体外培养与扩增对脐血CD34＋细胞及HLA抗原表达的影响
作者：胡丽华 余忠清 张青 乐道利 韩敏
单位：同济医科大学附属协和医院输血科，武汉 430022
关键词：胎血；细胞，培养的；扩增；CD34+细胞；HLA抗原
同济医科大学学报000111 摘要 采用免疫组织化学方法，观察脐血细胞体外培养与扩增前后CD34+细胞的比例以及HLA抗原的表达。结果表明：脐血CD34+细胞的百分比以及HLA抗原的表达于体外培养前后无显著性变化(P>0.05)，而在细胞因子的联合作用下，经一定时间的扩增后，CD34+细胞百分比下降(P<0.01)，HLA抗原的表达有一定程度的提高。提示：体外扩增对脐血CD34 +细胞的比例以及HLA抗原的表达有一定的影响，而未加细胞因子的体外直接培养则不产生明 显影响。
, 百拇医药
中图法分类号 R331.1， R329， R391.11
Effect of Cultivation and Expansion i n Vitro on CD34+Cells
and HLA Antigen Expression of Umbilical Cord Blood
Hu Lihua YuZhongqing Zhang Qing et al
(Department of Blood Transfusion, XieheHospital,Tongji Medical University, Wuhan 430022)
Abstract Theexpression of HLA antigen of umbilical cord blood (UCB) and th e variations of rate of CD34+ cells before and aftercultivation in vit ro and expansion were observed by using immunohistochemical mothed (APAAP). The results showed thatthe HLA antigen expression of UCB and the rate of CD34 + cells had no change before and after culture in vitro(P>0.05). But the HLA antigen expression of UCB was increased and the rate of CD34+ cells was deceased(P<0.01), after expanded by adding cytokines and HLA ant igen expression was elevated to some extent. It wassuggested that the expansion in vitro has an influnce on biology of UCB, but cultivation alone has no influn ce on it.
, 百拇医药
Key words fetal blood; cells, cultured; expansion; CD34+ cell; HLA antigen
脐血干细胞移植正在引起人们的关注[1]。它不仅被认为在某种意义上可以代替，甚至在许多方面更优于骨髓干细胞移植。但是，由于每一份脐血所提供的干细胞数量有限，尚难以满足成人移植的要求。因此，人们正在探索体外扩增的方法以增加干细胞的数量[2]。这些体外处理是否会对脐血细胞的生物学特征产生影响，对此，我们于1998年3月至1999年6月进行实验，作了一些探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1脐血：取自健康、足月、自然分娩的新生儿。
, 百拇医药 1.1.2 试剂：RPMI1640、小牛血清为Gibco公司产品。IL-3、 GM-CSF为Sigma公司产品。anti-CD34+MoAb，anti-HLA-I MoAb， anti-HLA DR MoAb， anti-HLA DP MoAb，兔抗鼠IgG，鼠APAAP复合物，坚固红均为DaKo公司产品 。
1.2 方法
1.2.1脐血单个核细胞的制备与培养：按照本实验常规方法进行。
1.2.2 脐血细胞的体外扩增：在常规培养体系中加入IL-3、GM-CSF。分别进行液体及半固体培养。于不同时间后进行有关HLA抗原表达以及CD34+细胞的免疫组织化学分析。并观察脐血细胞的扩增结果。
1.2.3 免疫组织化学分析：采用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP法)。将细胞悬液离心涂片，室温干燥，以纯丙酮室温下固定5 min，空气干燥5 min。然后，依次加一抗(MoAb)、二抗(兔抗鼠IgG)及三抗(鼠APAAP复合物)各25 μl，37℃，湿盒内孵育30 min，重复二抗、 三抗各15min。最后，滴加 底物显色液，孵育15～20 min后，低倍镜下观察反应情况，见有细胞红染即可终止反应，封片，显微镜下计数阳性细胞的比例。以细胞膜或胞浆红染为阳性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 脐血细胞的体外扩增结果
