基因治疗与神经系统疾病
作者：曹西南
单位：曹西南(昆明医学院分子生物学实验室，昆明 650031)
关键词：基因治疗；载体；神经系统
昆明医学院学学报000105
摘 要：介绍了常用基因治疗技术的一般方法、常用载体，以及一些基因治疗技术在神经系统疾患方面的应用研究.
分类号：Q 426 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0019-06
Gene Therapy and Nervous System Diseases
CAO Xi-nan
, http://www.100md.com
(Laboratory of Molecular Biology，Kunming Medical College，Kunming 650031)
Abstract：This is a brief introduction to some basic techniques and vectors of gene therapy and some trends were involved in this field. The emphasis of this introduction is laid on the present application research of gene therapy in nervous system dieseases.
Key words：Gene therapy; Nervous system diseases;Vector▲
基因治疗通过向细胞或组织中导入具有治疗作用的基因，对疾病进行治疗.基因治疗的应用已有十余年的历史，多用于目前其它常规治疗无效或效果不佳的疾病. 最早的临床应用多限于遗传性疾病，如血友病、腺苷脱氨酶缺乏症、家族性高胆固醇血症等. 之后又扩展用于癌症、爱滋病的治疗. 近年来又在非遗传性和非肿瘤的疾病以及一些需要进行长期用药治疗的疾病，如缺血性疾患、糖尿病、高血压等疾病的治疗等方面取得了一些突破[1]. 基因治疗应用于临床神经系统疾患的例子见于复发性神经胶质母细胞瘤手术切除后的辅助治疗. 现基因治疗应用尚处于临床前研究阶段的神经系统疾患，包括神经退行性病，如老年性痴呆、帕金森氏症等；神经缺血损伤性疾患，如脑中风，脑脊髓损伤后治疗；以及一些遗传原因所致较单一的缺乏症等.
, http://www.100md.com
本文对基因治疗方法和研究进展，以及其在神经疾病方面的情况作一简单介绍和综述.
1 外源基因导入人体内的方法
基因导入人体内的方法可归为 in vivo 和 ex vivo 两类. in vivo 方式是将治疗用的基因直接导入体内，如组织和肿瘤实体内、体腔内和动静脉内注射，或子宫内胎盘、脐带、甚至胎儿体内注射和喷涂方式导入(如用于呼吸道、创面)等. 外源基因可以是以裸 DNA 的形式，大多数情况是以与病毒性载体重组的形式，或是以与非病毒载体形成复合物的形式输入体内.ex vivo 方式是先从病人体内分离获取适合的细胞，在体外进行治疗基因的导入，再筛选出含导入治疗基因的细胞进行培养繁殖，最后将大量这种遗传性状已被改变的细胞输回到病人体内发挥治疗作用. ex vivo 方式特别适合于任何有增殖分化潜能干细胞(如造血干细胞)、融合细胞(如骨骼肌细胞)、以及只须纠正代谢功能即可，不必改变每一个细胞的遗传特性的情况(如对糖尿病、家族性高胆固醇血症等的治疗).
, http://www.100md.com
2 基因导入用载体
向体内或细胞内导入外源基因的载体可归为病毒性和非病毒性两类. 一般而言，病毒性载体的转导效率高，而非病毒性载体是发展方向. 以下以理想载体为题，对于载体的构建和选用，提出一些常规需要考虑的因素，再对常用载体进行介绍.
2.1 理想载体
1)转染或转导效率高：即在靶细胞中表达外源治疗基因的细胞所占比例高.
2)细胞靶向特异性强：理想的是载体导入体内后其只进入待治疗的细胞.
3)导入的外源基因可以在靶细胞中长期高效表达，以便发挥治疗作用：这种表达最好是可以严格调控的.
4)无细胞毒作用.
, http://www.100md.com 5)无免疫源性，以免于体内已有的抗体或引发的抗体与其发生反应，使其中和失效，或激发对靶细胞的免疫反应，杀死靶细胞.
6)对病毒性载体，要求不带活病毒，也不会在靶细胞内重组生成有复制能力的病毒，给人体带来其它危害.
7)对外源治疗基因将整合入细胞的基因组DNA的情况，最好是定位的，只整合入基因组DNA的特定位置，以免随机整合可能导致的基因组DNA的恶性重组突变.
8)可容纳的外源DNA长度范围大，利于大基因、多调节结构、多表达基因的应用.
以上考虑因素是以临床应用为前提而提出的，在研究领域，可不必考虑那么多.
2.2 病毒性载体
病毒性载体的构建和制备，一般是先将相应病毒基因组的核酸序列去除一部份，使其失去在靶细胞内复制的能力；重组入外源核酸序列. 再将重组载体导入包装细胞，进行增殖，包装生成无复制能力，可感染靶细胞的重组病毒颗粒，分离纯化后用于基因治疗. 常用的病毒性载体多源于腺病毒、逆转录病毒、单纯泡疹病毒(HSV，herpes simplex virus)、腺病毒相关病毒(AAV，adenoassociated virus)等.
