TrK A 在成年猫脊髓的表达
作者：陈彦红 张绎 朱兴宝 李明 冯忠堂 王廷华
单位：陈彦红(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 李明(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 张绎(安宁市八街镇中心卫生院检验科，昆明 650305)； 朱兴宝(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 冯忠堂(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)
关键词：猫脊髓；trk A；免疫组化
昆明医学院学学报000114 摘 要：为探讨trk A在成年猫脊髓的分布，用成年健康雄猫 (体重3～3.5 kg) 的腰段脊髓(L1)制作20 μm厚冰冻切片并行ABC免疫组化染色，DAB棕色反应显色. 结果：trk A的阳性反应物主要分布在脊髓背角II板层的神经膨体、灰质一些神经元以及白质轴索内. 结果提示这些部位存在trk A.
, http://www.100md.com
分类号：Q 426 文献标识：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0054-03
Expression of Tyrosine Kinase A in Spinal Cord of Adult Cat
CHEN Yan-hong,LI Ming,WANG Ting-hua
Institute for Research on Neuroscience，Kunming Medical College，Kunming 650031)
ZHANG Yi
(Clinical Laboratory，Bajie Central Community Hospital，Anning City，Kunming 650305)
, 百拇医药
FENG Zhong-tang,ZHU Xing-bao
(Department of Neurosurgery，NO.1 Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650032)
Abstract：To explore the distribution of tyrosine kinase A (trk A) in Spinal Cord，the lumbar segment of spinal cord (L1from adult cat,was taken and sectioned into frozen slices of 20 μm in thickness. Using specific antiserum of trk A，the sections were stained by immunohistochemistry ABC method. The results were as following: Trk A-like postive substances were distributed mainly in the nerve varicosities of lamina Ⅱ and the neurons of gray matter.Especially，Trk A-like postive substances were also found in the axons of white matter. It indicated that these areas contain Trk A. Our results provided some morphological evidence on trk A in spinal cord of adult cat.
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Key words：Spinal cord of cat；Tyrosine kinase A；Immunohistochemisty▲
近年来，神经营养因子 ( neurotrophic factor，NTF ) 及其受体的研究倍受关注. NTF 通过与效应神经元表面的受体结合而发挥作用. Stach Perez-Polo 在1987年指出，NTF的受体分为两型[1]：I型为高亲和力受体 ( high nerve growth factor，HNGFR ); II型为低亲和力受体 ( low nerve growth factor，LNGFR ). 前者是一个75 kD 的糖蛋白，称为 P75NGFR，后者是原癌基因 ( tyrosine kinase，Trk ) 的编码产物[1，2]. 目前，已证实Trk的相关成员有3个[3]：Trk A(tyrosine kinaseA，TrkA)分子量140 kD，称为P140trkA；Trk B(tyrosine kinaseB，TrkB)分子量145 kD，称为P145trkB；Trk C(tyrosine kinase，TrkC)分子量也是145，称为P145trkC.其中，Trk A 是目前研究最多的受体，其在大鼠脊髓分布的报道已较多，但在成年猫脊髓分布的详细资料则未见报道. 本实验用免疫组化染色了解成年猫脊髓Trk A 的分布.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验仪器
37℃ 恒温箱，恒冷切片机，低温冰箱，显微镜；200 μL 及20 μL可调微量加样枪.
1.2 实验试剂
0.5 mol/L Tris-HCL，0.1 mol/L PBS，3% H2O2，Triton X-100，蔗糖，4%多聚甲醛，兔抗Trk A 抗体(1:100)，ABC试剂盒，封闭用羊血清(工作浓度：5% )，羊抗兔IgG(工作浓度：1∶200 )，酶标卵白素和生物素(工作浓度：1∶100 )，DAB ( 3，3′二氨基联苯胺 ).