脐血细胞在含有IL-3，GM-CSF的培养体系中，经7～14 d可大量扩增，扩增结果见图1。
2.2 脐血CD34+细胞的比例，HLA抗原的表达
脐血CD34+细胞在单个核细胞中的比例为(3.14±1.06) %，HLA抗原的表达(HLA-Ⅰ+、HLA-DR+、HLA-DP+)见表1。2.3 体外培养与扩增对CD34+细胞比例以及HLA抗原表达的影响
结果见表1。从表中可见，单纯的体外培养对CD34+细胞比例及HLA抗原的表达无明显影响(P>0.05)；但扩增后，CD34+细胞百分比下降(P<0.01)，HLA抗原表达有一定程度的提高。
, 百拇医药
图1 脐血细胞的体外扩增结果
表1 体外培养前后及扩增对CD34+细胞比例及HLA抗原表达的影响(
±s) 指 标
n
培养及扩增前
培养第7 d
扩增时间(d)
7
10
14
CD34+细胞比例(%)
, 百拇医药
7
3.14±1.06
3.07±1.35
1.36±0.80
0.86±0.37
0.11±0.10
HLA-Ⅰ+(%)
7
81.43±8.75
81.14±8.24
84.29±8.53
, 百拇医药
85.14±8.51
88.29±7.13
HLA-DR+(%)
7
17.57±5.10
17.71±5.01
20.71±4.00
21.57±5.18
23.57±6.46
HLA-DP+(%)
7
, 百拇医药
15.43±5.58
15.29±5.65
19.79±4.02
19.86±6.11
20.43±5.32
与培养及扩增前比较 P<0.05 P<0.01 3 讨论
正当骨髓移植由于髓源短缺而遭困境时，脐血干细胞移植的成功给这一领域带来一线希望之光[3]。脐血细胞由于其来源丰富，较少见骨髓移植时常见的感染因素，如巨细胞病毒感染，同时易于获取与制备，对供者无任何不良影响 [4]，尤其是其免疫系统的发育还不成熟，处于一种缄默状态，T细胞也很幼弱(muted i mmune system,naiveT cells)，一般不会触发免疫反应及移植抗宿主病(GVHD)[5]等诸多特点而被视为替代骨髓移植的造血干细胞的理想来源。
, 百拇医药
但是，由于每份脐血所能提供的干细胞的数量有限，直接应用难以满足成人移植的需要。目前大多通过体外扩增处理以增加干细胞的数量。从理论上讲，造血干细胞在体内具有至少两方面的能力，也可以说，在体内至少同时经历两种事件。一是自我更新，以产生造血干细胞来补充由于分化成熟而损失的那部分造血干细胞成分，维持数量的恒定；二是增殖分化，产生具有多种定向分化潜能的祖细胞，祖细胞再定向分化成各种亚类，最后形成表达各种细胞类型终末标记的单系列细胞。造血干细胞在体内的自我复制与分化成熟的调节是相当复杂的[6]。那么，在体外扩增条件下，能否模拟体内的条件，使得造血干细胞在增殖、分化的同时，自我复制，以维持，甚至增加干细胞的数量呢?如果不能，则扩增便失去意义，因为骨髓(或脐血)移植从本质上讲是干细胞移植[7]。
本实验通过对体外培养及扩增对CD34+细胞的比例变化观察，显示单纯的体外培养对CD34+细胞的比例无明显影响，但经体外扩增CD34+细胞在百分比上有所下降。由于扩增时，细胞在数量上增加了上百倍，如果按绝对值计，CD34+细胞是增加而不是减少。不过CD34+细胞并不完全代表造血干细胞，许多定向祖细胞也带有CD34+标记。可见，更深入的检测分析多种抗原分化标志有利于更准确地认识造血干细胞比例及数量的变化。这方面的工作有待进一步探讨。
, http://www.100md.com
另一方面，脐血干细胞的HLA，抗原表达比骨髓及外周血干细胞为低。这也是其移植后较少引起免疫反应的原因之一[5]。那么，体外处理能否对其产生影响呢，本文的结果显示，短期的体外培养影响不显著，但经大量的细胞因子联合作用，体外扩增后HLA-Ⅰ+、HLA-DR+以及HLA-DP+均有一定程度的提高。提示，体外扩增对脐血干细胞HLA抗原的表达产生影响，考虑可能与多种细胞因子及血清成分的复杂影响有关。
综上所述，体外扩增可使CD34+细胞的百分比有所下降，尽管推算绝对数无下降，但亦无显著增加。同时，体外扩增可使HLA抗原表达有一定程度提高。以上结论提示，采用目前的扩增体系对脐血干细胞的扩增处理意义不肯定。真正的干细胞扩增有待深入认识造血干细胞的自我复制与分化调控机制，建立更合理的培养体系。
胡丽华，女，1952年出生，副教授
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Thompson C. Umbilical cord:turninggarbage into clinical gold. Scien ce,1995,268:805
