丙酮酸缺陷症研究现状
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中华血液学杂志
1999年第4期No.4 1999
丙酮酸缺陷症研究现状
潘竹林 闵碧荷 李津婴
关键词： 丙酮酸激酶缺陷症(PKD) 溶血 基因 错义突变
红细胞丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK.EC 2.7.1.40)是糖酵解途径中的3个关键酶之一。红细胞PK的遗传性缺陷可引起遗传性非球形红细胞溶血性贫血(hereditary non-spheroeytic hemolytic anemia,HNSHA)。自1961年Valentine等[1]首次报道丙酮酸激酶缺陷症(PKD)以来，至今已报道300多例。发病率在红细胞酶病中居第2位。它是糖酵解8种红细胞酶病中发现最早、最常见，且研究最深入的酶病。现就其研究近况综述如下。
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1 丙酮酸激酶同工酶及其分子遗传学
PK有4种同工酶：PKL，PKR，PKM1和PKM2。R型存在于红细胞中，据其电泳特性又分为R1和R2型；L型主要存在于肝脏、肾皮质及小肠；M1型存在于骨骼肌、心脏和脑组织；M2型存在于胎儿组织，也可见于肾脏、白细胞中。成熟红细胞中，PK同工酶的分布有明显差异。白细胞和血小板为M2型，原始及幼稚红细胞亦为M2型，而成熟红细胞为R型。因此认为，在红细胞成熟过程中，PK由M2型向R型转变[2]。R型迁移率不同于L型，但与L型在酶动力学和免疫学上相同,而与M1、M2型在酶动力学、电泳速率和免疫学特性上截然不同。目前认为，上述4种同工酶分别由两个独立的基因编码：PKLR基因和PKM基因。前者有12个外显子，转录时，在不同的启动子作用下，分别由第1、第2外显子启动转录R及L型mRNA[3]；后者产生M1和M2型PK。M1和M2型PK的差异是由于第9、第10外显子的不同[4]。人类PKLR基因位于1号染色体长臂2区1带(1q21)[5]；PKM基因位于15号染色体长臂2区2带(15q22)[6]。人类PKL的cDNA全长1 629个碱基，编码543个氨基酸；PKR的cDNA全长2 060个碱基，编码574个氨基酸[7]。
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2 PKD的溶血机制
PK的作用是将磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)的高能磷酸键转移给ADP产生ATP。它的活性减低就必然使ATP产生减少，这是溶血的基本原因。PK缺陷的网织红细胞主要利用线粒体氧化磷酸化来维持正常ATP水平。在脾脏氧分压低，红细胞氧化磷酸化受阻。网织红细胞有较大的粘着倾向，易在脾脏滞留，导致其ATP减少，进而Na.K+-ATP酶和钙泵功能障碍，使细胞膜僵硬，且引起细胞内K+脱出和脱水，形成致密浓缩的小球形红细胞及棘形细胞，不能从脾髓进入脾窦，以致被巨噬细胞吞噬，发生溶血。因而PKD的溶血特点是在脾脏选择性地破坏网织红细胞。亦有人证实，PKD红细胞中2,3-DPG浓度增加，抑制磷酸戊糖旁路的代谢活性，使红细胞抗氧化能力降低，进而引起或加重溶血。
3 PKD的分子生物学机制
目前大多数学者证明，PKD是结构基因突变产生性质异常的酶分子病。亦有人认为是巯基所致PK分子继发改变或原发性Mg2+-ATP酶缺乏所致的继发改变。现已发现的PK基因突变的数目达82种[8]，其中6种为剪切位点的突变，5种为碱基插入突变，8种为碱基缺失，5种是无意义突变，58种错义突变。由此可知，目前PK基因突变类型多为错义突变。而Lenzner等[9]在对12例PKD患者的基因序列分析中，发现突变位点多在5，8，9，11外显子处。PK结构基因的突变除产生终止密码而导致PK缺乏外，其引起单个氨基酸的改变而造成PK缺乏的因果关系尚未完全清楚。目前存在以下几种可能性：
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3.1 部分突变导致位于或接近PK酶活性中心的氨基酸发生改变，如丙氨酸336被丝氨酸替代后，改变了酶与PEP的亲和力，从而影响酶的活性[9]。
3.2 突变改变了酶与底物结合位点的氨基酸。Baronciani等[10]对30例PKD患者的基因突变分析中，993A和1022C的突变改变了位于酶A区β片层6和α折叠6的靠近结合位点的氨基酸。而464C突变则改变了位于A区β片层3的氨基酸。这些有可能导致突变位点附近的疏水性下降，从而影响K+与其位点的结合，导致PEP的Km值升高。
