BCL-XL异质性表达与复发急性髓性白血病细胞体外生长类型的关系
作者：何明生 陈燕 李慧玉 吴裕丹
单位：同济医科大学附属协和医院血液病研究所，武汉 430022
关键词：白血病，髓细胞性，急性；BCL-XL基因；细胞生长
同济医科大学学报000108 摘要 选择15例复发急性髓性白血病(AML)患者，研究BCL-XL的异质性表达与复发AML细胞体外生长类型的关系。用白血病祖细胞培养(CFU-L)判断生长类型，RT-PCR方法检测BCL-XL mRNA的表达丰度。结果：CFU-L检测中，10 例为生长型，其BCL-XL mRNA 9例高表达，1例为低表达；CFU-L检测5例为不生长型，BCL-X LmRNA均为低表达( P<0.01)。在复发AML中，BCL-XL mRNA的高表达与其细胞体外生长类型有关，提示与其细胞的自分泌生长有关，可以作为复发AML再生耐药的一个判断指标 。
, 百拇医药 中图法分类号 R733.7， Q343.1
Association of Cell Growth Modalities in vitro with Its Heterogenous
Expression of BCL-XL in Relapsed Acute Myelogenous Leuke mic Cells
HeMingsheng Chen Yan Li Huiyu et al
(Institute of Hematology, Xiehe Hospital,Tongji Medica l University, Wuhan 430022)
Abstract To elucidatethe relationship between cell growth type s in vitro and its heterogenous expression of BCL-XL in relapsed acute myeloidleukemic (AML) cells, 15 patients with relapsed AML were investigated. The cell growth type in vitro was detected byusing CFU-1, and the expression of BC L-XL by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The results showed that 9 cases but one whose BCL-XL mRNA was highly expr essed were of cell growth types invitro and the remaining 5 cases whose BCL-X L mRNA was low expressed were not (P<0.01). Overexpression ofBCL-XL was closely associated with cell growth types in vitro which might result from its autocrine growth, indicating thatBCL-XL, when highly expressed, might be used as a marker of a regrowth drug-resistant phenotype for the recurrence inAM L.
, 百拇医药
Key words leukemia, myelogenous, acute; BCL-XL gene; cell gr owth
耐药急性髓性白血病(AML)包括难治AML和复发AML两种。研究表明，AML细胞具有自分泌生长因子的特点，在体外则有不依赖细胞生长因子生长形成集落的特点，尤其在复发AML细胞表现更为明显，这一特点与AML细胞的耐药机制形成有关[1]。BCL-XL是BCL-2基因家族的成员之一，具有抗凋亡的功能，并可保护细胞周期中各期细胞的存活从而参与多种耐药表型的形成[2]。此外，BCL-XL在AML细胞中的表达有明显的异质性[3]，而且这种表达水平在某种程度上有依赖细胞生长因子的特征[4]。我们已经研究过BCL-XL在AML细胞上的表达与其化疗敏感性有关，但BCL-XL与AML细胞耐药的关系仍不十分清楚。为进一步阐明BCL-XL与AML细胞耐药的关系，我们选择了与细胞生长因子关系较为密切的复发AML进行研究。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 病例选择
选择15例复发AML，男10例，女5例，年龄24～62岁，均为我院经临床、细胞形态学、细胞化学和免疫学分型确诊，曾接受DA(柔红霉素+阿糖胞苷)方案诱导缓解，取得完全缓解(C R)，随后复发。复发标准参照国内标准[5]。复发时外周血白细胞计数大于4×109/L，均取化疗前外周血5 ml检测，梯度离心后细胞涂片白血病细胞≥90%。
1.2 主要试剂
RPMI1640、TRIZol总RNA提取试剂盒和SUPERSCRIPT ONE-STEPRT-PCR试剂盒均为美国GIBco-BRL公司产品。
1.3 白血病祖细胞(CFU-L)检测
, http://www.100md.com
1ml总体系含2×105细胞,1 ml/L植物凝集素,200 ml/L胎牛血清,8 g/L甲基纤维素,25 mg/L青霉素,25mg/L链霉素,用RPMI 1640补至1 ml后混匀置入无菌的96孔培养板中,每孔2 00 μl,作3个复孔，37 ℃，5%CO2饱和湿度培养7 d，倒置显微镜下计数集落。CFU-L判断标准为:≥40个细胞为集落生长，反之为不生长。
1.4 总RNA提取
取5～106白血病细胞，用TRIZol总RNA提取试剂盒提取总RNA，方法按厂方说明书进行。提取的RNA用美国法玛西亚产DNA和RNA检测仪定量，保存于-70 ℃备用。
1.5 半定量RT-PCR检测BCL-XL mRNA表达丰度
