基质金属蛋白酶活性测定的改良底物胶电泳法
作者：丁廷波 杨渝珍 韩玲 王开富 王震
单位：同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室， 武汉 430030
关键词：金属蛋白酶类；电泳，聚丙烯酰胺凝胶
同济医科大学学报000115 摘要 基于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的原理和技术方法，介绍一种改良的明胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法(Gelatin-PAGE)，简称底物胶电泳法，用于测定能够水解明胶的基质金属蛋白酶类(MMPs)的水解活性。该方法简便实用，将底物胶中明胶浓度从10 g/L降至2 g/L，并将分子质量标准浓度提高至≤ 40μg/孔，较好地解决了实验过程中所遇到的有关分子质量鉴定的难题。
中图法分类号 Q559， R446.11
Modified Gelatin-PAG Electrophoresis for Deter mination
, 百拇医药
of Activity ofMatrix Metalloproteinase
Ding Tingbo Yang Yuzhen an Ling et al
(Department of Molecular Biology, Research Center of Ex perimental Medicine,TongjiMedical University, Wuhan 430030)
Abstract On the basis of theprinciples and techniques of SDS- PAG electrophoresis, a new modified Gelatin-PAGE method, called as substance-ge lelectrophoresis, was introduced. This modified method can be used to determine the activity of matrix metalloproteinase whichhad capacity of digesting gelati n. This method decreased the concentration of gelatin mixed with PAG from 10 g/L to 2 g/L,and increased the molecular weight standard concentration to ≤40 μg /well. It is simple and practical.
, 百拇医药
Keywords metalloproteinases; electrophoresis, polyacrylamide GEL
金属蛋白酶(metalloproteinase,MP)超家族成员的共同特点是它们的水解活性呈金属浓度依赖性。其中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)家族目前已鉴定出18名成员，可以各型胶原、明胶、纤维结合素、层连蛋白等为底物，其中MMP1、2、7、9、MT-MMP等还能以TNFα前体(Pro-TNFα)为底物[1]，在TNFα前体向成熟型转化中起关键作用[2]。MMP的基因表达水平和酶活性的高低与许多生理或病理过程及其恶性程度相关，如肿瘤转移、血管侵入、骨质疏松、合子植入、组织纤维化等[3，4]。因此,从方法学的角度,寻找简便实用的MMP底物水解活性的测定方法有重要的意义。本文介绍一种改良的明胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法(Gelatin-PAGE)[5]，简称底物胶电泳法，较好地解决了实验过程中所遇到的一些难题。
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1 材料与方法
1.1 材料
YYW-Ⅱ型垂直电泳槽和电泳仪(北京，六一仪器厂)，24或96孔培养板，培养瓶，CO2培养箱，超净工作台，震荡器等。
明胶(gelatin),国产或进口均可；SDS，Triton X-100，丙烯酰胺(Acr)及甲叉双丙烯酰胺 (Bis)等聚丙烯酰胺凝胶电泳所需的全部试剂(略)。
1.2 方法
1.2.1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：按常规方法进行或参见文献[6]。
