFα标准曲线回归方程为：Y=0.0036C+0.0531(C：ng/ml，r=0.998)。待测样品A492平均值为0.081，壳聚微球中TNFα含量为75.6mg/g或4.5×106 U/g，包封率为95.4%。
图3 TNFα壳聚糖微球显微镜图 ×400
, 百拇医药
图4 TNFα壳聚糖微球电镜扫描图 ×8000
2.5 TNFα壳聚糖微球的体外释放特征
载药微球的药物释放速率主要由药物扩散速率和材料降解速率两个因素决定，壳聚糖在pH>7.0时降解较慢，而且大分子水溶性物质从微球内向外扩散速率较慢，这些因素决定了TNFα壳聚糖微球具有较好的缓释性能，见图5，微球在释药初期释药速度较快，而后较平稳释放，释药速度 降低，20d大约释放65%。其释药规律可用Higuchi方程描述：
Y=14.13t1/2+8.40， r=0.97。
图5 TNFα壳聚糖微球累积释放度
2.6 体内抗癌活性
, http://www.100md.com
TNFα对环境的耐受力较差，单纯注射游离TNFα，对小鼠的生存期有 一定的延长作用,但TNFα在体内迅速失活，而微球中的TNFα由于受到保护和缓慢释放而长时间维持TNFα的有效药物浓度，TNFα壳聚糖微球(TNF-M)能显著延长H22肝癌小鼠的生存期, 降低小鼠瘤重，见表1、2。
表1 壳聚糖微球延长小鼠生存期 组别
只
生存时间 (d)
延长率(%)
TNF-M (1.0×104 U)
10
26.9±2.5
, http://www.100md.com
44.6**△
TNFα (1.0×104 U)
10
20.8±1.8
11.8*
空白组
10
18.6±1.5
t检验； 与空白组比较 * P<0.05 **P<0.01；
与TNFα组比较 △ P<0.01表2 壳聚糖微球抑制小鼠瘤肿 组别
, 百拇医药
只
瘤重(g)
抑制率(%)
TNF-M (1.0×104 U)
10
1.063±0.136
65.3**△
TNF (1.0×104 U)
10
2.708±0.145
11.6*
, 百拇医药
空白组
10
3.062±0.234
t检验； 与空白组比较 * P<0.05 **P<0.01；
与TNFα组比较 △ P<0.013 讨论
从Yolles等1971年首次制备了胰岛素-PLA微球至今，生物大分子微球给药系统已取得了较大的进展，但是研究领域大多数局限于分子量较小的多肽，对诸如α干扰素、TNF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等生物大分子药物微球研究缓慢，报道较少[8]。这与此类药物本身不稳定，很难避免成球工艺中各种因素对其结构的破坏有关。壳聚糖微球的制备方法有乳化交联、蒸发溶剂、喷雾干燥、液中干燥 等方法[4，5]。由于TNFα对温度、有机溶剂等都很敏感，我们首次报道采用了Berthold法制备TNFα壳聚糖微球，该法不需有机溶剂及戊二醛等交联剂，反应条件温和，设备操作简单，纯化容易，适合于制备生物大分子药物微球。
, http://www.100md.com
空白壳聚糖微球在偏酸的条件下显示理想的膨胀效果，水溶性药物较 易被吸附进入微球内部，只需大约6h吸附即达到平衡，而在pH7.4 PBS 中却缓慢释放，这可能与pH有关，另外生物大分子被吸附进入壳聚糖微球的通道，与其释放途径可能不同。有关这方面的研究尚需进一步探讨。
在TNFα中混入一定量的白蛋白，可大大降低TNFα的失活率，本文使用的TNFα中含有大量的BSA作为TNFα保护剂，BSA也同TNFα一起被包封于微球内部，因而微球中TNFα受到双重保护。
国家自然科学基金资助项目(No.39990570)
方华丰，男，1969年生，博士
参 考 文 献
1，林缨, 常慧兰, 闫安庄.α-型重组人肿瘤坏死因子衍生物体内抑瘤作用的 初步研究. 药物生物技术, 1997,4(2):77
, 百拇医药
2 余伟华,焦炳华.肿瘤坏死因子及相关细胞毒素.上海:上海科学技术出版社， 1991.354～370
3，Iwata M, Nakamura Y, Ginity J W. Particle size and loading efficienc y of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) multiphase microspheres containing wa ter soluble substances prepared by the hydrous andanhydrous solvent evaporation methods. J Microencapsul, 1999,16: 49