引物序列参照文献[6]，由上海生物工程公司合成。BCL-X引物：5′-TTG GAC AAT GGA CTG GTTGA-3′和3′-GTA GAG TGG ATG GTC AGT G-5′。 这对引物可同时扩增BCL-XL和BCL-XS两种基因产物。对照为β2微球蛋白(β2M)，其引物为：5′-ACC CCC A CT GAAAAA GAT GA-3′和3′-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-5′。用RT-PCR试剂盒扩增，方法按说明书进行。反应总体积为50 μl，总RNA模板为1 μg，引物各为20 pmol，在试剂盒中另加入RNA酶抑制剂25 U。用美国产PE-2400型PCR扩增仪扩增，其条件为①cDNA合成和预变性：50 ℃ 60 min和94 ℃ 2 min；②PCR扩增35个循环：变性94 ℃ 30 s，退 火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃1 min，最后一轮延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存产物。对照样本 在相同条件下扩增β2M。
, 百拇医药
取RT-PCR产物10 μl用15 g/L琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙锭)电泳,电泳结束后在紫外灯下观察结果并照像。产物BCL-XL约为800 bp，β2M为114bp。用HPLAS-1000高清晰度彩色病理分析系统扫描底片，用积分光度比值表示BCL-XLmRNA表达丰度，计算BCL-XL积分光度与β2M积分光度的比值。在实验中以积分光度比值≥1为高丰度表达，<1为低丰度表达。
1.6 资料统计
采用两样本等级和(Mann-Whitney)检验方法。
2 结果
本实验所用的引物可同时扩增BCL-X基因的两个产物，即长型的BCL-XL和短型的BCL-XS。在15例复发AML的RT-PCR产物中，电泳后仅见800 bp的BCL-XL条带显示，未见600bp的BCL-XS条带。CFU-L检测，10例复发AML细胞在体外无外源性生长因子条件培养为生长型，其BCL-XL mRNA的表达丰度9例为高表达，1例为低表达，表达范围为0.95～3.75，表达丰度相差3.9倍。5例不生长型全为低丰度表达，表达范围0.09～0.63，表达丰度相差约7倍，二者差异有极显著性意义(Mann-Whitney检测，P<0.01)。见图1，2。
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图1 BCL-XL的RT-PCR产物15 g/L琼脂糖电泳
M为Marker:pGEM-7zf(+)/HaeⅢ
图2 β2M的RT-PCR产物15 g/L琼脂糖电泳
M为Marker:pGEM-7zf(+)/HaeⅢ
3 讨论
BCL-X基因是BCL-2基因家族的成员之一，它的两个基因产物为长型BCL-XL和短型BCL-XS，二者功能互为相反。前者具有与BCL-2相同的抗凋亡功能，而后者则有促进凋亡的功能。复发AML细胞中仅有BCL-XL表达，这与文献报道相一致[3]。实验证实，AML细胞有不依赖生长因子生长的特点和可自分泌生长因子的特性[2]。AML细胞自分泌的生长因子既可促进自身的快速增殖，在CFU-L中可表现为生长型，又可 能促使BCL-XL表达增强，后者反过来保护处于增殖当中的细胞继续增殖，同时BCL-XL具有的保护细胞周期中各期细胞的功能，又使得AML细胞的这种增殖优势得以维持和增强，形成了AML细胞增殖的恶性循环。
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BCL-2及其基因家族在AML中的表达具有明显的异质性。文献报道BCL-XL在AML中的表达与AML的关系尚不完全清楚，表达水平相差约16倍[3]。Dibbert等[4]最近又报道了BCL-XL抑制嗜酸性粒细胞的功能可受GM-CSF和IL-5调节，其BCL-XL的表达水平用RT-PCR、Western Blot及免疫组织化学等方法证明与这两种细胞因子呈正相关。由于AML细胞具有不依赖生长因子生长的特点和自分泌某些生长因子的特点，而复发AML属于耐药AML中的一种。我们推测BCL-XL表达的异质性与复发AML细胞体外生长的类型有一定的关系，这一发现有助于阐明BCL-XL在再生耐药中的意义及其复发AML耐药的形成 机制。
复发AML细胞中属CFU-L生长型者多，细胞的增殖速率快，这些特点与AML细胞的再生耐药现象有关，因为再生耐药细胞的特点之一是它具有自分泌生长特点[7]。在本实验中 ，并没有再添加外源性的生长因子，结果10例复发AML细胞体外CFU-L仍为生长型，BCL-XLmRNA表达丰度高，表达相差约3.9倍。不生长型者表达丰度均低，表达相差7倍，表达的异质性明显高于生长型，二者差异有极显著意义(P<0.01)。本实验结果提示，复发AML细胞中BCL-XLmRNA的丰度高，表达的异质性变小与其细胞分泌生长因子相关，因为这些细胞所分泌的因子促使BCL-XL增强表达，一方面BCL-XLmRNA的丰度增加，另一方面它表达的异质性变小，推测这可能与BCL-XL的基础表达有关。 综合本研究结果，提示BCL-XL的高表达可作为复发AML再生耐药的一个判断指标，但BCL-XL异质表达的确切机制有待更深入研究。
, http://www.100md.com
卫生部科学研究基金资助项目(No.96-2-108)
何明生，男，1957年生，医学博士，副主任医师
参 考 文 献
1，Lowenberg B, van Putten W L J, Touw I P et al. Autonomous proliferation of leukemic cellsin vitro as a determinant of prognosis in adult acute myeloid leukemia. N Eng J Med, 1993,328:614
