流式细胞术用于混合型白血病及急性未分化型白血病的诊断
作者：陶德定 舒丹 李方和 龚建平
单位：同济医科大学附属同济医院分子医学中心，武汉 430030
关键词：流式细胞术；白血病；免疫分型；诊断，鉴别
同济医科大学学报00107 摘要 选用美国BD公司的急性白血病免疫表型分析试剂盒，以流式细胞术方法对白血病患者进行细胞免疫表型分析，观察系属抗原表达情况，计算各系属Catovsky积分，对混合型白血病和急性未分化型白血病进行鉴别诊断。结果：根据Catovsky积分标准，淋系和粒系的各自积分≥2分者，诊断为混合型白血病，急性未分化型白血病各系属特异性抗原表达均为阴性。51例临床白血病患者经流式细胞术分析，7例(13.72%)诊断为混合型白血病，1例(1.96%)为未分化型白血病，同期形态学分析仅1例诊断为混合型白血病。提示，用流式细胞术和细胞免疫分型，可以对混合型白血病和急性未分化型白 血病作出有效的鉴别诊断。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R446.11， R733.7
Diagnosis of Mixed Leukemia and Acute Undifferen tiated
Leukemia by FlowCytometry
Tao Deding Shu Dan Li Fanghe et al
(Molecular Medicine Center,Tongji Hospital, Tongji Medi cal University, Wuhan430030)
Abstract By using flow cytometric method and acuteleukemia phenotyping kit bought from BD company of USA, the immunophenotype of the patients with leukemia wasanalyzed, the expression of lineage antigens detected and the score of Catovsky calculated to identify a nd diagnose mixedleukemia and acute undifferentiated leukemia. The results show ed that according to the standard of Catovsky score, thepatient with the score of lymphoid and myeliod not less than 2 respectively were diagnosed having mixed leukemia.The lineagespecific antigens of undifferentiated leukemia were negati ve. Among the 51 patients with leukemia, 7 (13.72 %) werediagnosed having mixe d leukemia and 1(1.96%) was acute undifferentiated leukemia by using flow cytome t ric method,whereas only 1 mixed leukemia by morphology. It was concluded that it's possible to identify and diagnose effectively mixedleukemia and acute undi fferentiated leukemia using flow cytometry and immunophenotyping methods.
, 百拇医药
Keywords flow cytometry； leukemia； immunophen otyping； diagnosis,differential
细胞免疫表型分析是鉴别白血病及其类型的重要手段之一，流式细胞术(FCM)可快速准确地进行细胞免疫表型分析，用于急性白血病(AL)的诊断，特别是在混合型白血病和急性未分化型白血病的免疫学诊断中占有重要地位。现将FCM在混合型白血病和急性未分化型白血病的鉴别诊断中的应用情况报告 如下。
1 材料与方法
1.1 试剂
急性白血病表型分析试剂盒(acute leukemiaphenotyping kit)，红细胞裂解液 (lysing solution)及标准荧光微球(CaliBRITE beads)，均购自美国BD公司。
, 百拇医药
1.2 样本及处理
51例均系本院经形态学分析诊断怀疑为白血病的患者。骨髓或外周血样本经肝素抗凝，用淋巴细胞分层液分离纯化单个核细胞，对混有的红细胞用红细胞裂解液处理，并按试剂盒说明进行染色，再用10 g/L多聚甲醛0.5 ml进行固定，室温避光至少放置 30min上机。也可将处理好的样本于4 ℃放置，并在24 h内上机分析，上机前 应放置至室温。
1.3 FCM分析