1.2.2 Gelatin-PAGE的添加试剂：① 40 g/L 明胶储存液：37 ℃溶解，-20 ℃冰箱保存，或临用前新鲜配制；②匀浆缓冲液(buffer 1)：pH 7.0，20 mmol/L 的磷酸盐缓冲液 ，其中含 2.5 g/LTriton X-100和0.01 mol/L CaCl2；③悬浮缓冲液(buffer 2)： 0.01 mol/L CaCl2 、0.05 mol/L Tris.Cl、0.15 mol/L NaCl 溶于H2O中，用10 mol/L HCl 调节pH值至7.5；④ 洗脱缓冲液(buffer 3)：25 g/L TritonX-100、0.05 mol/L Tris.Cl也溶于H2O中，调节 pH 值至7.5；⑤ 底物缓冲液(buffer 4)：0.01 mol/LCaCl2 、0.05 mol/L Tris.Cl 、0.2 mol/L NaCl 、1.0 μmol/L ZnCl 2 溶于H2O中，用10 mol/LHCl调节pH值至7.5；⑥ Gelatin-PAG的制备(底物胶)：所有试剂,包括加样缓冲液、分离胶及浓缩胶配制、灌胶步骤、电泳条件等完全与常规SDS-PAGE相同,不作另述。Gelatin-PAG与PAG 制备的唯一区别是前者在配制分离胶的过程中加入 了终浓度为2～10g/L 的明胶,混合均匀后再行灌胶,凝固后即为Gelatin-PAG(底物胶)。本 实验中采用的分离胶浓度为100g/L，浓缩胶浓度为50 g/L。
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1.2.3 操作步骤：①样品制备: 收集离心沉淀的细胞或洗净的组织块,与buffer1按1∶1( V/W)的比例混合,置于冰上匀浆。在5000 r/min 离心5 min后，收集上清，沉淀继续用b uffer2等体积悬浮，充分混匀，再于5000 r/min 离心5 min，收集上清，并与第一次收集的上清混合。②加样和电泳：将上述含酶样品与不含β-巯基乙醇还原剂的上样缓冲液(loading buffer)混合，使混合液中所含SDS终浓度为20 g/L。混合液不用煮沸，而是在37 ℃放置 30min。同时制备浓缩胶和底物胶，凝固后，加样，在非还原条件下电泳。电泳条件同常规PAGE。③显色：电泳结束后，将凝胶取下，置buffer 3中，室温下浸泡2次，每次15 min，以除去凝胶中的SDS组分。然后，将胶置于底物缓冲液(buffer 4)中，于37 ℃浸泡12～24h，进行底物水解反应。然后用考马斯亮蓝R250 染色1～2 h，轻轻振摇,此时可见样品中含水解明胶能力MMP的条带呈现透明状。④分子质量鉴定：将底物胶中明胶的浓度从10 g/L 减 至2g/L，于各样品孔中分别加入不具水解明胶能力的中分子量蛋白标准品和待测样品。电泳后，用刀片将凝胶切成两半。含有分子质量标准蛋白的胶片不经洗脱，直接进行染色；另半块胶片则按照“③显色”中介绍的步骤进行，然后，将底物胶上呈蓝色的标准蛋白条带和透明的MMP条带进行比较。
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2 结果
2.1 明胶-底物胶电泳及染色后所显示的MMPs酶活性透明条带
我们收集了若干细胞或组织样品按方法1.2.3中所介绍的步骤进行电泳，图1的结果表示在明胶终浓度为10 g/L的底物胶上所获得的结果，深蓝色的背景上显示清晰可见的透明条带，说明该条带所代表的酶水解活性确是明胶特异性的，该酶可以是分泌至胞外的(图1A)，也可以是分泌前尚留在胞内的(图1B)。
图1 不同来源的样品经明胶-底物胶电泳及染色后所显示的透明条带
A：来自子宫生理盐水冲洗液标本。line 1为用药前，line 2为用药后； B： 黑 色素瘤标本。line 1 、 2、 3为肝转移之实体瘤的组织裂解液， line 4、5 来自培养的 黑色素瘤B7细胞系的裂解物
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2.2 明胶浓度对非明胶水解酶活性的蛋白质显带清晰度的影响
图2A为不含底物明胶的普通PAG电泳条带，经过考马斯亮蓝染色及脱色后，于透明的凝胶背景上呈现清晰的蓝色蛋白质条带；而图2B则为同一样品在含2g/L 明胶的底物胶-PAG电泳后，由于明胶也被蓝染，故洗脱后，呈现的是淡蓝色的凝胶背景。随着PAG中明胶浓度增加，凝胶背景的蓝色也逐步加深，会掩盖非明胶水解酶活性的蛋白质条带，正如图2C所示，同样浓度的BSA(牛血清白蛋白)条带完全被掩盖(10 g/L明胶浓度)。图2D说明加样量(BSA)对迁移率的影响，上述情况为确定能水解明胶的MMPs的分子质量带来困难，因为分子质量标准蛋白的条带将被深色背景掩盖。