2 Minn A J, Rudin C M, Boise L H et al. Expression of BCL-XL can confer a multidrug resistancephenotype.Blood, 1995,86:1093
, 百拇医药
3，Pallis M, Zhu Y M, Russell N H. BCL-XL is heterogenouslyexpress ed by acute myeloblastic leukemic cells and is associated with autonomous growth in vitro and with P-glycoproteinexpression. Leukemia, 1997,11:945
4，Dibbert B, Daigle I, Braun D et al. Role for BCL-XLin delayed eosinophil apoptosis mediated by granulocyte-macrophage-coloney stimulating fa ctor andinterleukin-5.Blood, 1998,92:778
5，杨天楹.急性白血病疗效标准.见:张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第2版. 北京:科学出版社, 1998. 214～216
, http://www.100md.com
6，BoiseL H, Gonzalaz-Garcia M, Postema C E et al. BcL-X, a bcl -2-related gene that functions as a dominant regulatorof apoptotic cell death . Cell, 1993,74:579
7，Preisler H D, Gopal V. Regrowth resistance inleuk-emia and lympho ma:the need for a new system to classify treatment failure and for new approache s to treatment. LeukRes, 1994,18:149
(1999-03-18 收稿), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属协和医院血液病研究所，武汉 430022
关键词：白血病，髓细胞性，急性；BCL-XL基因；细胞生长
同济医科大学学报000108 摘要 选择15例复发急性髓性白血病(AML)患者，研究BCL-XL的异质性表达与复发AML细胞体外生长类型的关系。用白血病祖细胞培养(CFU-L)判断生长类型，RT-PCR方法检测BCL-XL mRNA的表达丰度。结果：CFU-L检测中，10 例为生长型，其BCL-XL mRNA 9例高表达，1例为低表达；CFU-L检测5例为不生长型，BCL-X LmRNA均为低表达( P<0.01)。在复发AML中，BCL-XL mRNA的高表达与其细胞体外生长类型有关，提示与其细胞的自分泌生长有关，可以作为复发AML再生耐药的一个判断指标 。
, 百拇医药 中图法分类号 R733.7， Q343.1
Association of Cell Growth Modalities in vitro with Its Heterogenous
Expression of BCL-XL in Relapsed Acute Myelogenous Leuke mic Cells
HeMingsheng Chen Yan Li Huiyu et al
(Institute of Hematology, Xiehe Hospital,Tongji Medica l University, Wuhan 430022)
Abstract To elucidatethe relationship between cell growth type s in vitro and its heterogenous expression of BCL-XL in relapsed acute myeloidleukemic (AML) cells, 15 patients with relapsed AML were investigated. The cell growth type in vitro was detected byusing CFU-1, and the expression of BC L-XL by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The results showed that 9 cases but one whose BCL-XL mRNA was highly expr essed were of cell growth types invitro and the remaining 5 cases whose BCL-X L mRNA was low expressed were not (P<0.01). Overexpression ofBCL-XL was closely associated with cell growth types in vitro which might result from its autocrine growth, indicating thatBCL-XL, when highly expressed, might be used as a marker of a regrowth drug-resistant phenotype for the recurrence inAM L.