BD公司FACSort流式细胞仪用标准荧光微球及FACSComp软件进行自动调试。由于白血病样本通常存在异常的光散射模型及较强的自发荧光，不同患者样本在数据获取前必须进行设备设置优化：作FSC/SSC二维散点图，调节FSC增益及SSC检测电压，使不同细胞群既能全部显示在散点图内，又可清楚区分，同时调节FSC阈值去除大部分碎片。每一样本至少获取10 000个细胞，在进行分析时，若存在一个以上的细胞群，应分别设置光散射门，并用同型对照(IgG2a/IgG1)对每个逻辑门独立设置荧光标记。另外，残留的正常淋巴细胞可用CD3/CD22标记管的CD3+及CD22+结果与正常人结果进行比较区分，在划定白血病谱系时应排除正常淋巴细胞。
, 百拇医药
2 结果
按惯例，粒系标记≥20%，淋巴系标记≥30%为阳性诊断标准[1,2]。另外，按Catovsky的系属积分标准[3～5]，淋系和粒系的各自积分均≥2分者，符合混合型白血病(MAL)的诊断,有双表型、双系列、双克隆的可能。急性未分化型白血病(AUL)基本上无淋系和粒系相关抗原的表达。本文共对51例形态学诊断怀疑为白血病的患者进行了流式细胞术免疫表型分析，其中7例(13.72%)诊断为混合型白血病，1例(1.96%)为急性未分化型白血病，而同期形态学分析仅1例诊断为混合型白血病。几例典型病例的免疫表型分析结果如下述。
2.1 双克隆
存在2个白血病细胞克隆，其抗原表达密度不同，在与荧光抗体结合时表现出不同的荧光强度。图1中的病例A(CD10+,CD19+,CD22+)和B(CD19+,CD22+)经形态学诊断为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)，FCM免疫表型分析可见各自有2个荧光强度存在明显差异的CD19+细胞群，其中病例A的1个CD19+细胞群有部分细胞同时表达CD10。初步说明这2个CD19+细胞群可能来源于2个不同的细 胞克隆。
, 百拇医药
图1 二例B-ALL患者CD10和CD19表达情况
2.2 双表型
急性双表型白血病是指同一白血病细胞同时表达淋系和粒系标记或T和B细胞标记。如图2中的病例，其光散射图中仅有1个白血病细胞群，B系和粒系抗原表达明显异常，Catovsky系属积分分别为B系3分、粒系2分，由此初步诊断为B系、粒系双表型AL，最终确诊尚有待进一步分析CD13或CD33与B系抗原的共同表达情况。该病例的形态学诊断结果为M2型急性粒细胞白血 病。
图2 一例双表型白血病患者外周血样本光散射图及荧光二维图，示抗原表达情况
2.3 双系列
急性双系列白血病是指同一患者同时存在2个白血病细胞亚群，分别呈现粒系和淋系形态及免疫表型特征。如图3中的病例，有2个光散射特性存在明显差异的白血病细胞群R1和R2，经FCM免疫表型分析，细胞群R1的Catovsky积分为B系4分，其他系属抗原阴性；细胞群R2的Catovsky积分为B系3分，粒系2分，其他系属抗原阴性，为双表型，因此，其免疫学诊断应为双系列双表型混合型AL。该病例形态学诊断结果为淋系粒系混合型白血病，与免疫表型 分析结果一致。
, 百拇医药
图3 一例双系列白血病患者外周血样本光散射图及荧光二维图，示细胞群R1和R2的抗原表达情况
2.4 急性未分化型
其特点是无粒系和淋系抗原的表达，但可以有某一非主要系性抗原(如HLA-DR、CD7、TdT等)呈阳性表达[3,4,6]。本文中的1例白血病患者，形态学分析未能给予明确分类，FCM分析结果显示其系属抗原均为阴性表达，免疫学诊断为急性未分化型白血病(AUL)。
3 讨论
形态学(FAB)分型诊断是急性白血病的基本诊断方法，但FAB诊断有其局限性，实际诊断符合率仅为60%～80%[7]，随着越来越多细胞系属专一性单克隆抗体的研制，免疫学分型已成为鉴别白血病及类型的重要手段[1～8]。形态学诊断和免疫学诊断间有时可能会有差异，在下列几种情况下，免疫分型将更为重要。 (1)形态学和细胞化学染色不能确定白血病细胞系列；(2) 急性混合型白血病；(3)形态上为ALL，但缺乏淋系特异的抗原表达；(4) 白血病细胞表面抗原已发生改变，而形态学尚未见改变；(5) T、B-ALL的诊断[3,4]。
, 百拇医药
根据英国血液病标准化委员会(BCSH)和欧洲白血病免疫学特征研究组(EGIL)相继提出的AL免疫表型分析的一线选用单克隆抗体(McAb)[3]，选用BD公司的急性白血病免疫表型分析试剂盒可以比较准确地用于确定AL谱系，但系内亚型的确定还有赖于其他二线McAb的选用。在混合型白血病的诊断中对于Catovsky系属积分不足2分，也即仅异常表达个别次要非本系列相关抗原者，不能诊断为双系列或双表型白血病，应诊断为Ly+ AML或My+ ALL[3]。由于白血病细胞起源和分化非常复杂，MAL有时可能并不是仅表现为单纯的双克隆、双系列或双表型，而是几种类型的混合型。事实上混合型白血病的确切分类相当困难，有待进一步的研究。
FCM用于细胞免疫表型分析，与常规免疫学方法相比，具有快速、准确、可同时进行多参数分析等优点，目前在国外和国内有条件的大型医院已广泛用于临床检验，流式细胞术免疫表型分析有望在白血病诊断，特别是在形态学难以鉴别的白血病的诊断中发挥重要作用
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(No.39670365；39730270；39725027)