4 方华丰,周宜开.壳聚糖微球的研究进展.国外医药—合成药生化药制剂分册,1999,20(5):315
5，Lisbeth I. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharm Res,1998,15: 1326
, 百拇医药
6，Jameela S R, Misra A, Jayakkishnan A. Crosslinked chitosan microsphe res ascarriers for prolonged delivery of macromolecular drugs. J Biomater Sci Polym Edn, 1994,6: 621
7，Berthold A, Cremer K, Kreuter J. Preparation and characterisation of chitosan microspheres as drug carrier forprednisolone sodium phosphate as mo del antiinflammatory drugs. J Control Release, 1996,39: 17
8，陈庆华,瞿文. 多肽、蛋白质药物的微球给药系统研究进展. 国外医学药学 分册, 1997, 24(3):129
(1999-07-29 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学公共卫生学院环境医学研究所，武汉 430030
关键词：肿瘤坏死因子；壳聚糖；微球
同济医科大学学报000118 摘要 采用Berthold法制备肿瘤坏死因子(TNFα)壳聚糖微球，并测定微球的一些基本特征参数。结果表明，微球粒径主要 分布在1.2～3.5 μm内，载药量为4500U/mg，包封率为 95.4%。体外释放实验表明，壳聚糖微球具有显著的缓释作用，是生物大分子药物很好的载体。TNFα壳聚糖微球能显著减轻小鼠瘤重，延长小鼠存活期，降低药物的毒副作用，与空白组及TNFα组比较，均有极显著意义(均为P<0.01)。
中图法分类号 R730.3， R943
Preparation of Chitosan Microspheres Loading TN Fα and
, http://www.100md.com
the Anti-tumorActivity
Fang Huafeng Zhou Yikai Ren Shu
(Institute of Environmental Medicine, School of Public Health, Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Abstract Chitosan microspheres loading TNFαwere prepared by Berthold method, and the features such as the size distribution, in-vitro release, drug content, werestudied. The diameter of microspheres were estimated to be about 1.2 to 3.5 μm. The drug content was 4500 U/mg.Release rate of TNFα fro m chitosan microspheres was prolonged. The antitumor activity was evaluated by injection ofTNFα-loaded microspheres into H22 mice. The results demons trated the potentials of TNFα-loaded chitosanmicrospheres for sustained drug delivery to minimize drug toxicity and maximize therapeutic efficacy, with the difference beingvery significant as compared with those in b lank group and TNFα group (P<0.01).