1.3 实验方法
成年健康雄猫(体重3～3.5 kg)，用3.5%戊巴比妥钠(1.3 mL/kg) 腹腔注射麻醉后，仰卧固定，暴露胸腔；快速心内插管，500 mL 生理盐水冲洗5 min;4%多聚甲醛灌流固定2 h，取L1脊髓入 20% 蔗糖PBS过夜使组织块下沉，恒冷切片机连续切片，片厚20 μm. 切片按下列程序进行免疫组化染色：3% H2O2，室温15 min; 5%羊血清(0.3% Triton +0.1 mol/L PBS配)封闭背景，37℃ 30 min; 兔抗Trk A抗体 ( 1：100，0.3% Triton+0.1 mol/L PBS 配 )，37℃ 2 h，4℃ 过夜; PBS洗5 min×3; 羊抗兔IgG ( 1:200，PBS 配 )，37℃ 1.5 h; PBS 洗5 min ×3; AB 复合物 ( 1:100 )，37℃ 1 h; PBS 洗; DAB( 0.05 mol/L Tris-HCl配)显色15 min; PBS 洗; 裱片，脱水，透明，封片.
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对照实验以PBS液代替兔抗Trk A抗体按上述程序进行免疫组化染色.
2 结 果
腰髓切片上，Trk A 的免疫阳性反应物主要分布在脊髓背角II板层的神经膨体、灰质一些神经元(附图). 此外，白质轴索内亦见到Trk A 的免疫阳性反应物(附图).
附图 Trk A 的免疫阳性反应物在脊髓
(膨体▲，神经元△，轴索↑)
3 讨 论
研究表明，NTF 发挥作用的第一步是结合到膜受体上. 在胚胎发育期，NTF通过与膜受体结合对神经元的存活、分化起重要作用. 此时，NTF的表达相对较多. 但随着个体发育成熟，NTF 的表达趋向减少. 同样，在发育期，多种 NTFR 广泛分布于周围神经系统和中枢神经系统[4]，而成体后，NTFR在神经系统的配布则相当局限. 比如Trk A mRNA 的表达在成体就仅限于神经嵴来源的感觉神经元[5，6]和交感节[4，7]. 而在大鼠脊髓 ，不少文献已报道Trk A 主要分布在背角Ⅱ板层. 本实验的结果也证明了此点. 然而，有所不同的是，本实验亦观察到在灰质的一些神经元也有Trk A 的阳性反应物. 表明这些部位存在Trk A. 结合文献报道Trk A mRNA 在这些神经元均有表达，提示Trk A 可能由神经元自身合成[8]. 由于Trk A是 NGF 的功能受体，因而推测NGF 可能对这些神经元有作用. 特别有趣的是，本实验还观察到白质轴索内有Trk A 的阳性反应物. 表明白质轴索内也存在 NGF 的功能受体Trk A. 目前，脊髓白质轴索表达Trk A 的功能意义尚不清楚. 本文推测，Trk A 在轴索的表达可能 有利于结合 NGF 并转运之. 详情尚待进一步研究. ■
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基金项目：云南省自然科学基金资助(99C0006R)
作者简介：陈彦红，女(1965～)，上海人，实验师. 从事中枢神经系统损伤修复的研究.
参考文献：
[1] KAPLAN D R. The trk proto-oncogene product: a signal transducing receptor for nerve growth factor [J]. Science，1991，252: 554
[2] SUSAN O M，ERIC M S. The nerve growth factor family of receptors [J].TINS，1992，15: 323
[3] HEMPSTEAD B L. High affinity NGF banding requires coexpression of the trk proto-oncogene and the lower affinity NGF receptor [J]. Nature，1991，350: 678
, 百拇医药
[4] SCHECTERSON L C. Novel roles for neurotrophins are suggested by BDNF and NT-3 mRNA expression in developing neurons [J]. Neuron，1992，9: 449
[5] BARBACID M. The trk family of tyrosine protein kinase receptors[J].Biochim Biophys Acta，1991，1072: 115
[6] MARDIN-ZANCA D. Expression of the trk proto-oncogene is restricted to the sensory cranial and spinal ganglion of neuron crest origin in mouse development [J]. Genes Dev ，1990，4: 683
[7] WETMORE C. High and lower affinity NGF receptor mRNAs in human foetal spinal cord and ganglion [J]. Neuron Report，1992，3: 689
[8] LU B. Expression of NGF and NGF receptor mRNA in the developing brain [J]. Exp Neurol，1989，104: 191
收稿日期：1999-12-15, 百拇医药
单位：陈彦红(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 李明(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 张绎(安宁市八街镇中心卫生院检验科，昆明 650305)； 朱兴宝(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 冯忠堂(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)
关键词：猫脊髓；trk A；免疫组化
昆明医学院学学报000114 摘 要：为探讨trk A在成年猫脊髓的分布，用成年健康雄猫 (体重3～3.5 kg) 的腰段脊髓(L1)制作20 μm厚冰冻切片并行ABC免疫组化染色，DAB棕色反应显色. 结果：trk A的阳性反应物主要分布在脊髓背角II板层的神经膨体、灰质一些神经元以及白质轴索内. 结果提示这些部位存在trk A.