, 百拇医药
1) 逆转录病毒载体：包括爱滋病病毒、小鼠白血病病毒(MuLV)、Rous 肉瘤病毒等. 逆转录病毒载体对靶细胞的转导作用有赖于靶细胞的分裂，整合入靶细胞的基因组DNA中. 因而，逆转录病毒载体只适用于有分裂增殖能力的细胞的转导. 对神经系统疾患，不适用于无分裂能力的神经元细胞. 其优点是整合入基因组DNA之后，可以在多代细胞中长期稳定表达. 高滴度(高含量、高活性)逆转录病毒的制备较困难，影响转导率的提高. 此外，其整合位点是随机的，可致内源基因的插入突变，产生不良后果.
2)腺病毒载体：可转导有分裂增殖能力和非分裂细胞，因而适用于脑神经元细胞和胶质细胞的转导，是中枢神经系统的常用病毒性载体. 腺病毒载体可获得高滴度制品，转导效率高，并可重组入较长的外源DNA，有的容纳量高达30 kb[2]. 其主要缺点是靶向特异性差；易激发机体强烈的免疫反应，而且人群普遍具有抗腺病毒的抗体，可达90%. 因此，对同一个体，不宜重复使用，或者必须先采取免疫抑制措施. 腺病毒载体无整合问题.
, http://www.100md.com
3)腺病毒相关病毒：AAV其源于有缺陷的细小病毒(parvovirus)，需要利用其它病毒编码的蛋白质功能进行增殖，不形成有复制能力病毒颗粒. AAV可 in vivo 对人的大多数类型的细胞进行转导. AAV属非致病病毒，与任何已知疾病无关. AAV不会激发免疫反应，可对同一个体重复应用. AAV进入靶细胞后定位整合于人的第19号染色体的AAVS1位点，一般不会导致有害的基因组DNA重组突变. 此外，AAV转导不分裂细胞，可以广泛类型的细胞为宿主，在哺乳类脑中可长期表达，纠正表现型[3].
4)单纯泡疹病毒载体：HSV也是中枢神经系统基因治疗常用病毒性载体，对外源基因容纳量可达30 kb，具有神经亲和趋向性，易于获得高滴度制品，转导非分裂细胞，因而适用于不分裂的神经元细胞. 缺点是在HSV载体中的外源启动子不稳定，此外，HSV的病毒抗原表达会引发炎症反应，HSV具有神经毒作用.
5)病毒性载体研究方面的进展主要体现在下列几方面：
, http://www.100md.com
a、提高转导效率：将病毒性载体与其它DNA导入方法的合并应用. 如将逆转录病毒载体与脂质体合用，或将腺病毒载体或AAV载体与磷酸钙沉淀法合用使病毒载体与细胞的结合率提高了几十倍[4]. 又如腺病毒载体与多聚阳离子复合物(polycations complex)合用使导入基因的时间由24～48 h缩短为2 h，而同时转导效率却由30%提高到70%. 另一些人采用伪型病毒载体(pseudotyped viral vector)技术，尤其是采用泡状口腔炎病毒(vesicular stomatitus virus)的外鞘蛋白G蛋白的伪型病毒载体，可使转导率大幅度提高，可达90%以上[5].
b、提高安全性，扩大外源基因DNA容纳量：为避免病毒载体在靶细胞中经重组恢复复制能力，尽可能多地去除病毒的核酸序列，从而提高了载体对外源核酸的容纳量，同时也降低了载体的免疫源性和细胞毒作用，如源于HSV的HSV扩增子(HSV amplicon)和源于腺病毒的极小腺病毒载体(minimal-adenoviral vector).
, 百拇医药
c、提高病毒载体的细胞靶向特异性：主要是通过改变病毒载体外鞘包被分子的结构或分子的种类的方式来实现.
d、SV40病毒载体是有望将来应用于临床的一种病毒性载体：SV40病毒在50～60年代随被污染的小儿麻痹疫苗的应用，使大量人群被感染，仅美国就有数千万人被感染，但至今无证据说明其与人的肿瘤发生有关，相对比较安全. SV40病毒载体易于进行基因重组操作，可高滴度制备，其理化特性稳定，可长期保存，无免疫源性，可长期表达于分裂的和非分裂的细胞中，因而其也适用于神经元细胞和神经胶质细胞的基因治疗.其主要缺点是外源DNA容纳量少，仅5 kb.
e、针对在神经系统中应用的改进：有人在腺病毒载体中添加神经元细胞特异的启动子(大鼠神经元特异烯醇化酶基因的启动子)序列，注入大鼠的海马回、小脑和纹状体，在神经元中获得高效表达，选择性高，细胞毒作用低，可稳定表达3个半月，6个月时仍能检测到[6].有人将HSV和AAV载体成份组合，构建出新的杂合扩增子载体.其有包装不需辅助病毒的安全性和无免疫源性的特点，用于转导从大鼠中脑腹侧核分离的原代培养神经元细胞，获得高效转导，外源基因稳定表达12 d；注射入纹状体，观察到纹状体内有564～8610个神经元细胞，黑质体中有130～809个神经元细胞有外源基因的表达[7].
