一种新原位分子杂交技术
作者：刘贤华 白晓东 胡川闽
单位：刘贤华(第三军医大学 预防医学系复合伤研究所)；白晓东(第三军医大学 西南医院烧伤研究所，重庆400038)；胡川闽(第三军医大学 预防医学系复合伤研究所)
关键词：分子杂交；地高辛标记；cDNA探针
细胞与分子免疫学杂志000133
中图号：Q781 文献标识码：B
文章编号:1007-8738(2000)01-0086-87
原位分子杂交技术已开展多年，但至今尚未找到能应用到石蜡切片中效果理想的杂交方法。我们通过反复摸索，多次实践，总结出一种新的原位分子杂交技术。它不仅能很好地应用于石蜡切片，而且可应用于冰冻切片和培养的组织细胞，极大地方便了实验研究工作，报道如下。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料0.2g/LDEPC；40mL/L多聚甲醛(pH7.4)；2g/L甘氨酸，2g/L醋酸酐(用0.1mmol/LpH8.0三乙醇胺配制)；含0.3mmol/L乙酸胺的0.5，0.7，0.9和1L/L酒精；20×SSC(pH7.5)〔1〕；BufferIpH7.5(100mmol/LTrisHCl+150mmol/LNaCl);BufferII(pH9.5)(100mmol/LTrisHCl+100mmol/LNaCl+50mmol/LMgCl2);杂交液(BoeheringerMannheim)。地高辛标记IL-6cDNA探针按BoehringerMannheim公司的说明书进行。
1.2 方法①小肠组织石蜡切片脱蜡经梯度酒精去水，三蒸水洗后，依次加0.2g/LDEPC作用5～10min，0.2mol/LHCl作用30min，用0.01mol/LPBS洗3min×2次；加40mL/L多聚甲醛固定30min，再依次以PBS洗5min，2g/L甘氨酸洗5min×2次及0.1moL/L三乙醇胺缓冲液洗5min。加2g/L醋酸酐作用10min，用含0.3moL/L乙酸胺梯度酒精脱水后，晾干。②将标记的IL-6cDNA探针10μL加到杂交液200μL中，置100℃沸水中变性10min，-20℃冰浴3min，均匀滴加在组织切片上，加盖硅化盖玻片，再100℃变性10min，-20℃冰浴5min，放37℃湿盒中24～36h。③切片依次在2×SSC，1×SSC，0.5×SSC中振洗后，水中去盖玻片；必须彻底洗净后蒸馏水洗，逐级酒精脱水，晾干。切片上划蜡圈，依次用蒸馏水洗和BufferI振洗5min×2次。④用10×封闭液0.1mL+BufferI0.9mL+FCS20μL封闭切片30min后，以上述封闭液稀释标记Dig抗体(1∶500)作用于切片，置37℃湿盒中2～3h，用BufferI振洗5min×3次，BufferII洗5min。⑤显色：加四氮唑蓝(NBT)/5溴4氯3吲哚磷酸盐(BCIP)(NBT/BICP)(20μL和BufferII(1mL)混合液于切片上，37℃避光1～数小时不限，用BufferII洗5min，再蒸馏水洗，加核固红染液衬染30s，蒸馏水洗、脱水、透明封片。阴性对照的设置：即一组在做原位杂交步骤前，部分切片用RNase处理10min，以去除组织中的RNA；另一组是在正式杂交时，部分切片加不含探针的杂交液，详见文献〔2〕。
, 百拇医药
2 结果
小肠组织石蜡切片用地高辛标记的IL6cDNA探针进行原位杂交的结果显示，阳性者应染呈蓝黑色(但因衬染过深，核固红衬染，故照片中染呈紫红色)核染呈红色，表明组织中有IL6mRNA的表达；对照组核也呈红色，但无阳性颗粒(图A，B)。
A.原位杂交呈阳性，有明显颗粒NBT/BICP×400
B.原位杂交呈阴性，无颗粒NBT/BCIP×200
图1小肠组织石蜡切片的原位杂交结果
3 讨论
原位分子杂交技术是分子生物学研究中的重要手段之一。杂交方法有多种，其共同的缺点是应用到石蜡切片中杂交效果均不够理想，所以大多提倡用冰冻切片进行原位杂交〔2〕。这给实验带来了诸多不便，尤其是对许多需做回顾性研究的课题受到了限制。为克服这一缺点，提高原位杂交技术的实用性，我们通过反复摸索，找到了一种新的原位杂交方法。该法主要有以下优点：①既适用于组织的石蜡切片，亦适用于冰冻切片和培养细胞；②不需使用特殊的试剂，经济实用；③杂交信号强。
, 百拇医药
原位分子杂交中，组织消化这一步十分重要。蔡文琴等〔2〕基本上都是采用蛋白酶K消化组织。通过实践我们认为，用蛋白酶K消化石蜡切片中的组织(尤其是小肠)效果不理想。为此我们改用0.2mol/LHCl消化组织。其优点是：一方面有利于组织中的碱性蛋白变性，避免碱性蛋白与探针结合而产生深背景；另一方面可使探针易渗透到组织中产生强杂交信号。原位分子杂交中探针的浓度非常关键。探针的浓度取决于所用探针cDNA片段的长短及探针标记的效率等许多因素。所以应用每种探针首次做杂交时，必须反复摸索至最佳浓度。探针的加样量，根据我们的经验一般每张切片以7～10μL足够。
原位分子杂交前的准备工作也是相当重要，由于杂交的是组织内的mRNA，所以任何一步操作都要考虑到保护其中的mRNA。为此，需注意以下3点：①尽量以无菌操作取组织块，用含1‰DEPC的多聚甲醛固定组织块。对未经上述处理的陈旧石蜡切片组织也可做杂交，但杂交信号可因组织内的mRNA部分丢失而有所减弱。②所有做杂交的器皿和试剂瓶都需于250℃干烤2h；配好的试剂要消毒，不能消毒的试剂需用无菌蒸馏水配制。③操作过程中，要戴手套以防切片污染。总之，由于该项技术经济、实用，不仅可用于组织石蜡切片，也可应用于冰冻切片和培养细胞，所以具有应用与推广的价值。]
, 百拇医药
作者简介：刘贤华，女，28岁，实验师
重庆市高滩岩正街30号，Tel.(023)68752278
参考文献：
〔1〕丁萨姆布鲁克，金冬雁等.分子克隆实验指南〔M〕.北京：科学出版社，1996：928.