, 百拇医药
Keywords tumor necrosis factor; chitosan; microsphere
肿瘤坏死因子(TNFα)是迄今为止所发现具有直接杀伤肿瘤细胞作用最强的生物活性因子之一[1]。已证实TNFα对肿瘤有一定疗效，但全身治疗时毒副作用较大，限制了其用 药剂量，单独使用TNFα还可引起肿瘤细胞对TNFα的耐受，加之TNFα对环境耐受力较差，在体内很快失活，全身用药很难在肿瘤部位达到有效浓度[2]，以小剂量TNFα靶向治疗不失为解决上述问题的一种好方法[3]。
壳聚糖无毒，具有很好的生物相容性、生物可降解性，作为一种新型药用辅料在缓释给药系统的应用引起了人们浓厚兴趣[4,5]。近年来壳聚糖微球已用来运载生物大分子活性物质[6]。1996年Berthold针对壳聚糖的特征提出了一种新的制备微球的方法[7]，包封小分子抗炎药物，我们对此方法进行改进，用于制备生物大分子壳聚糖微球。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα, 5×105 U/ml,活性6×106 U/mg)，TNFα 酶联免疫检测试剂盒(军事医学科学院邦定生物医学公司产品)，壳聚糖(脱乙酰度80%，自制)。
DG3022酶联免疫检测仪，CPS-1A超声波粉碎机，显微镜，S-520型扫描电镜，TS14-2型分析天平，751-G紫外分光光度计。
小鼠：昆明种，18～20g，雌雄各半，由同济医科大学实验动物学部提供； 瘤源小鼠：H22，由同济医科大学药学院提供。
1.2 空白壳聚糖微球的制备
取壳聚糖约0.25 g溶于20ml/L 冰醋酸溶液中，加吐温-80 1.0 ml，磁 力搅拌和超声处理，滴加200 g/LNa2SO4溶液，至出现浑浊，通过分光光 度计于500nm处测定其浊度来判断微球的形成，微球形成后继续搅拌及 超声处理1 h，10 000～12 000 r/min，离心15min，分离所得的微球，重新 悬浮水中，洗涤纯化，冷冻干燥。
, 百拇医药
1.3 空白壳聚糖微球吸水膨胀实验
精密称取3份冷冻干燥的壳聚糖微球约100 mg，分别置于pH6.2醋酸 盐缓冲液中，磁力搅拌(400r/min)，定时离心，称量微球吸水后的重量。
1.4 TNFα壳聚糖微球的制备
取10mg冷冻干燥的壳聚糖微球悬浮于25 ml pH6.2醋酸缓冲液中， 加5×105 U/ml TNFα 1.0 ml，4℃磁力搅拌6 h，离心(10 000～12 000 r/min) 15min，将沉淀重新悬浮水中洗涤，将微球冷冻干燥，并将离心液、洗涤 液收集合并。
1.5 微球的大小、体外分布、形态
取微球少许，用含2.0 g/L 吐温-80的生理盐水分散,在显微镜下观察微球的大小、分布、形态，测定300个微球的粒径，并将所得数据进行统计 处理。
, http://www.100md.com
1.6 TNFα壳聚糖微球载药量及包封率测定
根据TNFα酶联免疫检测试剂盒提供的方法，用DG3022酶联免疫检测 仪，于492nm处测定吸光度(A)值，绘制标准曲线。
将“1.4”所得离心液、洗涤液合并，并用PBS定容至100ml，取10 μl， 另加90 μl PBS共100 μl作为待测样品，测定A492值，按下式计算微球载药量及包封率：
载药量=(投药量-合并液中药物量)/微球重量×100%
包封率=(投药量-合并液中药物量)/投药量×100%
1.7 体外释药实验
用动态透析法进行微球体外释药试验。取5 mg TNFα壳聚糖微球，混 悬于10.0ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4, 0.1 mol/L)，37 ℃恒温磁力搅拌 (120 r/min)，按时取样离心(10 000 r/min) 15min，取上清液15 μl，按一定比 例稀释，按“1.6”测定TNFα浓度。
, http://www.100md.com
1.8 灭菌试验
用辐射剂量为2.5×104 Gy的60Co，对灌封于5 ml安瓿中的微球进行灭菌实验，根据1995版中国药典规定的方法进行厌氧菌、需氧菌的检查。
1.9 稳定性考察
将灌封于5ml安瓿中的冻干微球，于冰箱(3～5 ℃)、室温(20～25 ℃) 和37℃烘箱条件下放置，于0、1、2、3月检查微球的形态、药物含量及 体外释药等。