2.3 LPS刺激前后大鼠腹腔巨噬细胞MMPs底物胶电泳酶谱之变化
为解决水解酶条带的分子质量确定的问题，我们设计了适当增加分子质量标准蛋白浓度和减低明胶终浓度，以及同次电泳、分别染色的方法(见方法部分)，较好地解决了问题。图3为LPS刺激前后大鼠腹腔巨噬细胞MMPs底物胶电泳的结果。图中A、B、C为同一底物胶电泳后，将胶纵切分样品胶(B、C)和分子质量Marker(A)胶，分别处理、染色后的电泳条带。A胶内明胶的浓度为2g/L，蛋白质分子质量标准的浓度为2mg/ml，加样20 μl。B胶由于比A胶多了几个反应步骤，故胶背景的蓝色浅于A胶。C胶为同一样品在含10 g/L 明胶 的底物胶-PAG电泳的结果，B与C胶中的条带变化完全相同。
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对照分子质量蛋白标准，从图3中可见随着LPS刺激时间的增加，巨噬细胞胞浆裂解物中 分子质量为9.2 ku的MMP9前体条带增强，分子质量为8.5 ku左右的成熟型MMP9的条带变弱(大部分已分泌至胞外)；而分子质量分别为7.2和6.8 ku的前体型和成熟型MMP7 的条带均比LPS刺激前减弱。
图2 不同明胶浓度对中分子质量标准蛋白显带的影响
A：为不含明胶的聚丙烯酰胺凝胶，透明的背景上显示BSA的深蓝条带； B： 在 含2 g/L明胶的底物胶中，背景变成蓝色，但BSA条带仍然可见； C：在10 g/L 明胶-底物胶中背景呈深蓝色，BSA条带完全被掩盖，无法辨认； D：样品孔中加入的BSA浓度增高至一定限度后(从右至左)，将引起电泳迁移率的改变
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图3 LPS刺激前后大鼠腹腔巨噬细胞MMP底物胶电泳酶谱之变化[ ZK)
图A、B为同一底物胶(含2 g/L 明胶)电泳后，将胶切开，样品胶和分子质量Marker胶分别处理、染色后的电泳条带。line 1、3、4 为BSA的条带，line 2 为中分子质量标准 蛋白的5条带，line 5为LPS刺激前，巨噬细胞MMP的酶谱，line 6为LPS刺激6 h的酶谱，li ne 7为LPS刺激12 h的酶谱。图C为在含10g/L明胶的底物胶中同一样品的电泳结果。各line 的含意同图B中所示。line 8 为LPS刺激12 h后，细胞的saline洗涤液中的条带。a: Pro- MMP9； b: Pro-MMP7
3 讨论
底物胶电泳技术对研究基质金属蛋白酶(MMP)的基因表达之差异、内源或外源性激活条件、酶活性的调节是十分有用的。目前已发现MMPs家族含18个成员，主要以明胶为 底物的有MMP7和MMP9。它们的前体激活方式有两种，一是水解一段前肽后被激活，另一种是自身所含的假底物抑制肽的作用解除后而被激活。因而我们能同时检测到MMP7和MMP9 的前体和成熟型的活性条带。
, 百拇医药
我们在摸索实验条件的过程中，发现底物胶中明胶浓度是影响样品中MMP分子质量鉴定 的关键因素。由于明胶也能与染料结合，使底物胶全部染成蓝色；又由于底物胶电泳完毕后，还要经过去除Triton X-100及底物水解反应的孵育过程，也会导致将非酶活性的蛋白染色条带的色度减弱。因此，在同一浓度的底物胶中，将有明胶水解活性的MMP和无明胶水解活性的MMP两类蛋白条带均清晰地显示出来十分困难。为此，我们经反复摸索，将明胶浓度从1 0 g/L降到2 g/L，并将中分子质量蛋白标准的浓度增加到≥40 μg/孔(不能无限增加，否则迁移率要改变，见图2D)，获得满意的结果，解决了在同一块底物胶上同时显示中分子质 量蛋白标准和MMP条带的问题。另外也可以取已知分子质量的胶原酶为标准，同时与待测样品一起电泳，最终在透明条带之间进行分子质量的比较，但购买胶原酶价格较昂贵。
底物胶电泳时，除了加入明胶外，也可以加入酪蛋白等，以鉴定其它类型的MMPs，只要掌握上述标准，仍会得到满意的结果。
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由于底物胶电泳需要保持酶活性，因此上样缓冲液中切忌加入可破坏蛋白质亚基结构的 还原剂。
国家自然科学基金资助项目(No.39630320)
丁廷波,男,1973年生,硕士研究生
参 考 文 献
1，Gearing A J H, Beckettt P,Christodoulon M et al. Processing of tumour necrosis factor-α precursor by metalloproteinases. Nature, 1994,370:555