2，Broxmeyer H E,Hangoc G, Cooper S etal. Growth charact eristics and expansion of human umbilical cord blood and estimation of its poten tial for transplantation inadults. Proc Natl Acag Sci USA,1992,89:4109
3，Broxmeyer H E, Douglas G W,Hangoc G etal. Human umbili cal cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progen itor cells. Proc NatlAcad Sci USA,1989,86:3828
, http://www.100md.com
4，Rubinstein P, Rosenfield R E,Adamson J W et al. Stored placental blood for unrelated bone marrow reconstitution. Blood,1993,81:1679
5，Roncarolo M G,Bigler M, Martino S et al. Immune functi ons of cord blood cells before and after transplantation. JHematother,1996,5:15 7
6，Orkin S H. Transcription factors and hematopoietic development. J Bi olChem,1995,270:4955
7，Emerson G E. EX vivo expansion of hematopoietic precusor, progenitors,and stem cells:the next generation of cellular therapeutics. Blood,1996,87:308 2
(1999-09-14 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院输血科，武汉 430022
关键词：胎血；细胞，培养的；扩增；CD34+细胞；HLA抗原
同济医科大学学报000111 摘要 采用免疫组织化学方法，观察脐血细胞体外培养与扩增前后CD34+细胞的比例以及HLA抗原的表达。结果表明：脐血CD34+细胞的百分比以及HLA抗原的表达于体外培养前后无显著性变化(P>0.05)，而在细胞因子的联合作用下，经一定时间的扩增后，CD34+细胞百分比下降(P<0.01)，HLA抗原的表达有一定程度的提高。提示：体外扩增对脐血CD34 +细胞的比例以及HLA抗原的表达有一定的影响，而未加细胞因子的体外直接培养则不产生明 显影响。
, 百拇医药
中图法分类号 R331.1， R329， R391.11
Effect of Cultivation and Expansion i n Vitro on CD34+Cells
and HLA Antigen Expression of Umbilical Cord Blood
Hu Lihua YuZhongqing Zhang Qing et al
(Department of Blood Transfusion, XieheHospital,Tongji Medical University, Wuhan 430022)
Abstract Theexpression of HLA antigen of umbilical cord blood (UCB) and th e variations of rate of CD34+ cells before and aftercultivation in vit ro and expansion were observed by using immunohistochemical mothed (APAAP). The results showed thatthe HLA antigen expression of UCB and the rate of CD34 + cells had no change before and after culture in vitro(P>0.05). But the HLA antigen expression of UCB was increased and the rate of CD34+ cells was deceased(P<0.01), after expanded by adding cytokines and HLA ant igen expression was elevated to some extent. It wassuggested that the expansion in vitro has an influnce on biology of UCB, but cultivation alone has no influn ce on it.