1.10 体内抗癌活性
取接种6～8d的H22瘤源小鼠，颈椎脱臼致死，用无菌注射器穿过腹壁肌层抽取腹水，放入无菌小瓶，按1∶3加入无菌生理盐水将腹水稀释，作为接种液。分别于小鼠腹腔及右前肢腋下注射接种液0.2 ml。3 d后，分别 注射无菌壳聚糖微球(含TNFα5×104 U/ml)、TNFα、生理盐水0.2 ml， 计算生命延长率及肿瘤抑制率。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 壳聚糖微球的形成
微球的形成依赖于壳聚糖的溶解行为，pH是影响壳聚糖溶解的主要因素，但是溶液中的离子成分也可以影响壳聚糖的溶解，在醋酸盐、乳酸盐、谷氨酸盐中壳聚糖显示良好的溶解性，而磷酸盐、硫酸盐则降低壳聚糖的溶解性，这可能与壳聚糖溶解需要一定量的〔H+〕有关。在本实验中滴加Na2SO4溶液，根据浊度来判断微球的形成，见图1。
图1 Na2SO4溶液的用量及壳聚糖微球的形成
壳聚糖浓度始终控制在2.5 g/L，浓度不宜太高，浓度太高，粘度太大，滴加Na2SO4溶液后，微球粒度分布不均匀，可能引起沉聚，另外，吐温-80的加入对微球的稳定也很有必要。
, 百拇医药
2.2 壳聚糖微球的吸水膨胀实验
空白壳聚糖微球在偏酸的条件下有很强的吸水性能(图2)，显示理想的膨胀效果，水溶性药物因而较易被吸附进入微球内部。
图2 壳聚糖微球吸水曲线(pH6.2)
2.3 壳聚糖微球的基本特征
显微镜及电镜观察，壳聚糖微球外表光滑，粒径大小均匀，在混悬于生理盐水的状态，用光镜观察其分散性和流动性良好，粒径范围1.2～3.5μm，见图3，4。60Co照射灭菌，对其外观、粒径及其分布、药物含量无明显变化。 灌封于5ml安瓿中的冻干微球，于冰箱(3～5 ℃)、室温(20～25 ℃)和 37℃烘箱条件下放置，于0、1、2、3月检查微球的形态、药物含量及体 外释药等，结果均未见明显变化。
, http://www.100md.com
2.4 TNFα壳聚糖微球载药量及包封率
在使用的TNFα中有大量的白蛋白(1 mg/ml) 作为TNFα保护剂，不宜用蛋白质定量的方法测定，TNFα在pH较低时容易失活，因而也不能用盐酸将壳聚糖微球溶解。考虑本微球制备过程反应条件温和，不需有机溶剂，pH近中性，TNFα活性损失很小，我们通过测定制备微球后剩余TNFα量与总投药量来推算微球中TNFα含量。
TNFα标准曲线回归方程为：Y=0.0036C+0.0531(C：ng/ml，r=0.998)。待测样品A492平均值为0.081，壳聚微球中TNFα含量为75.6mg/g或4.5×106 U/g，包封率为95.4%。
图3 TNFα壳聚糖微球显微镜图 ×400
, 百拇医药
图4 TNFα壳聚糖微球电镜扫描图 ×8000
2.5 TNFα壳聚糖微球的体外释放特征
载药微球的药物释放速率主要由药物扩散速率和材料降解速率两个因素决定，壳聚糖在pH>7.0时降解较慢，而且大分子水溶性物质从微球内向外扩散速率较慢，这些因素决定了TNFα壳聚糖微球具有较好的缓释性能，见图5，微球在释药初期释药速度较快，而后较平稳释放，释药速度 降低，20d大约释放65%。其释药规律可用Higuchi方程描述：
Y=14.13t1/2+8.40， r=0.97。
图5 TNFα壳聚糖微球累积释放度
2.6 体内抗癌活性
, http://www.100md.com
TNFα对环境的耐受力较差，单纯注射游离TNFα，对小鼠的生存期有 一定的延长作用,但TNFα在体内迅速失活，而微球中的TNFα由于受到保护和缓慢释放而长时间维持TNFα的有效药物浓度，TNFα壳聚糖微球(TNF-M)能显著延长H22肝癌小鼠的生存期, 降低小鼠瘤重，见表1、2。
表1 壳聚糖微球延长小鼠生存期 组别
只
生存时间 (d)
延长率(%)
TNF-M (1.0×104 U)
10
26.9±2.5
, http://www.100md.com
44.6**△
TNFα (1.0×104 U)
10
20.8±1.8
11.8*
空白组
10
18.6±1.5
t检验； 与空白组比较 * P<0.05 **P<0.01；
与TNFα组比较 △ P<0.01表2 壳聚糖微球抑制小鼠瘤肿 组别