陶德定，男，1965年生，助理研究员
参 考 文 献
1，汤美华,陈璋,钱林生等.应用单抗鉴别40例FAB标准难以分类的急性白血病. 中华血液学杂志,1991,12(1):6
2 麻柔,薛向军,公殿光等. 137例急性白血病免疫学表型分析. 中华血液学杂志,1996,17(8):433
3，肖志坚,郝玉书. 免疫表型分析与急性白血病诊断.中华血液学杂志,1997,18( 1):53
4，殷慧君主编. 小儿急性白血病化学治疗. 北京:科学出版社,1996.18～27
, http://www.100md.com
5，Catovsky D,Matutes E,Buccheri V et al. A classification ofacute leukemia for the 1990's. Ann Hematol,1991,62:16
6，韩泽广, 何徐彭, 敖忠芳等.急性未分化白血病体外诱导分化后免疫表型变化 及其临床意义. 中华血液学杂志,1995,16(6):313
7 王鲁群, 张明珙, 朱平等. 形态学与免疫学分型不一致的急性白血病基因重 排分析.中华血液学杂志, 1995, 16(1): 35
8，郑列琳,刘征辉,陆廷伟等.105例成人急性白血病形态学分型与免疫学分型的 比较研究. 中华血液学杂志,1996,17(4):206
(1999-01-12 收稿), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属同济医院分子医学中心，武汉 430030
关键词：流式细胞术；白血病；免疫分型；诊断，鉴别
同济医科大学学报00107 摘要 选用美国BD公司的急性白血病免疫表型分析试剂盒，以流式细胞术方法对白血病患者进行细胞免疫表型分析，观察系属抗原表达情况，计算各系属Catovsky积分，对混合型白血病和急性未分化型白血病进行鉴别诊断。结果：根据Catovsky积分标准，淋系和粒系的各自积分≥2分者，诊断为混合型白血病，急性未分化型白血病各系属特异性抗原表达均为阴性。51例临床白血病患者经流式细胞术分析，7例(13.72%)诊断为混合型白血病，1例(1.96%)为未分化型白血病，同期形态学分析仅1例诊断为混合型白血病。提示，用流式细胞术和细胞免疫分型，可以对混合型白血病和急性未分化型白 血病作出有效的鉴别诊断。
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中图法分类号 R446.11， R733.7
Diagnosis of Mixed Leukemia and Acute Undifferen tiated
Leukemia by FlowCytometry
Tao Deding Shu Dan Li Fanghe et al
(Molecular Medicine Center,Tongji Hospital, Tongji Medi cal University, Wuhan430030)
Abstract By using flow cytometric method and acuteleukemia phenotyping kit bought from BD company of USA, the immunophenotype of the patients with leukemia wasanalyzed, the expression of lineage antigens detected and the score of Catovsky calculated to identify a nd diagnose mixedleukemia and acute undifferentiated leukemia. The results show ed that according to the standard of Catovsky score, thepatient with the score of lymphoid and myeliod not less than 2 respectively were diagnosed having mixed leukemia.The lineagespecific antigens of undifferentiated leukemia were negati ve. Among the 51 patients with leukemia, 7 (13.72 %) werediagnosed having mixe d leukemia and 1(1.96%) was acute undifferentiated leukemia by using flow cytome t ric method,whereas only 1 mixed leukemia by morphology. It was concluded that it's possible to identify and diagnose effectively mixedleukemia and acute undi fferentiated leukemia using flow cytometry and immunophenotyping methods.