, 百拇医药
Key words fetal blood; cells, cultured; expansion; CD34+ cell; HLA antigen
脐血干细胞移植正在引起人们的关注[1]。它不仅被认为在某种意义上可以代替，甚至在许多方面更优于骨髓干细胞移植。但是，由于每一份脐血所提供的干细胞数量有限，尚难以满足成人移植的要求。因此，人们正在探索体外扩增的方法以增加干细胞的数量[2]。这些体外处理是否会对脐血细胞的生物学特征产生影响，对此，我们于1998年3月至1999年6月进行实验，作了一些探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1脐血：取自健康、足月、自然分娩的新生儿。
, 百拇医药 1.1.2 试剂：RPMI1640、小牛血清为Gibco公司产品。IL-3、 GM-CSF为Sigma公司产品。anti-CD34+MoAb，anti-HLA-I MoAb， anti-HLA DR MoAb， anti-HLA DP MoAb，兔抗鼠IgG，鼠APAAP复合物，坚固红均为DaKo公司产品 。
1.2 方法
1.2.1脐血单个核细胞的制备与培养：按照本实验常规方法进行。
1.2.2 脐血细胞的体外扩增：在常规培养体系中加入IL-3、GM-CSF。分别进行液体及半固体培养。于不同时间后进行有关HLA抗原表达以及CD34+细胞的免疫组织化学分析。并观察脐血细胞的扩增结果。
1.2.3 免疫组织化学分析：采用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP法)。将细胞悬液离心涂片，室温干燥，以纯丙酮室温下固定5 min，空气干燥5 min。然后，依次加一抗(MoAb)、二抗(兔抗鼠IgG)及三抗(鼠APAAP复合物)各25 μl，37℃，湿盒内孵育30 min，重复二抗、 三抗各15min。最后，滴加 底物显色液，孵育15～20 min后，低倍镜下观察反应情况，见有细胞红染即可终止反应，封片，显微镜下计数阳性细胞的比例。以细胞膜或胞浆红染为阳性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 脐血细胞的体外扩增结果
脐血细胞在含有IL-3，GM-CSF的培养体系中，经7～14 d可大量扩增，扩增结果见图1。
2.2 脐血CD34+细胞的比例，HLA抗原的表达
脐血CD34+细胞在单个核细胞中的比例为(3.14±1.06) %，HLA抗原的表达(HLA-Ⅰ+、HLA-DR+、HLA-DP+)见表1。2.3 体外培养与扩增对CD34+细胞比例以及HLA抗原表达的影响
结果见表1。从表中可见，单纯的体外培养对CD34+细胞比例及HLA抗原的表达无明显影响(P>0.05)；但扩增后，CD34+细胞百分比下降(P<0.01)，HLA抗原表达有一定程度的提高。
, 百拇医药
图1 脐血细胞的体外扩增结果
表1 体外培养前后及扩增对CD34+细胞比例及HLA抗原表达的影响(
±s) 指 标n
培养及扩增前
培养第7 d
扩增时间(d)
7
10
14
CD34+细胞比例(%)
, 百拇医药
7
3.14±1.06
3.07±1.35
1.36±0.80
0.86±0.37
0.11±0.10
HLA-Ⅰ+(%)
7
81.43±8.75
81.14±8.24
84.29±8.53
, 百拇医药
85.14±8.51
88.29±7.13
HLA-DR+(%)
7
17.57±5.10
17.71±5.01
20.71±4.00
21.57±5.18
23.57±6.46
HLA-DP+(%)
7
, 百拇医药
15.43±5.58
15.29±5.65
19.79±4.02
19.86±6.11
20.43±5.32
与培养及扩增前比较 P<0.05 P<0.01 3 讨论
正当骨髓移植由于髓源短缺而遭困境时，脐血干细胞移植的成功给这一领域带来一线希望之光[3]。脐血细胞由于其来源丰富，较少见骨髓移植时常见的感染因素，如巨细胞病毒感染，同时易于获取与制备，对供者无任何不良影响 [4]，尤其是其免疫系统的发育还不成熟，处于一种缄默状态，T细胞也很幼弱(muted i mmune system,naiveT cells)，一般不会触发免疫反应及移植抗宿主病(GVHD)[5]等诸多特点而被视为替代骨髓移植的造血干细胞的理想来源。
, 百拇医药