, 百拇医药
2.3 非病毒性载体
脂质体(liposome)及其含多聚阳离子的各种衍生物是常用非病毒性载体. DNA的脂质体复合物可直接注入组织、血管或呼吸道内. DNA包被于脂质体中可免于被核酸酶降解，免疫源性和毒性减低. DNA被组织中的核酸酶降解生成的含CpG序列的寡聚核苷酸片段本身具有免疫源性，易激发免疫反应，对大多数基因治疗不利，因而在核酸内切酶活性较高的组织中不宜使用裸DNA进行基因治疗. 但对肿瘤的基因治疗是个例外，因为这种免疫反应有利于杀死肿瘤细胞[8]. 骨骼肌和心肌组织中核酸内切酶的活性极低，因而使用裸DNA进行基因治疗不受影响[8]. 脂质体类载体的优点是易于制备，无病毒污染之虑，理化性能稳定易于保存. 曾有人将脂质体/DNA复合物直接注射入脑组织，观察到脑细胞有转染和外源基因表达[9]. 近来又有人将脂质体/DNA(含hG-CSF或mNGF cDNA)复合物注射入脑室和脊索，观察到脑室内和脊索膜间隙非实质衬垫细胞有外源基因表达，峰值在注射后1～7 d，表达可持续3周以上. hG-CSF表达于脊索和脑部，mNGF 表达于海马回中隔膜，同时脑中ChAT活性增高[10].
, 百拇医药
脂质体类载体的主要问题是转染效率低，进入细胞后外源DNA存在时间短，因而外源基因的表达仅是短暂的. 应用于脑内，还受血脑屏障的限制. 值得注意的是，脂质体载体易于被免疫巨噬细胞吞噬，有的不能用于有血清存在的条件下，这也意味着不宜用于经血管导入.
脂质体类载体/DNA复合物转染效率低的主要原因之一是进入细胞的DNA不能从内吞体(endosome)中释放，而被源于溶酶体的核酸酶降解. 为解决这个问题，有人采取同时给氯喹，溶解内吞体，或者在脂质体中增添可引起内吞体溶解的成份，如GALA多肽或含咪唑内吞体溶解生物多聚体.
脂质体类载体的靶向特异性差，可增添植物凝集素使其识别特定细胞膜上的糖蛋白，或增添靶细胞膜上受体配体的多肽序列，如增添PLAEIDGIEL多肽序列使脂质体载体靶向含α/β1 整合素的呼吸道上皮细胞和某些肿瘤细胞. 增添转铁蛋白可使脂质体载体靶向在分裂增殖的正常或肿瘤细胞以及肝细胞等对铁的需求增加或与铁代谢有关的细胞.
, http://www.100md.com
另一发展方向是采用新化合物构建类似脂质体的DNA复合物颗粒，或多肽DNA复合物用于转染细胞. 如采用乳糖-聚乙烯醇-多聚赖氨酸与DNA形成的复合物颗粒，转染效率增高.
3 基因治疗在神经系统疾病中的应用前景
目前，基因治疗技术在神经系统疾病的临床应用还处于起步阶段. 临床上，基因治疗用作复发性恶性神经胶质母细胞瘤手术切除后的辅助治疗手段，直接将含HSVtk基因的细胞植入创口，再经血管给核苷酸类似物ganciclovir，期望杀死遗留的肿瘤细胞，但是效果有限[11].其它神经系统疾病的基因治疗尚处于临床前研究阶段.
脑血管、脑缺血性损伤疾患有望采用基因治疗方法. 人体其它部位的缺血性疾病已有采用基因治疗技术进行治疗取得成效的例子[12]. 有人使用MuLV逆转录病毒载体将人血纤维蛋白溶酶原激活剂的cDNA转导入牛脑血管内皮细胞，获得高转导率和高效表达，有望用于脑血栓形成所致脑中风和其它脑缺血疾患的治疗. 另有人将大鼠的脑中动脉一过性阻塞，90 min后向大脑皮质内注射入含源于神经胶质细胞的神经营养因子GDNF基因的腺病毒载体，24 h后取脑组织分析，与对照相比，发现GDNF表达增高，出现编程死亡信号的神经元显著减少，损伤面积明显减小，说明用GDNF基因治疗方法对大脑的缺血性损伤具有治疗保护作用[13].
, http://www.100md.com
神经系统的某些遗传疾患也有望采取基因治疗方法解决. 如有人将含正常抗利尿激素编码DNA的腺病毒载体注射入因基因突变患抗利尿激素缺乏症的大鼠的下丘脑视上核，纠正了患鼠原有的多饮多尿症状，而且其提高患鼠尿渗透压的作用长达4个月[14].