, 百拇医药
Key words leukemia, myelogenous, acute; BCL-XL gene; cell gr owth
耐药急性髓性白血病(AML)包括难治AML和复发AML两种。研究表明，AML细胞具有自分泌生长因子的特点，在体外则有不依赖细胞生长因子生长形成集落的特点，尤其在复发AML细胞表现更为明显，这一特点与AML细胞的耐药机制形成有关[1]。BCL-XL是BCL-2基因家族的成员之一，具有抗凋亡的功能，并可保护细胞周期中各期细胞的存活从而参与多种耐药表型的形成[2]。此外，BCL-XL在AML细胞中的表达有明显的异质性[3]，而且这种表达水平在某种程度上有依赖细胞生长因子的特征[4]。我们已经研究过BCL-XL在AML细胞上的表达与其化疗敏感性有关，但BCL-XL与AML细胞耐药的关系仍不十分清楚。为进一步阐明BCL-XL与AML细胞耐药的关系，我们选择了与细胞生长因子关系较为密切的复发AML进行研究。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 病例选择
选择15例复发AML，男10例，女5例，年龄24～62岁，均为我院经临床、细胞形态学、细胞化学和免疫学分型确诊，曾接受DA(柔红霉素+阿糖胞苷)方案诱导缓解，取得完全缓解(C R)，随后复发。复发标准参照国内标准[5]。复发时外周血白细胞计数大于4×109/L，均取化疗前外周血5 ml检测，梯度离心后细胞涂片白血病细胞≥90%。
1.2 主要试剂
RPMI1640、TRIZol总RNA提取试剂盒和SUPERSCRIPT ONE-STEPRT-PCR试剂盒均为美国GIBco-BRL公司产品。
1.3 白血病祖细胞(CFU-L)检测
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1ml总体系含2×105细胞,1 ml/L植物凝集素,200 ml/L胎牛血清,8 g/L甲基纤维素,25 mg/L青霉素,25mg/L链霉素,用RPMI 1640补至1 ml后混匀置入无菌的96孔培养板中,每孔2 00 μl,作3个复孔，37 ℃，5%CO2饱和湿度培养7 d，倒置显微镜下计数集落。CFU-L判断标准为:≥40个细胞为集落生长，反之为不生长。
1.4 总RNA提取
取5～106白血病细胞，用TRIZol总RNA提取试剂盒提取总RNA，方法按厂方说明书进行。提取的RNA用美国法玛西亚产DNA和RNA检测仪定量，保存于-70 ℃备用。
1.5 半定量RT-PCR检测BCL-XL mRNA表达丰度
引物序列参照文献[6]，由上海生物工程公司合成。BCL-X引物：5′-TTG GAC AAT GGA CTG GTTGA-3′和3′-GTA GAG TGG ATG GTC AGT G-5′。 这对引物可同时扩增BCL-XL和BCL-XS两种基因产物。对照为β2微球蛋白(β2M)，其引物为：5′-ACC CCC A CT GAAAAA GAT GA-3′和3′-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-5′。用RT-PCR试剂盒扩增，方法按说明书进行。反应总体积为50 μl，总RNA模板为1 μg，引物各为20 pmol，在试剂盒中另加入RNA酶抑制剂25 U。用美国产PE-2400型PCR扩增仪扩增，其条件为①cDNA合成和预变性：50 ℃ 60 min和94 ℃ 2 min；②PCR扩增35个循环：变性94 ℃ 30 s，退 火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃1 min，最后一轮延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存产物。对照样本 在相同条件下扩增β2M。
, 百拇医药
取RT-PCR产物10 μl用15 g/L琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙锭)电泳,电泳结束后在紫外灯下观察结果并照像。产物BCL-XL约为800 bp，β2M为114bp。用HPLAS-1000高清晰度彩色病理分析系统扫描底片，用积分光度比值表示BCL-XLmRNA表达丰度，计算BCL-XL积分光度与β2M积分光度的比值。在实验中以积分光度比值≥1为高丰度表达，<1为低丰度表达。
1.6 资料统计
采用两样本等级和(Mann-Whitney)检验方法。
2 结果
本实验所用的引物可同时扩增BCL-X基因的两个产物，即长型的BCL-XL和短型的BCL-XS。在15例复发AML的RT-PCR产物中，电泳后仅见800 bp的BCL-XL条带显示，未见600bp的BCL-XS条带。CFU-L检测，10例复发AML细胞在体外无外源性生长因子条件培养为生长型，其BCL-XL mRNA的表达丰度9例为高表达，1例为低表达，表达范围为0.95～3.75，表达丰度相差3.9倍。5例不生长型全为低丰度表达，表达范围0.09～0.63，表达丰度相差约7倍，二者差异有极显著性意义(Mann-Whitney检测，P<0.01)。见图1，2。
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图1 BCL-XL的RT-PCR产物15 g/L琼脂糖电泳
M为Marker:pGEM-7zf(+)/HaeⅢ
图2 β2M的RT-PCR产物15 g/L琼脂糖电泳
M为Marker:pGEM-7zf(+)/HaeⅢ