2，Mcgeehan G M, Becherer J D, Bast J R C et al. Regulation of t umour necrosisfactor-a processing by a metalloproteinase inhibitor. Nature, 1 994,370:558
, 百拇医药
3，方石岗.基质金属蛋白酶与肿瘤的侵袭和转移. 国外医学肿瘤学分册, 1996, 23 (suppl)：80
4，Swiderski R E, Dencoff J E, Hoerchinger C S et al. Differentia l expression of extracellular matrixremodeling genes in a murine model of ble omycin-induced pulmonary fibrosis. Am J Pathol, 1993, 152: 821
5，Unemori E N, Werb Z. Collagenase expression and endogenous activati on in rabbit synovial fibroblastsstimulated by the calcium ionophore A23187. J Bio Chem, 1998,263:16 252
6，SambrookJ, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning A labor atory manual. 2th ed. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. 880～887
(1999-04-13 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室， 武汉 430030
关键词：金属蛋白酶类；电泳，聚丙烯酰胺凝胶
同济医科大学学报000115 摘要 基于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的原理和技术方法，介绍一种改良的明胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法(Gelatin-PAGE)，简称底物胶电泳法，用于测定能够水解明胶的基质金属蛋白酶类(MMPs)的水解活性。该方法简便实用，将底物胶中明胶浓度从10 g/L降至2 g/L，并将分子质量标准浓度提高至≤ 40μg/孔，较好地解决了实验过程中所遇到的有关分子质量鉴定的难题。
中图法分类号 Q559， R446.11
Modified Gelatin-PAG Electrophoresis for Deter mination
, 百拇医药
of Activity ofMatrix Metalloproteinase
Ding Tingbo Yang Yuzhen an Ling et al
(Department of Molecular Biology, Research Center of Ex perimental Medicine,TongjiMedical University, Wuhan 430030)
Abstract On the basis of theprinciples and techniques of SDS- PAG electrophoresis, a new modified Gelatin-PAGE method, called as substance-ge lelectrophoresis, was introduced. This modified method can be used to determine the activity of matrix metalloproteinase whichhad capacity of digesting gelati n. This method decreased the concentration of gelatin mixed with PAG from 10 g/L to 2 g/L,and increased the molecular weight standard concentration to ≤40 μg /well. It is simple and practical.