神经退行性疾患如帕金森氏症、亨廷顿舞蹈病、老年性痴呆等也将会是基因治疗技术应用的重要领域. 有人用含酪氨酸羟化酶cDNA的HSV载体，导入帕金森氏症大鼠模型，可长期改善患鼠的行为表现. 还有人用 ex vivo 的方法，将生成表达酪氨酸羟化酶的细胞植入帕金森氏症大鼠的纹状体，减轻了患鼠的症状.
4 基因导入与血脑屏障
血脑屏障是经血管向全脑或脑局部导入外源基因进行基因治疗的主要障碍之一. 现已有两种方法用于克服血脑屏障障碍. 一是通过提高血管内的渗透压，使血管内皮细胞皱缩，分开细胞间的致密结合. 常用的提高渗透压的高张剂是甘露醇，一般在甘露醇注入5～15 min后血管通透性增大，2 h后恢复正常. 用此方法，可使通过血脑屏障的HSV载体增加4倍. 此法已用于数百名病人，无明显致病性.
, 百拇医药
二是应用血管活性肽如缓激肽、白细胞三烯等来暂时地打开血脑屏障. 在缓激肽输入期间，血脑屏障的通透性可增高12倍，20 min内恢复正常. 有人将缓激肽用于动物实验性脑瘤，使肿瘤组织对寡聚核苷酸的摄取增加了3倍多.
基因治疗是包括神经系统疾患在内许多目前尚无有效治疗方法的疾患有发展前途的治疗选择. 但由于多方面的原因，绝大多数基因治疗研究尚处于临床前阶段，尤其对神经系统疾患. 在基因治疗技术进入临床常规应用之前，尚须基础和临床各学科研究人员的长期努力. ■
作者简介：曹西南(1951-)，男，四川万源人，教授，硕士导师. 研究方向：基因表达调控.
参考文献：
[1] AMANT C，BERTHOU L，WALSH K. Angiogenesis and gene therapy in man: dream or reality?[J].Drugs，1999，59:33
, 百拇医药
[2] KOCHANEK S. High-capacity adenoviral vectors for gene transfer and somatic gene therapy[J].Hum Gene Ther，1999，10(15):2451
[3] KAPLITT M G，LEONE P，SAMULSKI R J，et al.Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-asssociated virus vectors in the mammalian brain[J]. Nat Genet，1994 8:148
[4] WALTERS R，WELSH M. Mechanism by which calcium phosphate coprecipitation enhances adenovirus-mediated gene transfer[J]. Gene Ther，1999，6(11):1845
, http://www.100md.com
[5] YU H，ETON D，WANG Y，et al. High efficiency in vitro gene transfer into vascular tissues using a pseudotyped retroviral vector without pseudotransduction[J]. Gene Ther，1999，6(11):1876
[6] NAVARRO V，MILLECAMPS S，GEOFFROY M C，et al. Efficient gene transfer and long-term expression in neurons using a recombinant adenovirus with a neuron-specific promoter[J]. Gene Ther，1999，6(11):1884
[7] COSTANTINI L C，JACOBY D R，WANG S，et al.Gene transfer to the nigrostriatal system by hybrid herpes simplex virus/adeno-associated virus amplicon vectors[J]. Hum Gene Ther，1999，10(15):2481
, 百拇医药
[8] SIMOES S，SLEPUSHKIN V，PIRES P，et al.Mechanisms of gene transfer mediated by lipoplexes associated with targeting ligands or pH-sensitive peptides[J]. Gene Ther，1999，6(11):1798
[9] ONO T，FUJINO Y，TSUCHCHIYA T，et al. Plasmid DNAs dirextly injected into mouse brain with lipofectin can be incorporated and expressed by brain cells[J]. Neurosci Lett，1990，117:259
[10] MEULI-SIMMEN C，LIU Y，YEO T T，et al.Gene expression along the cerebral-spinal axis after regional gene delivery[J]. Hum Gene Ther，1999，10(16):2689
, 百拇医药
[11] SHAND N，WEBER F，MARIANI L，et al. A phase 1-2 clinical trial of gene therapy for recurrent glioblastoma multiforme by tumor transduction with the herpes simplex thymidine kinase gene followed by ganciclovir. GLI328 European-Canadian study group[J]. Hum Gene Ther，1999，10(14):2325
[12] KOGA H，INAMURA T，IKEZAKI K，et al. Selective transvascular delivery of oligodeoxynucleotides to experimental brain tumors[J]. J Neurooncol，1999，43(2):143
, 百拇医药
[13] KITAGAWA H，SASAKI C，SAKAI K，et al. Adenovirus-mediated gene transfer of glial cell line-derived neurotrophic factor prevents ischemic brain injury after transient middle cerebral artery occlusion in rats[J]. J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(12):1336
[14] GEDDES B J，HARDING T C，LIGHTMAN S L，et al. Assessing viral gene therapy in neuroendocrine models[J]. Front Neuroendocrinol，1999，20(4):296
收稿日期：2000-01-05, http://www.100md.com
单位：曹西南(昆明医学院分子生物学实验室，昆明 650031)
关键词：基因治疗；载体；神经系统
昆明医学院学学报000105
摘 要：介绍了常用基因治疗技术的一般方法、常用载体，以及一些基因治疗技术在神经系统疾患方面的应用研究.