但是，由于每份脐血所能提供的干细胞的数量有限，直接应用难以满足成人移植的需要。目前大多通过体外扩增处理以增加干细胞的数量。从理论上讲，造血干细胞在体内具有至少两方面的能力，也可以说，在体内至少同时经历两种事件。一是自我更新，以产生造血干细胞来补充由于分化成熟而损失的那部分造血干细胞成分，维持数量的恒定；二是增殖分化，产生具有多种定向分化潜能的祖细胞，祖细胞再定向分化成各种亚类，最后形成表达各种细胞类型终末标记的单系列细胞。造血干细胞在体内的自我复制与分化成熟的调节是相当复杂的[6]。那么，在体外扩增条件下，能否模拟体内的条件，使得造血干细胞在增殖、分化的同时，自我复制，以维持，甚至增加干细胞的数量呢?如果不能，则扩增便失去意义，因为骨髓(或脐血)移植从本质上讲是干细胞移植[7]。
本实验通过对体外培养及扩增对CD34+细胞的比例变化观察，显示单纯的体外培养对CD34+细胞的比例无明显影响，但经体外扩增CD34+细胞在百分比上有所下降。由于扩增时，细胞在数量上增加了上百倍，如果按绝对值计，CD34+细胞是增加而不是减少。不过CD34+细胞并不完全代表造血干细胞，许多定向祖细胞也带有CD34+标记。可见，更深入的检测分析多种抗原分化标志有利于更准确地认识造血干细胞比例及数量的变化。这方面的工作有待进一步探讨。
, http://www.100md.com
另一方面，脐血干细胞的HLA，抗原表达比骨髓及外周血干细胞为低。这也是其移植后较少引起免疫反应的原因之一[5]。那么，体外处理能否对其产生影响呢，本文的结果显示，短期的体外培养影响不显著，但经大量的细胞因子联合作用，体外扩增后HLA-Ⅰ+、HLA-DR+以及HLA-DP+均有一定程度的提高。提示，体外扩增对脐血干细胞HLA抗原的表达产生影响，考虑可能与多种细胞因子及血清成分的复杂影响有关。
综上所述，体外扩增可使CD34+细胞的百分比有所下降，尽管推算绝对数无下降，但亦无显著增加。同时，体外扩增可使HLA抗原表达有一定程度提高。以上结论提示，采用目前的扩增体系对脐血干细胞的扩增处理意义不肯定。真正的干细胞扩增有待深入认识造血干细胞的自我复制与分化调控机制，建立更合理的培养体系。
胡丽华，女，1952年出生，副教授
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Thompson C. Umbilical cord:turninggarbage into clinical gold. Scien ce,1995,268:805
2，Broxmeyer H E,Hangoc G, Cooper S etal. Growth charact eristics and expansion of human umbilical cord blood and estimation of its poten tial for transplantation inadults. Proc Natl Acag Sci USA,1992,89:4109
3，Broxmeyer H E, Douglas G W,Hangoc G etal. Human umbili cal cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progen itor cells. Proc NatlAcad Sci USA,1989,86:3828
, http://www.100md.com
4，Rubinstein P, Rosenfield R E,Adamson J W et al. Stored placental blood for unrelated bone marrow reconstitution. Blood,1993,81:1679
5，Roncarolo M G,Bigler M, Martino S et al. Immune functi ons of cord blood cells before and after transplantation. JHematother,1996,5:15 7
6，Orkin S H. Transcription factors and hematopoietic development. J Bi olChem,1995,270:4955
7，Emerson G E. EX vivo expansion of hematopoietic precusor, progenitors,and stem cells:the next generation of cellular therapeutics. Blood,1996,87:308 2
(1999-09-14 收稿), 百拇医药