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Keywords metalloproteinases; electrophoresis, polyacrylamide GEL
金属蛋白酶(metalloproteinase,MP)超家族成员的共同特点是它们的水解活性呈金属浓度依赖性。其中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)家族目前已鉴定出18名成员，可以各型胶原、明胶、纤维结合素、层连蛋白等为底物，其中MMP1、2、7、9、MT-MMP等还能以TNFα前体(Pro-TNFα)为底物[1]，在TNFα前体向成熟型转化中起关键作用[2]。MMP的基因表达水平和酶活性的高低与许多生理或病理过程及其恶性程度相关，如肿瘤转移、血管侵入、骨质疏松、合子植入、组织纤维化等[3，4]。因此,从方法学的角度,寻找简便实用的MMP底物水解活性的测定方法有重要的意义。本文介绍一种改良的明胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法(Gelatin-PAGE)[5]，简称底物胶电泳法，较好地解决了实验过程中所遇到的一些难题。
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1 材料与方法
1.1 材料
YYW-Ⅱ型垂直电泳槽和电泳仪(北京，六一仪器厂)，24或96孔培养板，培养瓶，CO2培养箱，超净工作台，震荡器等。
明胶(gelatin),国产或进口均可；SDS，Triton X-100，丙烯酰胺(Acr)及甲叉双丙烯酰胺 (Bis)等聚丙烯酰胺凝胶电泳所需的全部试剂(略)。
1.2 方法
1.2.1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：按常规方法进行或参见文献[6]。
1.2.2 Gelatin-PAGE的添加试剂：① 40 g/L 明胶储存液：37 ℃溶解，-20 ℃冰箱保存，或临用前新鲜配制；②匀浆缓冲液(buffer 1)：pH 7.0，20 mmol/L 的磷酸盐缓冲液 ，其中含 2.5 g/LTriton X-100和0.01 mol/L CaCl2；③悬浮缓冲液(buffer 2)： 0.01 mol/L CaCl2 、0.05 mol/L Tris.Cl、0.15 mol/L NaCl 溶于H2O中，用10 mol/L HCl 调节pH值至7.5；④ 洗脱缓冲液(buffer 3)：25 g/L TritonX-100、0.05 mol/L Tris.Cl也溶于H2O中，调节 pH 值至7.5；⑤ 底物缓冲液(buffer 4)：0.01 mol/LCaCl2 、0.05 mol/L Tris.Cl 、0.2 mol/L NaCl 、1.0 μmol/L ZnCl 2 溶于H2O中，用10 mol/LHCl调节pH值至7.5；⑥ Gelatin-PAG的制备(底物胶)：所有试剂,包括加样缓冲液、分离胶及浓缩胶配制、灌胶步骤、电泳条件等完全与常规SDS-PAGE相同,不作另述。Gelatin-PAG与PAG 制备的唯一区别是前者在配制分离胶的过程中加入 了终浓度为2～10g/L 的明胶,混合均匀后再行灌胶,凝固后即为Gelatin-PAG(底物胶)。本 实验中采用的分离胶浓度为100g/L，浓缩胶浓度为50 g/L。
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1.2.3 操作步骤：①样品制备: 收集离心沉淀的细胞或洗净的组织块,与buffer1按1∶1( V/W)的比例混合,置于冰上匀浆。在5000 r/min 离心5 min后，收集上清，沉淀继续用b uffer2等体积悬浮，充分混匀，再于5000 r/min 离心5 min，收集上清，并与第一次收集的上清混合。②加样和电泳：将上述含酶样品与不含β-巯基乙醇还原剂的上样缓冲液(loading buffer)混合，使混合液中所含SDS终浓度为20 g/L。混合液不用煮沸，而是在37 ℃放置 30min。同时制备浓缩胶和底物胶，凝固后，加样，在非还原条件下电泳。电泳条件同常规PAGE。③显色：电泳结束后，将凝胶取下，置buffer 3中，室温下浸泡2次，每次15 min，以除去凝胶中的SDS组分。然后，将胶置于底物缓冲液(buffer 4)中，于37 ℃浸泡12～24h，进行底物水解反应。然后用考马斯亮蓝R250 染色1～2 h，轻轻振摇,此时可见样品中含水解明胶能力MMP的条带呈现透明状。④分子质量鉴定：将底物胶中明胶的浓度从10 g/L 减 至2g/L，于各样品孔中分别加入不具水解明胶能力的中分子量蛋白标准品和待测样品。电泳后，用刀片将凝胶切成两半。含有分子质量标准蛋白的胶片不经洗脱，直接进行染色；另半块胶片则按照“③显色”中介绍的步骤进行，然后，将底物胶上呈蓝色的标准蛋白条带和透明的MMP条带进行比较。