3 讨论
BCL-X基因是BCL-2基因家族的成员之一，它的两个基因产物为长型BCL-XL和短型BCL-XS，二者功能互为相反。前者具有与BCL-2相同的抗凋亡功能，而后者则有促进凋亡的功能。复发AML细胞中仅有BCL-XL表达，这与文献报道相一致[3]。实验证实，AML细胞有不依赖生长因子生长的特点和可自分泌生长因子的特性[2]。AML细胞自分泌的生长因子既可促进自身的快速增殖，在CFU-L中可表现为生长型，又可 能促使BCL-XL表达增强，后者反过来保护处于增殖当中的细胞继续增殖，同时BCL-XL具有的保护细胞周期中各期细胞的功能，又使得AML细胞的这种增殖优势得以维持和增强，形成了AML细胞增殖的恶性循环。
, http://www.100md.com
BCL-2及其基因家族在AML中的表达具有明显的异质性。文献报道BCL-XL在AML中的表达与AML的关系尚不完全清楚，表达水平相差约16倍[3]。Dibbert等[4]最近又报道了BCL-XL抑制嗜酸性粒细胞的功能可受GM-CSF和IL-5调节，其BCL-XL的表达水平用RT-PCR、Western Blot及免疫组织化学等方法证明与这两种细胞因子呈正相关。由于AML细胞具有不依赖生长因子生长的特点和自分泌某些生长因子的特点，而复发AML属于耐药AML中的一种。我们推测BCL-XL表达的异质性与复发AML细胞体外生长的类型有一定的关系，这一发现有助于阐明BCL-XL在再生耐药中的意义及其复发AML耐药的形成 机制。
复发AML细胞中属CFU-L生长型者多，细胞的增殖速率快，这些特点与AML细胞的再生耐药现象有关，因为再生耐药细胞的特点之一是它具有自分泌生长特点[7]。在本实验中 ，并没有再添加外源性的生长因子，结果10例复发AML细胞体外CFU-L仍为生长型，BCL-XLmRNA表达丰度高，表达相差约3.9倍。不生长型者表达丰度均低，表达相差7倍，表达的异质性明显高于生长型，二者差异有极显著意义(P<0.01)。本实验结果提示，复发AML细胞中BCL-XLmRNA的丰度高，表达的异质性变小与其细胞分泌生长因子相关，因为这些细胞所分泌的因子促使BCL-XL增强表达，一方面BCL-XLmRNA的丰度增加，另一方面它表达的异质性变小，推测这可能与BCL-XL的基础表达有关。 综合本研究结果，提示BCL-XL的高表达可作为复发AML再生耐药的一个判断指标，但BCL-XL异质表达的确切机制有待更深入研究。
, http://www.100md.com
卫生部科学研究基金资助项目(No.96-2-108)
何明生，男，1957年生，医学博士，副主任医师
参 考 文 献
1，Lowenberg B, van Putten W L J, Touw I P et al. Autonomous proliferation of leukemic cellsin vitro as a determinant of prognosis in adult acute myeloid leukemia. N Eng J Med, 1993,328:614
2 Minn A J, Rudin C M, Boise L H et al. Expression of BCL-XL can confer a multidrug resistancephenotype.Blood, 1995,86:1093
, 百拇医药
3，Pallis M, Zhu Y M, Russell N H. BCL-XL is heterogenouslyexpress ed by acute myeloblastic leukemic cells and is associated with autonomous growth in vitro and with P-glycoproteinexpression. Leukemia, 1997,11:945
4，Dibbert B, Daigle I, Braun D et al. Role for BCL-XLin delayed eosinophil apoptosis mediated by granulocyte-macrophage-coloney stimulating fa ctor andinterleukin-5.Blood, 1998,92:778
5，杨天楹.急性白血病疗效标准.见:张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第2版. 北京:科学出版社, 1998. 214～216
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6，BoiseL H, Gonzalaz-Garcia M, Postema C E et al. BcL-X, a bcl -2-related gene that functions as a dominant regulatorof apoptotic cell death . Cell, 1993,74:579
7，Preisler H D, Gopal V. Regrowth resistance inleuk-emia and lympho ma:the need for a new system to classify treatment failure and for new approache s to treatment. LeukRes, 1994,18:149
(1999-03-18 收稿), http://www.100md.com