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分类号：Q 426 文献标识：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0054-03
Expression of Tyrosine Kinase A in Spinal Cord of Adult Cat
CHEN Yan-hong,LI Ming,WANG Ting-hua
Institute for Research on Neuroscience，Kunming Medical College，Kunming 650031)
ZHANG Yi
(Clinical Laboratory，Bajie Central Community Hospital，Anning City，Kunming 650305)
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FENG Zhong-tang,ZHU Xing-bao
(Department of Neurosurgery，NO.1 Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650032)
Abstract：To explore the distribution of tyrosine kinase A (trk A) in Spinal Cord，the lumbar segment of spinal cord (L1from adult cat,was taken and sectioned into frozen slices of 20 μm in thickness. Using specific antiserum of trk A，the sections were stained by immunohistochemistry ABC method. The results were as following: Trk A-like postive substances were distributed mainly in the nerve varicosities of lamina Ⅱ and the neurons of gray matter.Especially，Trk A-like postive substances were also found in the axons of white matter. It indicated that these areas contain Trk A. Our results provided some morphological evidence on trk A in spinal cord of adult cat.
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Key words：Spinal cord of cat；Tyrosine kinase A；Immunohistochemisty▲
近年来，神经营养因子 ( neurotrophic factor，NTF ) 及其受体的研究倍受关注. NTF 通过与效应神经元表面的受体结合而发挥作用. Stach Perez-Polo 在1987年指出，NTF的受体分为两型[1]：I型为高亲和力受体 ( high nerve growth factor，HNGFR ); II型为低亲和力受体 ( low nerve growth factor，LNGFR ). 前者是一个75 kD 的糖蛋白，称为 P75NGFR，后者是原癌基因 ( tyrosine kinase，Trk ) 的编码产物[1，2]. 目前，已证实Trk的相关成员有3个[3]：Trk A(tyrosine kinaseA，TrkA)分子量140 kD，称为P140trkA；Trk B(tyrosine kinaseB，TrkB)分子量145 kD，称为P145trkB；Trk C(tyrosine kinase，TrkC)分子量也是145，称为P145trkC.其中，Trk A 是目前研究最多的受体，其在大鼠脊髓分布的报道已较多，但在成年猫脊髓分布的详细资料则未见报道. 本实验用免疫组化染色了解成年猫脊髓Trk A 的分布.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验仪器
37℃ 恒温箱，恒冷切片机，低温冰箱，显微镜；200 μL 及20 μL可调微量加样枪.
1.2 实验试剂
0.5 mol/L Tris-HCL，0.1 mol/L PBS，3% H2O2，Triton X-100，蔗糖，4%多聚甲醛，兔抗Trk A 抗体(1:100)，ABC试剂盒，封闭用羊血清(工作浓度：5% )，羊抗兔IgG(工作浓度：1∶200 )，酶标卵白素和生物素(工作浓度：1∶100 )，DAB ( 3，3′二氨基联苯胺 ).