3.3 C区的少数突变，如精氨酸479被组氨酸替代后，影响了亚单位之间的相互作用及其变构调节，使酶的变构活性下降。亦有人认为，可能是精氨酸被替代后，影响了亚单位之间的盐桥，而后者在维持PK的完整性方面起着重要作用[9,10]。
, 百拇医药 3.4 部分突变位于赖氨酸313和谷氨酸315，此处为PK的酸基催化作用和镁结合的重要位置。此处氨基酸的改变，影响了酶的变构性，导致活性下降[11]。
3.5 Hitoshi等[11]和Lenzner等[9]发现某些患者PK活性降低是由于突变改变了外显子10的最后一个核苷酸，导致其5′端剪切位点碱基序列的变化，由C/AAGgta/gagt变为C/AAAgta/gagt。同时亦发现1436A可有相同的错义突变，但有不同的DNA多态性。亦有学者报道内含子A 3′端的剪切位点突变，但其具体机制尚未清楚。
4 PKD的诊断
本病表现为HNSHA，故诊断时首先要排除其他慢性溶血性贫血，如遗传性球形红细胞增多症、血红蛋白病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症等。目前临床常用测定PK活性的方法来诊断本病，但此法有很多缺陷，如操作时不能精确地去除白细胞、血小板，还受患者近期输血的影响等；而利用低浓度PEP测定PK活性，或查明体内有PEP、2,3-DPG积聚和ATP水平的降低等方法，操作复杂、代价昂贵。
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近年来，随着聚合酶链反应(PCR)技术应用的普及，基因诊断愈来愈广泛。目前国内外学者大多采用的方法为：①PCR结合单链构象多态性(PCR-SSCP)；②PCR联合限制性酶消化及序列特异性等位基因的寡核苷酸杂交法(ASO)，该法特别适于追踪家系患者及产前诊断；③PCR限制性片段长度多态性分析，用来分辨纯合子及杂合子；④逆转录PCR，观察PKLR基因转录的剪切是否变化[9-11]。
PCR不仅应用于PKD变异型的鉴别与诊断，而且也逐渐用于产前诊断。1994年Baronciani等[12]运用PCR和限制性核酸内切酶谱分析，在胎儿的羊水细胞中明确了其PK结构基因的DNA突变位点。
5 治疗
以前认为PKD的患者除沿用脾切除术和输血外，无特异性的治疗方法。脾切除后，虽然仍有溶血的证据，但多数患者的血红蛋白可上升10～30 g/L，从而减轻输血的不良反应。故脾切除多用于需要反复输血的患者，且手术时机多选择在学龄前后。亦有人用人重组红细胞生成素来治疗PKD患者[13]。近来随着分子生物学的发展，从基因水平治疗该病的可能性愈来愈大。1976年Weiden成功地用骨髓移植治愈了伴有严重溶血性贫血的PK缺陷症的狗。1994年Tani等[14]在体内和体外，分别用逆转录病毒载体将人的PKL cDNA导入鼠的骨髓造血干细胞。体外集落研究发现：人PKL cDNA转入鼠造血干细胞。体内试验表明：第30天，小鼠外周血细胞有人PKL mRNA的表达，但第60天和90天则无，第135天显示在小鼠各种造血器官有不同的人PKL mRNA表达，但不能确定其表达是否起源于逆转录病毒介导的多能造血干细胞。
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尽管目前PKD的基因治疗仅限于动物实验阶段，且存在较低的转导率。但由于PKD是单基因病变，因此从理论上讲，将正常人的PK基因导入患者的骨髓造血干细胞可以治愈本病。因而，随着基础医学的发展，PKD的基因治疗应用于临床也许只是个时间问题。
作者单位：潘竹林 闵碧荷 李津婴 200433 上海，第二军医大学长海医院血液科
参考文献
1 Valentine WN,Paglia DE.Pyruvate kinase and other enzyme deficiency disorders of the erythrocyte. In： Scriver CR,Beaudet AL,Sly WS, eds. The Metabolic Basis of Inherited Disease. New York: McGraw-Hill, 1989. 6：2341-2342.
, 百拇医药
2 Miwa S, Kanno H, Fujii H, et al.Pyruvate kinase deficiency:historical perspective and recent progress of molecular genetics. Am J Hematol,1993,42：31-35.