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Keywords flow cytometry； leukemia； immunophen otyping； diagnosis,differential
细胞免疫表型分析是鉴别白血病及其类型的重要手段之一，流式细胞术(FCM)可快速准确地进行细胞免疫表型分析，用于急性白血病(AL)的诊断，特别是在混合型白血病和急性未分化型白血病的免疫学诊断中占有重要地位。现将FCM在混合型白血病和急性未分化型白血病的鉴别诊断中的应用情况报告 如下。
1 材料与方法
1.1 试剂
急性白血病表型分析试剂盒(acute leukemiaphenotyping kit)，红细胞裂解液 (lysing solution)及标准荧光微球(CaliBRITE beads)，均购自美国BD公司。
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1.2 样本及处理
51例均系本院经形态学分析诊断怀疑为白血病的患者。骨髓或外周血样本经肝素抗凝，用淋巴细胞分层液分离纯化单个核细胞，对混有的红细胞用红细胞裂解液处理，并按试剂盒说明进行染色，再用10 g/L多聚甲醛0.5 ml进行固定，室温避光至少放置 30min上机。也可将处理好的样本于4 ℃放置，并在24 h内上机分析，上机前 应放置至室温。
1.3 FCM分析
BD公司FACSort流式细胞仪用标准荧光微球及FACSComp软件进行自动调试。由于白血病样本通常存在异常的光散射模型及较强的自发荧光，不同患者样本在数据获取前必须进行设备设置优化：作FSC/SSC二维散点图，调节FSC增益及SSC检测电压，使不同细胞群既能全部显示在散点图内，又可清楚区分，同时调节FSC阈值去除大部分碎片。每一样本至少获取10 000个细胞，在进行分析时，若存在一个以上的细胞群，应分别设置光散射门，并用同型对照(IgG2a/IgG1)对每个逻辑门独立设置荧光标记。另外，残留的正常淋巴细胞可用CD3/CD22标记管的CD3+及CD22+结果与正常人结果进行比较区分，在划定白血病谱系时应排除正常淋巴细胞。
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2 结果
按惯例，粒系标记≥20%，淋巴系标记≥30%为阳性诊断标准[1,2]。另外，按Catovsky的系属积分标准[3～5]，淋系和粒系的各自积分均≥2分者，符合混合型白血病(MAL)的诊断,有双表型、双系列、双克隆的可能。急性未分化型白血病(AUL)基本上无淋系和粒系相关抗原的表达。本文共对51例形态学诊断怀疑为白血病的患者进行了流式细胞术免疫表型分析，其中7例(13.72%)诊断为混合型白血病，1例(1.96%)为急性未分化型白血病，而同期形态学分析仅1例诊断为混合型白血病。几例典型病例的免疫表型分析结果如下述。
2.1 双克隆
存在2个白血病细胞克隆，其抗原表达密度不同，在与荧光抗体结合时表现出不同的荧光强度。图1中的病例A(CD10+,CD19+,CD22+)和B(CD19+,CD22+)经形态学诊断为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)，FCM免疫表型分析可见各自有2个荧光强度存在明显差异的CD19+细胞群，其中病例A的1个CD19+细胞群有部分细胞同时表达CD10。初步说明这2个CD19+细胞群可能来源于2个不同的细 胞克隆。
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图1 二例B-ALL患者CD10和CD19表达情况
2.2 双表型
急性双表型白血病是指同一白血病细胞同时表达淋系和粒系标记或T和B细胞标记。如图2中的病例，其光散射图中仅有1个白血病细胞群，B系和粒系抗原表达明显异常，Catovsky系属积分分别为B系3分、粒系2分，由此初步诊断为B系、粒系双表型AL，最终确诊尚有待进一步分析CD13或CD33与B系抗原的共同表达情况。该病例的形态学诊断结果为M2型急性粒细胞白血 病。
图2 一例双表型白血病患者外周血样本光散射图及荧光二维图，示抗原表达情况
2.3 双系列