1.3 实验方法
成年健康雄猫(体重3～3.5 kg)，用3.5%戊巴比妥钠(1.3 mL/kg) 腹腔注射麻醉后，仰卧固定，暴露胸腔；快速心内插管，500 mL 生理盐水冲洗5 min;4%多聚甲醛灌流固定2 h，取L1脊髓入 20% 蔗糖PBS过夜使组织块下沉，恒冷切片机连续切片，片厚20 μm. 切片按下列程序进行免疫组化染色：3% H2O2，室温15 min; 5%羊血清(0.3% Triton +0.1 mol/L PBS配)封闭背景，37℃ 30 min; 兔抗Trk A抗体 ( 1：100，0.3% Triton+0.1 mol/L PBS 配 )，37℃ 2 h，4℃ 过夜; PBS洗5 min×3; 羊抗兔IgG ( 1:200，PBS 配 )，37℃ 1.5 h; PBS 洗5 min ×3; AB 复合物 ( 1:100 )，37℃ 1 h; PBS 洗; DAB( 0.05 mol/L Tris-HCl配)显色15 min; PBS 洗; 裱片，脱水，透明，封片.
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对照实验以PBS液代替兔抗Trk A抗体按上述程序进行免疫组化染色.
2 结 果
腰髓切片上，Trk A 的免疫阳性反应物主要分布在脊髓背角II板层的神经膨体、灰质一些神经元(附图). 此外，白质轴索内亦见到Trk A 的免疫阳性反应物(附图).
附图 Trk A 的免疫阳性反应物在脊髓
(膨体▲，神经元△，轴索↑)
3 讨 论
研究表明，NTF 发挥作用的第一步是结合到膜受体上. 在胚胎发育期，NTF通过与膜受体结合对神经元的存活、分化起重要作用. 此时，NTF的表达相对较多. 但随着个体发育成熟，NTF 的表达趋向减少. 同样，在发育期，多种 NTFR 广泛分布于周围神经系统和中枢神经系统[4]，而成体后，NTFR在神经系统的配布则相当局限. 比如Trk A mRNA 的表达在成体就仅限于神经嵴来源的感觉神经元[5，6]和交感节[4，7]. 而在大鼠脊髓 ，不少文献已报道Trk A 主要分布在背角Ⅱ板层. 本实验的结果也证明了此点. 然而，有所不同的是，本实验亦观察到在灰质的一些神经元也有Trk A 的阳性反应物. 表明这些部位存在Trk A. 结合文献报道Trk A mRNA 在这些神经元均有表达，提示Trk A 可能由神经元自身合成[8]. 由于Trk A是 NGF 的功能受体，因而推测NGF 可能对这些神经元有作用. 特别有趣的是，本实验还观察到白质轴索内有Trk A 的阳性反应物. 表明白质轴索内也存在 NGF 的功能受体Trk A. 目前，脊髓白质轴索表达Trk A 的功能意义尚不清楚. 本文推测，Trk A 在轴索的表达可能 有利于结合 NGF 并转运之. 详情尚待进一步研究. ■
, http://www.100md.com
基金项目：云南省自然科学基金资助(99C0006R)
作者简介：陈彦红，女(1965～)，上海人，实验师. 从事中枢神经系统损伤修复的研究.
参考文献：
[1] KAPLAN D R. The trk proto-oncogene product: a signal transducing receptor for nerve growth factor [J]. Science，1991，252: 554
[2] SUSAN O M，ERIC M S. The nerve growth factor family of receptors [J].TINS，1992，15: 323
[3] HEMPSTEAD B L. High affinity NGF banding requires coexpression of the trk proto-oncogene and the lower affinity NGF receptor [J]. Nature，1991，350: 678
, 百拇医药
[4] SCHECTERSON L C. Novel roles for neurotrophins are suggested by BDNF and NT-3 mRNA expression in developing neurons [J]. Neuron，1992，9: 449
[5] BARBACID M. The trk family of tyrosine protein kinase receptors[J].Biochim Biophys Acta，1991，1072: 115
[6] MARDIN-ZANCA D. Expression of the trk proto-oncogene is restricted to the sensory cranial and spinal ganglion of neuron crest origin in mouse development [J]. Genes Dev ，1990，4: 683
[7] WETMORE C. High and lower affinity NGF receptor mRNAs in human foetal spinal cord and ganglion [J]. Neuron Report，1992，3: 689
[8] LU B. Expression of NGF and NGF receptor mRNA in the developing brain [J]. Exp Neurol，1989，104: 191
收稿日期：1999-12-15, 百拇医药