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编号:10497738
鸡胚背根节神经细胞微团悬滴培养法的建立及应用
http://www.100md.com 《昆明医学院学报》 2000年第1期
     作者:王廷华 陈彦红 张辉 董丁贵 张晓

    单位:王廷华(昆明医学院神经科学研究所,昆明 650031); 陈彦红(昆明医学院神经科学研究所,昆明 650031); 张辉(玉溪市第二人民医院,玉溪 653100); 董丁贵(曲靖市第一人民医院,曲靖 653100); 张晓(第三军医大学成都军医学院中心实验室,成都 610000)

    关键词:神经细胞微团;悬滴培养;鸡胚背根节

    昆明医学院学学报000110 摘 要:采用神经细胞微团悬滴培养法培养Hamburger35期鸡胚背根节(dorsal root ganglion,DRG)神经元. 结果,神经元于培养24 h后开始生长,5~8 d神经突起联成网状,说明本法可行. 该法为今后进一步探讨神经营养因子对培养神经元存活、生长的影响奠定了基础.

    分类号:Q 253;R 651.3 文献标识码:A
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    文章编号:1003-4706(2000)01-0040-03

    The Micro-group Hanging Drop Technique of Dorsal Root Ganglion Neurons of Chicken Embryo and Its Application in Vitro

    WANG Ting-hua,CHENG Yan-hong,(Institute for Research on Neuroscience,Kunming Medical College,Kunming 650031)

    ZHANG Hu

    (NO 2 People Hospital of Yuxi City, Yuxi 653100)

    DONG Din-gui
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    (NO 1 People Hospital of Qujing, Qujing 610000;)

    ZHANG Xiao

    (The Center of Lab,Chengdu Army Medical College, The 3st Army Medical University, Chengdu 610000)

    Abstract:The neurons from Hamburger stage 35 were cultured by neuronal micro-group hanging drop technique in vitro. Results: The neurons begin to grow at 24 hours after incubation. Many neurites crossing each other were obsreved at 5~8 days after incubation. The results indicated that the neuronal micro-group hanging drop technique could be used for the culture of neurons. It provided a basic technique for our laboratory in future to explore the effect of some neurotrophic factors on the development and growth of neurons in vitro.
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    Key words:Neuronal micro-group;Hanging drop culture;Dorsal root ganglion▲

    目前,体外神经细胞培养作为一种基本的实验手段在神经生物学及细胞生物学界仍倍受重视. 借助神经细胞培养,不但可以了解神经元的形态发育过程,而且可探讨一些细胞因子对神经元存活、生长的影响. 为观察背根节神经细胞的体外发育过程及探讨用微量培养液培养神经元的方法,作者参照神经节悬滴培养法及神经细胞微团培养法,把神经节打散成细胞悬液并以微团接种于生长基质盖片上进行悬滴培养成功,现介绍如下:

    1 材料方法

    1. 1 鼠尾胶原生长基质盖片的制作

    取成年SD大鼠新鲜鼠尾两根,清洁后,用95%酒精浸泡消毒,无菌条件下抽出其尾腱,称重.置0.1% 醋酸溶液内于4℃冰箱中溶解2~3 d(每mL醋酸溶液加尾腱组织2.5 mg),4℃下离心(4 000 r/min)30 min.取上清夜即为鼠尾胶原液. 而后在鼠尾胶原液中补加纤维连接蛋白(5 mg/L). 取15 mm×15 mm灭菌盖玻片,于其上涂布鼠尾胶原液(每片150 μL). 氨气熏蒸30 min后,用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)浸泡平衡至Hank’s液不变颜色为止. 置培养液中浸泡5 min后备用.
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    1.2 鸡胚背根节(dorsal root ganglia,DRG)的摘取和细胞悬液的制备

    将Hamburger 35期Leghorn鸡胚俯卧固定于腊盘上,划开背部皮肤,剪去背部肌肉. 解剖镜下分开鸡胚髋关节,暴露出脊髓和椎管两侧的DRG,摘取腰段DRG置于培养液中,剥去被膜及神经残根,取节入10 mL试管,加0.125%结晶胰蛋白酶(50个背根节/1 mL)置37℃温箱水浴30 min,弃胰蛋白酶,用双抗的Hank’s液洗两次,加培养基4 mL(含10%血清Eagle’s MEM培养基),吸管吹吸打碎(30~100次),220目铜网过滤后调整细胞密度为5×105个/mL备用.