, 百拇医药
只
瘤重(g)
抑制率(%)
TNF-M (1.0×104 U)
10
1.063±0.136
65.3**△
TNF (1.0×104 U)
10
2.708±0.145
11.6*
, 百拇医药
空白组
10
3.062±0.234
t检验； 与空白组比较 * P<0.05 **P<0.01；
与TNFα组比较 △ P<0.013 讨论
从Yolles等1971年首次制备了胰岛素-PLA微球至今，生物大分子微球给药系统已取得了较大的进展，但是研究领域大多数局限于分子量较小的多肽，对诸如α干扰素、TNF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等生物大分子药物微球研究缓慢，报道较少[8]。这与此类药物本身不稳定，很难避免成球工艺中各种因素对其结构的破坏有关。壳聚糖微球的制备方法有乳化交联、蒸发溶剂、喷雾干燥、液中干燥 等方法[4，5]。由于TNFα对温度、有机溶剂等都很敏感，我们首次报道采用了Berthold法制备TNFα壳聚糖微球，该法不需有机溶剂及戊二醛等交联剂，反应条件温和，设备操作简单，纯化容易，适合于制备生物大分子药物微球。
, http://www.100md.com
空白壳聚糖微球在偏酸的条件下显示理想的膨胀效果，水溶性药物较 易被吸附进入微球内部，只需大约6h吸附即达到平衡，而在pH7.4 PBS 中却缓慢释放，这可能与pH有关，另外生物大分子被吸附进入壳聚糖微球的通道，与其释放途径可能不同。有关这方面的研究尚需进一步探讨。
在TNFα中混入一定量的白蛋白，可大大降低TNFα的失活率，本文使用的TNFα中含有大量的BSA作为TNFα保护剂，BSA也同TNFα一起被包封于微球内部，因而微球中TNFα受到双重保护。
国家自然科学基金资助项目(No.39990570)
方华丰，男，1969年生，博士
参 考 文 献
1，林缨, 常慧兰, 闫安庄.α-型重组人肿瘤坏死因子衍生物体内抑瘤作用的 初步研究. 药物生物技术, 1997,4(2):77
, 百拇医药
2 余伟华,焦炳华.肿瘤坏死因子及相关细胞毒素.上海:上海科学技术出版社， 1991.354～370
3，Iwata M, Nakamura Y, Ginity J W. Particle size and loading efficienc y of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) multiphase microspheres containing wa ter soluble substances prepared by the hydrous andanhydrous solvent evaporation methods. J Microencapsul, 1999,16: 49
4 方华丰,周宜开.壳聚糖微球的研究进展.国外医药—合成药生化药制剂分册,1999,20(5):315
5，Lisbeth I. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharm Res,1998,15: 1326
, 百拇医药
6，Jameela S R, Misra A, Jayakkishnan A. Crosslinked chitosan microsphe res ascarriers for prolonged delivery of macromolecular drugs. J Biomater Sci Polym Edn, 1994,6: 621
7，Berthold A, Cremer K, Kreuter J. Preparation and characterisation of chitosan microspheres as drug carrier forprednisolone sodium phosphate as mo del antiinflammatory drugs. J Control Release, 1996,39: 17
8，陈庆华,瞿文. 多肽、蛋白质药物的微球给药系统研究进展. 国外医学药学 分册, 1997, 24(3):129
(1999-07-29 收稿), 百拇医药