分类号：Q 426 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0019-06
Gene Therapy and Nervous System Diseases
CAO Xi-nan
, http://www.100md.com
(Laboratory of Molecular Biology，Kunming Medical College，Kunming 650031)
Abstract：This is a brief introduction to some basic techniques and vectors of gene therapy and some trends were involved in this field. The emphasis of this introduction is laid on the present application research of gene therapy in nervous system dieseases.
Key words：Gene therapy; Nervous system diseases;Vector▲
基因治疗通过向细胞或组织中导入具有治疗作用的基因，对疾病进行治疗.基因治疗的应用已有十余年的历史，多用于目前其它常规治疗无效或效果不佳的疾病. 最早的临床应用多限于遗传性疾病，如血友病、腺苷脱氨酶缺乏症、家族性高胆固醇血症等. 之后又扩展用于癌症、爱滋病的治疗. 近年来又在非遗传性和非肿瘤的疾病以及一些需要进行长期用药治疗的疾病，如缺血性疾患、糖尿病、高血压等疾病的治疗等方面取得了一些突破[1]. 基因治疗应用于临床神经系统疾患的例子见于复发性神经胶质母细胞瘤手术切除后的辅助治疗. 现基因治疗应用尚处于临床前研究阶段的神经系统疾患，包括神经退行性病，如老年性痴呆、帕金森氏症等；神经缺血损伤性疾患，如脑中风，脑脊髓损伤后治疗；以及一些遗传原因所致较单一的缺乏症等.
, http://www.100md.com
本文对基因治疗方法和研究进展，以及其在神经疾病方面的情况作一简单介绍和综述.
1 外源基因导入人体内的方法
基因导入人体内的方法可归为 in vivo 和 ex vivo 两类. in vivo 方式是将治疗用的基因直接导入体内，如组织和肿瘤实体内、体腔内和动静脉内注射，或子宫内胎盘、脐带、甚至胎儿体内注射和喷涂方式导入(如用于呼吸道、创面)等. 外源基因可以是以裸 DNA 的形式，大多数情况是以与病毒性载体重组的形式，或是以与非病毒载体形成复合物的形式输入体内.ex vivo 方式是先从病人体内分离获取适合的细胞，在体外进行治疗基因的导入，再筛选出含导入治疗基因的细胞进行培养繁殖，最后将大量这种遗传性状已被改变的细胞输回到病人体内发挥治疗作用. ex vivo 方式特别适合于任何有增殖分化潜能干细胞(如造血干细胞)、融合细胞(如骨骼肌细胞)、以及只须纠正代谢功能即可，不必改变每一个细胞的遗传特性的情况(如对糖尿病、家族性高胆固醇血症等的治疗).
, http://www.100md.com
2 基因导入用载体
向体内或细胞内导入外源基因的载体可归为病毒性和非病毒性两类. 一般而言，病毒性载体的转导效率高，而非病毒性载体是发展方向. 以下以理想载体为题，对于载体的构建和选用，提出一些常规需要考虑的因素，再对常用载体进行介绍.
2.1 理想载体
1)转染或转导效率高：即在靶细胞中表达外源治疗基因的细胞所占比例高.
2)细胞靶向特异性强：理想的是载体导入体内后其只进入待治疗的细胞.
3)导入的外源基因可以在靶细胞中长期高效表达，以便发挥治疗作用：这种表达最好是可以严格调控的.
4)无细胞毒作用.
, http://www.100md.com 5)无免疫源性，以免于体内已有的抗体或引发的抗体与其发生反应，使其中和失效，或激发对靶细胞的免疫反应，杀死靶细胞.
6)对病毒性载体，要求不带活病毒，也不会在靶细胞内重组生成有复制能力的病毒，给人体带来其它危害.
7)对外源治疗基因将整合入细胞的基因组DNA的情况，最好是定位的，只整合入基因组DNA的特定位置，以免随机整合可能导致的基因组DNA的恶性重组突变.
8)可容纳的外源DNA长度范围大，利于大基因、多调节结构、多表达基因的应用.
以上考虑因素是以临床应用为前提而提出的，在研究领域，可不必考虑那么多.
2.2 病毒性载体
病毒性载体的构建和制备，一般是先将相应病毒基因组的核酸序列去除一部份，使其失去在靶细胞内复制的能力；重组入外源核酸序列. 再将重组载体导入包装细胞，进行增殖，包装生成无复制能力，可感染靶细胞的重组病毒颗粒，分离纯化后用于基因治疗. 常用的病毒性载体多源于腺病毒、逆转录病毒、单纯泡疹病毒(HSV，herpes simplex virus)、腺病毒相关病毒(AAV，adenoassociated virus)等.