    1.3 神经细胞的微团悬滴培养

    取已备好的细胞悬液20 μL接种于已备好的生长基质上,每20 μL为一微团,每片滴加3~5微团,呈等边三角形或梅花形.小心将盖片送入68 mL瓶底,入CO2孵箱静置2 h后,加40 μL培养液(含33%小牛血清的Eagle's MEM,补加葡萄糖0.5 g/L,HEPES 4.766 g/L,NaHCO3 2.2 g/L)后翻转培养瓶使盖片悬于瓶顶,送于C02孵箱进行悬滴培养. 定时观察神经细胞的生长情况.
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    2 结果

    培养12 h,大多数神经细胞已贴壁. 24 h,各微团内的神经细胞已开始生长. 神经细胞形态易于辨认. 其胞体大而圆,大小不等. 大神经元胞体为12~25 μm,胞浆内颗粒不明显,呈均质状. 与之比较,中小细胞胞质内颗粒较多,核大而圆,常呈偏心位,占胞体直径的1/3~2/3,胞体直径为6~12 μm. 胞体周围可见明亮的折光圈,呈较强的立体感. 卫星细胞较小,圆形,大小仅为小神经元的1/5~1/20,胞体直径1~4 μm左右. 48 h,微团内神经细胞逐渐伸出突起,并联成散在网状. 有的神经突起已伸至微团之外. 至3 d,较多神经细胞的形态因胞体一端发出神经突起而由圆形变为锥形、长椭圆形或梭形. 至5 d,微团之间的神经突起已联成网状,并有较多的神经细胞迁入. 5~8 d,神经细胞生长较为旺盛(附图). 以后生长速度逐渐减慢. 至15 d时,大部分神经细胞突起萎缩,胞体膨大呈死亡迹象. 而此时卫星细胞及成纤维细胞生长则较为旺盛. 20 d左右,神经细胞数已几乎全部死亡.
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    附图 培养6 d的鸡胚DRG神经元(×100)

    3 讨论

    自50年代Levi-Montalcini[1~3]发现神经生长因子以来,通过观察培养鸡胚背根节神经突起的生长情况来探讨加入培养液中的细胞因子有无神经培养活性已成为研究神经营养因子(neurotrophic factor,NTF)生理功能的一种有效手段[3,4]. 但是,由于组织中的细胞因子,特别是NTF的浓度一般均较低,因而,要获得足够的NTF常常比较困难,进而,减少培养液以节约加入其内的NTF即成为研究者们需考虑的问题. 至今,已报道培养神经元最节约培养液的装置有两种,一是2.5~5 mL培养瓶. 二是96孔培养板. 前者最少需培养液0.5~2 mL/瓶. 后者尽管所用培养液少,但由于塑料不利于脱水透明等,因而,难于将培养细胞原位保存下来. 考虑到上述因素,本文综合悬滴培养法及微团培养法,将神经节打散成细胞悬液后以微团接种于15 mm×15 mm盖片上悬滴培养. 建立细胞微团悬滴培养法. 既有利于节约培养液(每片只需40 μL培养液),又未影响细胞生长.进而,当欲于培养液中加入某细胞因子以观察其对神经元存活生长的影响时,与器官(此处指神经节)悬滴培养比,深入到了细胞水平,有利于观察神经元的生长发育过程,与将神经细胞接种于培养瓶底的培养方法相比,节约培养液至少5~10倍.由于培养结束后易于将盖片取出,故不仅可进行脱水透明处理将细胞原位长期保存,而且利于对细胞做进一步的研究(如免疫组织化学染色等). 因而该方法在实验工作中具有一定的应用价值.
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    本文发现,微团悬滴培养神经元24 h开始生长,5~8 d串珠状的神经突起生长较为明显. 被观察的细胞具有神经元的典型特征(从核、质比例,串珠状突起可认定是神经元)进一步说明本文建立的方法可行. 这为本室进一步研究神经营养因子对体外培养神经元存活、生长的影响奠定了基础.■

    作者简介:王廷华(1966~),男,云南宣威人, 讲师,博士,从事中枢神经损伤修复机理的研究.

    参考文献:

    [1] LEVI-MONTALCINI R,HAMBURGER V. Selective nerve growth stimulating effects of mouse sarcoma on the sensory and sympathetic nervous system of the chick embryo[J]. J Exp Zool,1951,116(2): 321
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    [2] LEVI-MONTALCINI R,HAMBURGER V. A diffusable agent of mouse sarcoma producing hyperplasia of sympathetic ganglia and hyperneurotization of viscera in the chick embryo[J]. J Exp Zool,1953,123(2): 233

    [3] LEVI-MONTALCINI R,MEYER H,HAMBURGER V. In vitro experiments on the effects of mouse sarcomas 180 and 37 on the spinal and sympathetic ganglia of the chick embryo[J]. Cancer Res,1954,14(1): 49

    [4] MAISONPIERRE P C,BELLUSCIO L,SQUINTO S. Neurotrophin-3: A neurotrophic factor related to NGF and BDNF[J]. Science,1990,247: 1446

    收稿日期:1999-11-03, http://www.100md.com