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2 结果
2.1 明胶-底物胶电泳及染色后所显示的MMPs酶活性透明条带
我们收集了若干细胞或组织样品按方法1.2.3中所介绍的步骤进行电泳，图1的结果表示在明胶终浓度为10 g/L的底物胶上所获得的结果，深蓝色的背景上显示清晰可见的透明条带，说明该条带所代表的酶水解活性确是明胶特异性的，该酶可以是分泌至胞外的(图1A)，也可以是分泌前尚留在胞内的(图1B)。
图1 不同来源的样品经明胶-底物胶电泳及染色后所显示的透明条带
A：来自子宫生理盐水冲洗液标本。line 1为用药前，line 2为用药后； B： 黑 色素瘤标本。line 1 、 2、 3为肝转移之实体瘤的组织裂解液， line 4、5 来自培养的 黑色素瘤B7细胞系的裂解物
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2.2 明胶浓度对非明胶水解酶活性的蛋白质显带清晰度的影响
图2A为不含底物明胶的普通PAG电泳条带，经过考马斯亮蓝染色及脱色后，于透明的凝胶背景上呈现清晰的蓝色蛋白质条带；而图2B则为同一样品在含2g/L 明胶的底物胶-PAG电泳后，由于明胶也被蓝染，故洗脱后，呈现的是淡蓝色的凝胶背景。随着PAG中明胶浓度增加，凝胶背景的蓝色也逐步加深，会掩盖非明胶水解酶活性的蛋白质条带，正如图2C所示，同样浓度的BSA(牛血清白蛋白)条带完全被掩盖(10 g/L明胶浓度)。图2D说明加样量(BSA)对迁移率的影响，上述情况为确定能水解明胶的MMPs的分子质量带来困难，因为分子质量标准蛋白的条带将被深色背景掩盖。
2.3 LPS刺激前后大鼠腹腔巨噬细胞MMPs底物胶电泳酶谱之变化
为解决水解酶条带的分子质量确定的问题，我们设计了适当增加分子质量标准蛋白浓度和减低明胶终浓度，以及同次电泳、分别染色的方法(见方法部分)，较好地解决了问题。图3为LPS刺激前后大鼠腹腔巨噬细胞MMPs底物胶电泳的结果。图中A、B、C为同一底物胶电泳后，将胶纵切分样品胶(B、C)和分子质量Marker(A)胶，分别处理、染色后的电泳条带。A胶内明胶的浓度为2g/L，蛋白质分子质量标准的浓度为2mg/ml，加样20 μl。B胶由于比A胶多了几个反应步骤，故胶背景的蓝色浅于A胶。C胶为同一样品在含10 g/L 明胶 的底物胶-PAG电泳的结果，B与C胶中的条带变化完全相同。
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对照分子质量蛋白标准，从图3中可见随着LPS刺激时间的增加，巨噬细胞胞浆裂解物中 分子质量为9.2 ku的MMP9前体条带增强，分子质量为8.5 ku左右的成熟型MMP9的条带变弱(大部分已分泌至胞外)；而分子质量分别为7.2和6.8 ku的前体型和成熟型MMP7 的条带均比LPS刺激前减弱。
图2 不同明胶浓度对中分子质量标准蛋白显带的影响
A：为不含明胶的聚丙烯酰胺凝胶，透明的背景上显示BSA的深蓝条带； B： 在 含2 g/L明胶的底物胶中，背景变成蓝色，但BSA条带仍然可见； C：在10 g/L 明胶-底物胶中背景呈深蓝色，BSA条带完全被掩盖，无法辨认； D：样品孔中加入的BSA浓度增高至一定限度后(从右至左)，将引起电泳迁移率的改变
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图3 LPS刺激前后大鼠腹腔巨噬细胞MMP底物胶电泳酶谱之变化[ ZK)