急性双系列白血病是指同一患者同时存在2个白血病细胞亚群，分别呈现粒系和淋系形态及免疫表型特征。如图3中的病例，有2个光散射特性存在明显差异的白血病细胞群R1和R2，经FCM免疫表型分析，细胞群R1的Catovsky积分为B系4分，其他系属抗原阴性；细胞群R2的Catovsky积分为B系3分，粒系2分，其他系属抗原阴性，为双表型，因此，其免疫学诊断应为双系列双表型混合型AL。该病例形态学诊断结果为淋系粒系混合型白血病，与免疫表型 分析结果一致。
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图3 一例双系列白血病患者外周血样本光散射图及荧光二维图，示细胞群R1和R2的抗原表达情况
2.4 急性未分化型
其特点是无粒系和淋系抗原的表达，但可以有某一非主要系性抗原(如HLA-DR、CD7、TdT等)呈阳性表达[3,4,6]。本文中的1例白血病患者，形态学分析未能给予明确分类，FCM分析结果显示其系属抗原均为阴性表达，免疫学诊断为急性未分化型白血病(AUL)。
3 讨论
形态学(FAB)分型诊断是急性白血病的基本诊断方法，但FAB诊断有其局限性，实际诊断符合率仅为60%～80%[7]，随着越来越多细胞系属专一性单克隆抗体的研制，免疫学分型已成为鉴别白血病及类型的重要手段[1～8]。形态学诊断和免疫学诊断间有时可能会有差异，在下列几种情况下，免疫分型将更为重要。 (1)形态学和细胞化学染色不能确定白血病细胞系列；(2) 急性混合型白血病；(3)形态上为ALL，但缺乏淋系特异的抗原表达；(4) 白血病细胞表面抗原已发生改变，而形态学尚未见改变；(5) T、B-ALL的诊断[3,4]。
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根据英国血液病标准化委员会(BCSH)和欧洲白血病免疫学特征研究组(EGIL)相继提出的AL免疫表型分析的一线选用单克隆抗体(McAb)[3]，选用BD公司的急性白血病免疫表型分析试剂盒可以比较准确地用于确定AL谱系，但系内亚型的确定还有赖于其他二线McAb的选用。在混合型白血病的诊断中对于Catovsky系属积分不足2分，也即仅异常表达个别次要非本系列相关抗原者，不能诊断为双系列或双表型白血病，应诊断为Ly+ AML或My+ ALL[3]。由于白血病细胞起源和分化非常复杂，MAL有时可能并不是仅表现为单纯的双克隆、双系列或双表型，而是几种类型的混合型。事实上混合型白血病的确切分类相当困难，有待进一步的研究。
FCM用于细胞免疫表型分析，与常规免疫学方法相比，具有快速、准确、可同时进行多参数分析等优点，目前在国外和国内有条件的大型医院已广泛用于临床检验，流式细胞术免疫表型分析有望在白血病诊断，特别是在形态学难以鉴别的白血病的诊断中发挥重要作用
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国家自然科学基金资助项目(No.39670365；39730270；39725027)
陶德定，男，1965年生，助理研究员
参 考 文 献
1，汤美华,陈璋,钱林生等.应用单抗鉴别40例FAB标准难以分类的急性白血病. 中华血液学杂志,1991,12(1):6
2 麻柔,薛向军,公殿光等. 137例急性白血病免疫学表型分析. 中华血液学杂志,1996,17(8):433
3，肖志坚,郝玉书. 免疫表型分析与急性白血病诊断.中华血液学杂志,1997,18( 1):53
4，殷慧君主编. 小儿急性白血病化学治疗. 北京:科学出版社,1996.18～27
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5，Catovsky D,Matutes E,Buccheri V et al. A classification ofacute leukemia for the 1990's. Ann Hematol,1991,62:16
6，韩泽广, 何徐彭, 敖忠芳等.急性未分化白血病体外诱导分化后免疫表型变化 及其临床意义. 中华血液学杂志,1995,16(6):313
7 王鲁群, 张明珙, 朱平等. 形态学与免疫学分型不一致的急性白血病基因重 排分析.中华血液学杂志, 1995, 16(1): 35
8，郑列琳,刘征辉,陆廷伟等.105例成人急性白血病形态学分型与免疫学分型的 比较研究. 中华血液学杂志,1996,17(4):206
(1999-01-12 收稿), http://www.100md.com