3 Noguchi T,Yamada K,Inoue H,et al. The L- and R-type isozymes of rat pyruvate kinase are produced from a single gene by use of different promoters. J Biol Chem, 1987,262：14366-14371.
4 Tanaka KR, Charles RZ. Red cell enzymopathics of the glycolytic pathway. Semin Hematol, 1990,27：165-185.
, 百拇医药
5 Tani K, Fujii H, Tsutsumi H, et al. Human liver type pyruvate kinase: cDNA cloning and chromosomal assignment.Biochem Biophys Res Commun, 1987,143：431-438.
6 Tani K,Michihiro CY, Satoh H, et al. Human M2-type pyruvate kinase cDNA cloning,chromosomal assignment and expressing in hepatoma. Gene, 1988,73：509-516.
7 Kanno H,Fujii H,Hirono A, et al. cDNA cloning of R-type pyruvate kinase (PK) and identification of single nucleotide substitution in PK variant (PK Tokyo) associated with hereditary hemolytic anemia. Blood, 1990,76：38-39.
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8 Baronciani L, Bianchi P, Zanella A. Hematologically important mutations: red cell pyruvate kinase. Blood Cells,Molecules Diseases, 1996,22：259-264.
9 Lenzner C,Nurnberg P,Thiele BJ,et al.Mutations in the pyruvate kinase L gene in patients with hereditary hemolytic anemia.Blood,1994,83：2817-2822.
10 Baronciani L,Beutler E. Molecular study of pyruvate kinase deficient patients with hereditary nonspherocytic hemolytic anemia. J Clin Invest, 1995,95：1702-1709.
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11 Kanno H,Wei DC,Chan LC, et al. Hereditary hemolytic anemia caused by diverse point mutations of pyruvate kinase gene found in Japan and Hong Kong. Blood, 1994,84：3505-3509.
12 Baronciani L,Beutler E. Prenatal diagnosis of pyruvate kinase deficiency. Blood, 1994,84：2354-2356.
13 Zachee P,Staal GEJ,Rijksen G,et al. Pyruvate kinase deficiency and delayed clinical response to recombinant human erythropoietic treatment.Lancet, 1989,8650：1327-1328.
14 Tani K, Yoshikubo T, Ikebuchi K,et al. Retrovirus-mediated gene transfer of human pyruvate kinase (PK) cDNA into murine hematopoietic cells: implications for gene therapy of human PK deficiency. Blood, 1994,83：2305-2310.
(收稿：1998-05-25 修回：1998-11-02)
(校对：王叶青), 百拇医药
丙酮酸缺陷症研究现状
潘竹林 闵碧荷 李津婴
关键词： 丙酮酸激酶缺陷症(PKD) 溶血 基因 错义突变
红细胞丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK.EC 2.7.1.40)是糖酵解途径中的3个关键酶之一。红细胞PK的遗传性缺陷可引起遗传性非球形红细胞溶血性贫血(hereditary non-spheroeytic hemolytic anemia,HNSHA)。自1961年Valentine等[1]首次报道丙酮酸激酶缺陷症(PKD)以来，至今已报道300多例。发病率在红细胞酶病中居第2位。它是糖酵解8种红细胞酶病中发现最早、最常见，且研究最深入的酶病。现就其研究近况综述如下。
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1 丙酮酸激酶同工酶及其分子遗传学