图A、B为同一底物胶(含2 g/L 明胶)电泳后，将胶切开，样品胶和分子质量Marker胶分别处理、染色后的电泳条带。line 1、3、4 为BSA的条带，line 2 为中分子质量标准 蛋白的5条带，line 5为LPS刺激前，巨噬细胞MMP的酶谱，line 6为LPS刺激6 h的酶谱，li ne 7为LPS刺激12 h的酶谱。图C为在含10g/L明胶的底物胶中同一样品的电泳结果。各line 的含意同图B中所示。line 8 为LPS刺激12 h后，细胞的saline洗涤液中的条带。a: Pro- MMP9； b: Pro-MMP7
3 讨论
底物胶电泳技术对研究基质金属蛋白酶(MMP)的基因表达之差异、内源或外源性激活条件、酶活性的调节是十分有用的。目前已发现MMPs家族含18个成员，主要以明胶为 底物的有MMP7和MMP9。它们的前体激活方式有两种，一是水解一段前肽后被激活，另一种是自身所含的假底物抑制肽的作用解除后而被激活。因而我们能同时检测到MMP7和MMP9 的前体和成熟型的活性条带。
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我们在摸索实验条件的过程中，发现底物胶中明胶浓度是影响样品中MMP分子质量鉴定 的关键因素。由于明胶也能与染料结合，使底物胶全部染成蓝色；又由于底物胶电泳完毕后，还要经过去除Triton X-100及底物水解反应的孵育过程，也会导致将非酶活性的蛋白染色条带的色度减弱。因此，在同一浓度的底物胶中，将有明胶水解活性的MMP和无明胶水解活性的MMP两类蛋白条带均清晰地显示出来十分困难。为此，我们经反复摸索，将明胶浓度从1 0 g/L降到2 g/L，并将中分子质量蛋白标准的浓度增加到≥40 μg/孔(不能无限增加，否则迁移率要改变，见图2D)，获得满意的结果，解决了在同一块底物胶上同时显示中分子质 量蛋白标准和MMP条带的问题。另外也可以取已知分子质量的胶原酶为标准，同时与待测样品一起电泳，最终在透明条带之间进行分子质量的比较，但购买胶原酶价格较昂贵。
底物胶电泳时，除了加入明胶外，也可以加入酪蛋白等，以鉴定其它类型的MMPs，只要掌握上述标准，仍会得到满意的结果。
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由于底物胶电泳需要保持酶活性，因此上样缓冲液中切忌加入可破坏蛋白质亚基结构的 还原剂。
国家自然科学基金资助项目(No.39630320)
丁廷波,男,1973年生,硕士研究生
参 考 文 献
1，Gearing A J H, Beckettt P,Christodoulon M et al. Processing of tumour necrosis factor-α precursor by metalloproteinases. Nature, 1994,370:555
2，Mcgeehan G M, Becherer J D, Bast J R C et al. Regulation of t umour necrosisfactor-a processing by a metalloproteinase inhibitor. Nature, 1 994,370:558
, 百拇医药
3，方石岗.基质金属蛋白酶与肿瘤的侵袭和转移. 国外医学肿瘤学分册, 1996, 23 (suppl)：80
4，Swiderski R E, Dencoff J E, Hoerchinger C S et al. Differentia l expression of extracellular matrixremodeling genes in a murine model of ble omycin-induced pulmonary fibrosis. Am J Pathol, 1993, 152: 821
5，Unemori E N, Werb Z. Collagenase expression and endogenous activati on in rabbit synovial fibroblastsstimulated by the calcium ionophore A23187. J Bio Chem, 1998,263:16 252
6，SambrookJ, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning A labor atory manual. 2th ed. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. 880～887
(1999-04-13 收稿), 百拇医药