, 百拇医药
1) 逆转录病毒载体：包括爱滋病病毒、小鼠白血病病毒(MuLV)、Rous 肉瘤病毒等. 逆转录病毒载体对靶细胞的转导作用有赖于靶细胞的分裂，整合入靶细胞的基因组DNA中. 因而，逆转录病毒载体只适用于有分裂增殖能力的细胞的转导. 对神经系统疾患，不适用于无分裂能力的神经元细胞. 其优点是整合入基因组DNA之后，可以在多代细胞中长期稳定表达. 高滴度(高含量、高活性)逆转录病毒的制备较困难，影响转导率的提高. 此外，其整合位点是随机的，可致内源基因的插入突变，产生不良后果.
2)腺病毒载体：可转导有分裂增殖能力和非分裂细胞，因而适用于脑神经元细胞和胶质细胞的转导，是中枢神经系统的常用病毒性载体. 腺病毒载体可获得高滴度制品，转导效率高，并可重组入较长的外源DNA，有的容纳量高达30 kb[2]. 其主要缺点是靶向特异性差；易激发机体强烈的免疫反应，而且人群普遍具有抗腺病毒的抗体，可达90%. 因此，对同一个体，不宜重复使用，或者必须先采取免疫抑制措施. 腺病毒载体无整合问题.
, http://www.100md.com
3)腺病毒相关病毒：AAV其源于有缺陷的细小病毒(parvovirus)，需要利用其它病毒编码的蛋白质功能进行增殖，不形成有复制能力病毒颗粒. AAV可 in vivo 对人的大多数类型的细胞进行转导. AAV属非致病病毒，与任何已知疾病无关. AAV不会激发免疫反应，可对同一个体重复应用. AAV进入靶细胞后定位整合于人的第19号染色体的AAVS1位点，一般不会导致有害的基因组DNA重组突变. 此外，AAV转导不分裂细胞，可以广泛类型的细胞为宿主，在哺乳类脑中可长期表达，纠正表现型[3].
4)单纯泡疹病毒载体：HSV也是中枢神经系统基因治疗常用病毒性载体，对外源基因容纳量可达30 kb，具有神经亲和趋向性，易于获得高滴度制品，转导非分裂细胞，因而适用于不分裂的神经元细胞. 缺点是在HSV载体中的外源启动子不稳定，此外，HSV的病毒抗原表达会引发炎症反应，HSV具有神经毒作用.
5)病毒性载体研究方面的进展主要体现在下列几方面：
, http://www.100md.com
a、提高转导效率：将病毒性载体与其它DNA导入方法的合并应用. 如将逆转录病毒载体与脂质体合用，或将腺病毒载体或AAV载体与磷酸钙沉淀法合用使病毒载体与细胞的结合率提高了几十倍[4]. 又如腺病毒载体与多聚阳离子复合物(polycations complex)合用使导入基因的时间由24～48 h缩短为2 h，而同时转导效率却由30%提高到70%. 另一些人采用伪型病毒载体(pseudotyped viral vector)技术，尤其是采用泡状口腔炎病毒(vesicular stomatitus virus)的外鞘蛋白G蛋白的伪型病毒载体，可使转导率大幅度提高，可达90%以上[5].
b、提高安全性，扩大外源基因DNA容纳量：为避免病毒载体在靶细胞中经重组恢复复制能力，尽可能多地去除病毒的核酸序列，从而提高了载体对外源核酸的容纳量，同时也降低了载体的免疫源性和细胞毒作用，如源于HSV的HSV扩增子(HSV amplicon)和源于腺病毒的极小腺病毒载体(minimal-adenoviral vector).
, 百拇医药
c、提高病毒载体的细胞靶向特异性：主要是通过改变病毒载体外鞘包被分子的结构或分子的种类的方式来实现.
d、SV40病毒载体是有望将来应用于临床的一种病毒性载体：SV40病毒在50～60年代随被污染的小儿麻痹疫苗的应用，使大量人群被感染，仅美国就有数千万人被感染，但至今无证据说明其与人的肿瘤发生有关，相对比较安全. SV40病毒载体易于进行基因重组操作，可高滴度制备，其理化特性稳定，可长期保存，无免疫源性，可长期表达于分裂的和非分裂的细胞中，因而其也适用于神经元细胞和神经胶质细胞的基因治疗.其主要缺点是外源DNA容纳量少，仅5 kb.
e、针对在神经系统中应用的改进：有人在腺病毒载体中添加神经元细胞特异的启动子(大鼠神经元特异烯醇化酶基因的启动子)序列，注入大鼠的海马回、小脑和纹状体，在神经元中获得高效表达，选择性高，细胞毒作用低，可稳定表达3个半月，6个月时仍能检测到[6].有人将HSV和AAV载体成份组合，构建出新的杂合扩增子载体.其有包装不需辅助病毒的安全性和无免疫源性的特点，用于转导从大鼠中脑腹侧核分离的原代培养神经元细胞，获得高效转导，外源基因稳定表达12 d；注射入纹状体，观察到纹状体内有564～8610个神经元细胞，黑质体中有130～809个神经元细胞有外源基因的表达[7].