PK有4种同工酶：PKL，PKR，PKM1和PKM2。R型存在于红细胞中，据其电泳特性又分为R1和R2型；L型主要存在于肝脏、肾皮质及小肠；M1型存在于骨骼肌、心脏和脑组织；M2型存在于胎儿组织，也可见于肾脏、白细胞中。成熟红细胞中，PK同工酶的分布有明显差异。白细胞和血小板为M2型，原始及幼稚红细胞亦为M2型，而成熟红细胞为R型。因此认为，在红细胞成熟过程中，PK由M2型向R型转变[2]。R型迁移率不同于L型，但与L型在酶动力学和免疫学上相同,而与M1、M2型在酶动力学、电泳速率和免疫学特性上截然不同。目前认为，上述4种同工酶分别由两个独立的基因编码：PKLR基因和PKM基因。前者有12个外显子，转录时，在不同的启动子作用下，分别由第1、第2外显子启动转录R及L型mRNA[3]；后者产生M1和M2型PK。M1和M2型PK的差异是由于第9、第10外显子的不同[4]。人类PKLR基因位于1号染色体长臂2区1带(1q21)[5]；PKM基因位于15号染色体长臂2区2带(15q22)[6]。人类PKL的cDNA全长1 629个碱基，编码543个氨基酸；PKR的cDNA全长2 060个碱基，编码574个氨基酸[7]。
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2 PKD的溶血机制
PK的作用是将磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)的高能磷酸键转移给ADP产生ATP。它的活性减低就必然使ATP产生减少，这是溶血的基本原因。PK缺陷的网织红细胞主要利用线粒体氧化磷酸化来维持正常ATP水平。在脾脏氧分压低，红细胞氧化磷酸化受阻。网织红细胞有较大的粘着倾向，易在脾脏滞留，导致其ATP减少，进而Na.K+-ATP酶和钙泵功能障碍，使细胞膜僵硬，且引起细胞内K+脱出和脱水，形成致密浓缩的小球形红细胞及棘形细胞，不能从脾髓进入脾窦，以致被巨噬细胞吞噬，发生溶血。因而PKD的溶血特点是在脾脏选择性地破坏网织红细胞。亦有人证实，PKD红细胞中2,3-DPG浓度增加，抑制磷酸戊糖旁路的代谢活性，使红细胞抗氧化能力降低，进而引起或加重溶血。
3 PKD的分子生物学机制
目前大多数学者证明，PKD是结构基因突变产生性质异常的酶分子病。亦有人认为是巯基所致PK分子继发改变或原发性Mg2+-ATP酶缺乏所致的继发改变。现已发现的PK基因突变的数目达82种[8]，其中6种为剪切位点的突变，5种为碱基插入突变，8种为碱基缺失，5种是无意义突变，58种错义突变。由此可知，目前PK基因突变类型多为错义突变。而Lenzner等[9]在对12例PKD患者的基因序列分析中，发现突变位点多在5，8，9，11外显子处。PK结构基因的突变除产生终止密码而导致PK缺乏外，其引起单个氨基酸的改变而造成PK缺乏的因果关系尚未完全清楚。目前存在以下几种可能性：
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3.1 部分突变导致位于或接近PK酶活性中心的氨基酸发生改变，如丙氨酸336被丝氨酸替代后，改变了酶与PEP的亲和力，从而影响酶的活性[9]。
3.2 突变改变了酶与底物结合位点的氨基酸。Baronciani等[10]对30例PKD患者的基因突变分析中，993A和1022C的突变改变了位于酶A区β片层6和α折叠6的靠近结合位点的氨基酸。而464C突变则改变了位于A区β片层3的氨基酸。这些有可能导致突变位点附近的疏水性下降，从而影响K+与其位点的结合，导致PEP的Km值升高。
3.3 C区的少数突变，如精氨酸479被组氨酸替代后，影响了亚单位之间的相互作用及其变构调节，使酶的变构活性下降。亦有人认为，可能是精氨酸被替代后，影响了亚单位之间的盐桥，而后者在维持PK的完整性方面起着重要作用[9,10]。
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3.5 Hitoshi等[11]和Lenzner等[9]发现某些患者PK活性降低是由于突变改变了外显子10的最后一个核苷酸，导致其5′端剪切位点碱基序列的变化，由C/AAGgta/gagt变为C/AAAgta/gagt。同时亦发现1436A可有相同的错义突变，但有不同的DNA多态性。亦有学者报道内含子A 3′端的剪切位点突变，但其具体机制尚未清楚。
4 PKD的诊断
本病表现为HNSHA，故诊断时首先要排除其他慢性溶血性贫血，如遗传性球形红细胞增多症、血红蛋白病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症等。目前临床常用测定PK活性的方法来诊断本病，但此法有很多缺陷，如操作时不能精确地去除白细胞、血小板，还受患者近期输血的影响等；而利用低浓度PEP测定PK活性，或查明体内有PEP、2,3-DPG积聚和ATP水平的降低等方法，操作复杂、代价昂贵。
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近年来，随着聚合酶链反应(PCR)技术应用的普及，基因诊断愈来愈广泛。目前国内外学者大多采用的方法为：①PCR结合单链构象多态性(PCR-SSCP)；②PCR联合限制性酶消化及序列特异性等位基因的寡核苷酸杂交法(ASO)，该法特别适于追踪家系患者及产前诊断；③PCR限制性片段长度多态性分析，用来分辨纯合子及杂合子；④逆转录PCR，观察PKLR基因转录的剪切是否变化[9-11]。
PCR不仅应用于PKD变异型的鉴别与诊断，而且也逐渐用于产前诊断。1994年Baronciani等[12]运用PCR和限制性核酸内切酶谱分析，在胎儿的羊水细胞中明确了其PK结构基因的DNA突变位点。
5 治疗
以前认为PKD的患者除沿用脾切除术和输血外，无特异性的治疗方法。脾切除后，虽然仍有溶血的证据，但多数患者的血红蛋白可上升10～30 g/L，从而减轻输血的不良反应。故脾切除多用于需要反复输血的患者，且手术时机多选择在学龄前后。亦有人用人重组红细胞生成素来治疗PKD患者[13]。近来随着分子生物学的发展，从基因水平治疗该病的可能性愈来愈大。1976年Weiden成功地用骨髓移植治愈了伴有严重溶血性贫血的PK缺陷症的狗。1994年Tani等[14]在体内和体外，分别用逆转录病毒载体将人的PKL cDNA导入鼠的骨髓造血干细胞。体外集落研究发现：人PKL cDNA转入鼠造血干细胞。体内试验表明：第30天，小鼠外周血细胞有人PKL mRNA的表达，但第60天和90天则无，第135天显示在小鼠各种造血器官有不同的人PKL mRNA表达，但不能确定其表达是否起源于逆转录病毒介导的多能造血干细胞。