, 百拇医药
2.3 非病毒性载体
脂质体(liposome)及其含多聚阳离子的各种衍生物是常用非病毒性载体. DNA的脂质体复合物可直接注入组织、血管或呼吸道内. DNA包被于脂质体中可免于被核酸酶降解，免疫源性和毒性减低. DNA被组织中的核酸酶降解生成的含CpG序列的寡聚核苷酸片段本身具有免疫源性，易激发免疫反应，对大多数基因治疗不利，因而在核酸内切酶活性较高的组织中不宜使用裸DNA进行基因治疗. 但对肿瘤的基因治疗是个例外，因为这种免疫反应有利于杀死肿瘤细胞[8]. 骨骼肌和心肌组织中核酸内切酶的活性极低，因而使用裸DNA进行基因治疗不受影响[8]. 脂质体类载体的优点是易于制备，无病毒污染之虑，理化性能稳定易于保存. 曾有人将脂质体/DNA复合物直接注射入脑组织，观察到脑细胞有转染和外源基因表达[9]. 近来又有人将脂质体/DNA(含hG-CSF或mNGF cDNA)复合物注射入脑室和脊索，观察到脑室内和脊索膜间隙非实质衬垫细胞有外源基因表达，峰值在注射后1～7 d，表达可持续3周以上. hG-CSF表达于脊索和脑部，mNGF 表达于海马回中隔膜，同时脑中ChAT活性增高[10].
, 百拇医药
脂质体类载体的主要问题是转染效率低，进入细胞后外源DNA存在时间短，因而外源基因的表达仅是短暂的. 应用于脑内，还受血脑屏障的限制. 值得注意的是，脂质体载体易于被免疫巨噬细胞吞噬，有的不能用于有血清存在的条件下，这也意味着不宜用于经血管导入.
脂质体类载体/DNA复合物转染效率低的主要原因之一是进入细胞的DNA不能从内吞体(endosome)中释放，而被源于溶酶体的核酸酶降解. 为解决这个问题，有人采取同时给氯喹，溶解内吞体，或者在脂质体中增添可引起内吞体溶解的成份，如GALA多肽或含咪唑内吞体溶解生物多聚体.
脂质体类载体的靶向特异性差，可增添植物凝集素使其识别特定细胞膜上的糖蛋白，或增添靶细胞膜上受体配体的多肽序列，如增添PLAEIDGIEL多肽序列使脂质体载体靶向含α/β1 整合素的呼吸道上皮细胞和某些肿瘤细胞. 增添转铁蛋白可使脂质体载体靶向在分裂增殖的正常或肿瘤细胞以及肝细胞等对铁的需求增加或与铁代谢有关的细胞.
, http://www.100md.com
另一发展方向是采用新化合物构建类似脂质体的DNA复合物颗粒，或多肽DNA复合物用于转染细胞. 如采用乳糖-聚乙烯醇-多聚赖氨酸与DNA形成的复合物颗粒，转染效率增高.
3 基因治疗在神经系统疾病中的应用前景
目前，基因治疗技术在神经系统疾病的临床应用还处于起步阶段. 临床上，基因治疗用作复发性恶性神经胶质母细胞瘤手术切除后的辅助治疗手段，直接将含HSVtk基因的细胞植入创口，再经血管给核苷酸类似物ganciclovir，期望杀死遗留的肿瘤细胞，但是效果有限[11].其它神经系统疾病的基因治疗尚处于临床前研究阶段.
脑血管、脑缺血性损伤疾患有望采用基因治疗方法. 人体其它部位的缺血性疾病已有采用基因治疗技术进行治疗取得成效的例子[12]. 有人使用MuLV逆转录病毒载体将人血纤维蛋白溶酶原激活剂的cDNA转导入牛脑血管内皮细胞，获得高转导率和高效表达，有望用于脑血栓形成所致脑中风和其它脑缺血疾患的治疗. 另有人将大鼠的脑中动脉一过性阻塞，90 min后向大脑皮质内注射入含源于神经胶质细胞的神经营养因子GDNF基因的腺病毒载体，24 h后取脑组织分析，与对照相比，发现GDNF表达增高，出现编程死亡信号的神经元显著减少，损伤面积明显减小，说明用GDNF基因治疗方法对大脑的缺血性损伤具有治疗保护作用[13].
, http://www.100md.com
神经系统的某些遗传疾患也有望采取基因治疗方法解决. 如有人将含正常抗利尿激素编码DNA的腺病毒载体注射入因基因突变患抗利尿激素缺乏症的大鼠的下丘脑视上核，纠正了患鼠原有的多饮多尿症状，而且其提高患鼠尿渗透压的作用长达4个月[14].
神经退行性疾患如帕金森氏症、亨廷顿舞蹈病、老年性痴呆等也将会是基因治疗技术应用的重要领域. 有人用含酪氨酸羟化酶cDNA的HSV载体，导入帕金森氏症大鼠模型，可长期改善患鼠的行为表现. 还有人用 ex vivo 的方法，将生成表达酪氨酸羟化酶的细胞植入帕金森氏症大鼠的纹状体，减轻了患鼠的症状.
4 基因导入与血脑屏障
血脑屏障是经血管向全脑或脑局部导入外源基因进行基因治疗的主要障碍之一. 现已有两种方法用于克服血脑屏障障碍. 一是通过提高血管内的渗透压，使血管内皮细胞皱缩，分开细胞间的致密结合. 常用的提高渗透压的高张剂是甘露醇，一般在甘露醇注入5～15 min后血管通透性增大，2 h后恢复正常. 用此方法，可使通过血脑屏障的HSV载体增加4倍. 此法已用于数百名病人，无明显致病性.
, 百拇医药
二是应用血管活性肽如缓激肽、白细胞三烯等来暂时地打开血脑屏障. 在缓激肽输入期间，血脑屏障的通透性可增高12倍，20 min内恢复正常. 有人将缓激肽用于动物实验性脑瘤，使肿瘤组织对寡聚核苷酸的摄取增加了3倍多.
基因治疗是包括神经系统疾患在内许多目前尚无有效治疗方法的疾患有发展前途的治疗选择. 但由于多方面的原因，绝大多数基因治疗研究尚处于临床前阶段，尤其对神经系统疾患. 在基因治疗技术进入临床常规应用之前，尚须基础和临床各学科研究人员的长期努力. ■
作者简介：曹西南(1951-)，男，四川万源人，教授，硕士导师. 研究方向：基因表达调控.
参考文献：
[1] AMANT C，BERTHOU L，WALSH K. Angiogenesis and gene therapy in man: dream or reality?[J].Drugs，1999，59:33
, 百拇医药
[2] KOCHANEK S. High-capacity adenoviral vectors for gene transfer and somatic gene therapy[J].Hum Gene Ther，1999，10(15):2451
[3] KAPLITT M G，LEONE P，SAMULSKI R J，et al.Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-asssociated virus vectors in the mammalian brain[J]. Nat Genet，1994 8:148
[4] WALTERS R，WELSH M. Mechanism by which calcium phosphate coprecipitation enhances adenovirus-mediated gene transfer[J]. Gene Ther，1999，6(11):1845
, http://www.100md.com
[5] YU H，ETON D，WANG Y，et al. High efficiency in vitro gene transfer into vascular tissues using a pseudotyped retroviral vector without pseudotransduction[J]. Gene Ther，1999，6(11):1876
[6] NAVARRO V，MILLECAMPS S，GEOFFROY M C，et al. Efficient gene transfer and long-term expression in neurons using a recombinant adenovirus with a neuron-specific promoter[J]. Gene Ther，1999，6(11):1884
[7] COSTANTINI L C，JACOBY D R，WANG S，et al.Gene transfer to the nigrostriatal system by hybrid herpes simplex virus/adeno-associated virus amplicon vectors[J]. Hum Gene Ther，1999，10(15):2481
, 百拇医药
[8] SIMOES S，SLEPUSHKIN V，PIRES P，et al.Mechanisms of gene transfer mediated by lipoplexes associated with targeting ligands or pH-sensitive peptides[J]. Gene Ther，1999，6(11):1798
[9] ONO T，FUJINO Y，TSUCHCHIYA T，et al. Plasmid DNAs dirextly injected into mouse brain with lipofectin can be incorporated and expressed by brain cells[J]. Neurosci Lett，1990，117:259
[10] MEULI-SIMMEN C，LIU Y，YEO T T，et al.Gene expression along the cerebral-spinal axis after regional gene delivery[J]. Hum Gene Ther，1999，10(16):2689
, 百拇医药
[11] SHAND N，WEBER F，MARIANI L，et al. A phase 1-2 clinical trial of gene therapy for recurrent glioblastoma multiforme by tumor transduction with the herpes simplex thymidine kinase gene followed by ganciclovir. GLI328 European-Canadian study group[J]. Hum Gene Ther，1999，10(14):2325
[12] KOGA H，INAMURA T，IKEZAKI K，et al. Selective transvascular delivery of oligodeoxynucleotides to experimental brain tumors[J]. J Neurooncol，1999，43(2):143
, 百拇医药
[13] KITAGAWA H，SASAKI C，SAKAI K，et al. Adenovirus-mediated gene transfer of glial cell line-derived neurotrophic factor prevents ischemic brain injury after transient middle cerebral artery occlusion in rats[J]. J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(12):1336
[14] GEDDES B J，HARDING T C，LIGHTMAN S L，et al. Assessing viral gene therapy in neuroendocrine models[J]. Front Neuroendocrinol，1999，20(4):296
收稿日期：2000-01-05, http://www.100md.com