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尽管目前PKD的基因治疗仅限于动物实验阶段，且存在较低的转导率。但由于PKD是单基因病变，因此从理论上讲，将正常人的PK基因导入患者的骨髓造血干细胞可以治愈本病。因而，随着基础医学的发展，PKD的基因治疗应用于临床也许只是个时间问题。
作者单位：潘竹林 闵碧荷 李津婴 200433 上海，第二军医大学长海医院血液科
参考文献
1 Valentine WN,Paglia DE.Pyruvate kinase and other enzyme deficiency disorders of the erythrocyte. In： Scriver CR,Beaudet AL,Sly WS, eds. The Metabolic Basis of Inherited Disease. New York: McGraw-Hill, 1989. 6：2341-2342.
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2 Miwa S, Kanno H, Fujii H, et al.Pyruvate kinase deficiency:historical perspective and recent progress of molecular genetics. Am J Hematol,1993,42：31-35.
3 Noguchi T,Yamada K,Inoue H,et al. The L- and R-type isozymes of rat pyruvate kinase are produced from a single gene by use of different promoters. J Biol Chem, 1987,262：14366-14371.
4 Tanaka KR, Charles RZ. Red cell enzymopathics of the glycolytic pathway. Semin Hematol, 1990,27：165-185.
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5 Tani K, Fujii H, Tsutsumi H, et al. Human liver type pyruvate kinase: cDNA cloning and chromosomal assignment.Biochem Biophys Res Commun, 1987,143：431-438.
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7 Kanno H,Fujii H,Hirono A, et al. cDNA cloning of R-type pyruvate kinase (PK) and identification of single nucleotide substitution in PK variant (PK Tokyo) associated with hereditary hemolytic anemia. Blood, 1990,76：38-39.
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8 Baronciani L, Bianchi P, Zanella A. Hematologically important mutations: red cell pyruvate kinase. Blood Cells,Molecules Diseases, 1996,22：259-264.
9 Lenzner C,Nurnberg P,Thiele BJ,et al.Mutations in the pyruvate kinase L gene in patients with hereditary hemolytic anemia.Blood,1994,83：2817-2822.
10 Baronciani L,Beutler E. Molecular study of pyruvate kinase deficient patients with hereditary nonspherocytic hemolytic anemia. J Clin Invest, 1995,95：1702-1709.
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11 Kanno H,Wei DC,Chan LC, et al. Hereditary hemolytic anemia caused by diverse point mutations of pyruvate kinase gene found in Japan and Hong Kong. Blood, 1994,84：3505-3509.
12 Baronciani L,Beutler E. Prenatal diagnosis of pyruvate kinase deficiency. Blood, 1994,84：2354-2356.
13 Zachee P,Staal GEJ,Rijksen G,et al. Pyruvate kinase deficiency and delayed clinical response to recombinant human erythropoietic treatment.Lancet, 1989,8650：1327-1328.
14 Tani K, Yoshikubo T, Ikebuchi K,et al. Retrovirus-mediated gene transfer of human pyruvate kinase (PK) cDNA into murine hematopoietic cells: implications for gene therapy of human PK deficiency. Blood, 1994,83：2305-2310.
(收稿：1998-05-25 修回：1998-11-02)
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