〔2〕蔡文琴，王伯，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术〔M〕.成都：四川科学技术出版社，1994：353-417.
收稿日期：1999-03-29
修回日期：1999-06-14, 百拇医药
单位：刘贤华(第三军医大学 预防医学系复合伤研究所)；白晓东(第三军医大学 西南医院烧伤研究所，重庆400038)；胡川闽(第三军医大学 预防医学系复合伤研究所)
关键词：分子杂交；地高辛标记；cDNA探针
细胞与分子免疫学杂志000133
中图号：Q781 文献标识码：B
文章编号:1007-8738(2000)01-0086-87
原位分子杂交技术已开展多年，但至今尚未找到能应用到石蜡切片中效果理想的杂交方法。我们通过反复摸索，多次实践，总结出一种新的原位分子杂交技术。它不仅能很好地应用于石蜡切片，而且可应用于冰冻切片和培养的组织细胞，极大地方便了实验研究工作，报道如下。
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1 材料和方法
1.1 材料0.2g/LDEPC；40mL/L多聚甲醛(pH7.4)；2g/L甘氨酸，2g/L醋酸酐(用0.1mmol/LpH8.0三乙醇胺配制)；含0.3mmol/L乙酸胺的0.5，0.7，0.9和1L/L酒精；20×SSC(pH7.5)〔1〕；BufferIpH7.5(100mmol/LTrisHCl+150mmol/LNaCl);BufferII(pH9.5)(100mmol/LTrisHCl+100mmol/LNaCl+50mmol/LMgCl2);杂交液(BoeheringerMannheim)。地高辛标记IL-6cDNA探针按BoehringerMannheim公司的说明书进行。
1.2 方法①小肠组织石蜡切片脱蜡经梯度酒精去水，三蒸水洗后，依次加0.2g/LDEPC作用5～10min，0.2mol/LHCl作用30min，用0.01mol/LPBS洗3min×2次；加40mL/L多聚甲醛固定30min，再依次以PBS洗5min，2g/L甘氨酸洗5min×2次及0.1moL/L三乙醇胺缓冲液洗5min。加2g/L醋酸酐作用10min，用含0.3moL/L乙酸胺梯度酒精脱水后，晾干。②将标记的IL-6cDNA探针10μL加到杂交液200μL中，置100℃沸水中变性10min，-20℃冰浴3min，均匀滴加在组织切片上，加盖硅化盖玻片，再100℃变性10min，-20℃冰浴5min，放37℃湿盒中24～36h。③切片依次在2×SSC，1×SSC，0.5×SSC中振洗后，水中去盖玻片；必须彻底洗净后蒸馏水洗，逐级酒精脱水，晾干。切片上划蜡圈，依次用蒸馏水洗和BufferI振洗5min×2次。④用10×封闭液0.1mL+BufferI0.9mL+FCS20μL封闭切片30min后，以上述封闭液稀释标记Dig抗体(1∶500)作用于切片，置37℃湿盒中2～3h，用BufferI振洗5min×3次，BufferII洗5min。⑤显色：加四氮唑蓝(NBT)/5溴4氯3吲哚磷酸盐(BCIP)(NBT/BICP)(20μL和BufferII(1mL)混合液于切片上，37℃避光1～数小时不限，用BufferII洗5min，再蒸馏水洗，加核固红染液衬染30s，蒸馏水洗、脱水、透明封片。阴性对照的设置：即一组在做原位杂交步骤前，部分切片用RNase处理10min，以去除组织中的RNA；另一组是在正式杂交时，部分切片加不含探针的杂交液，详见文献〔2〕。
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2 结果
小肠组织石蜡切片用地高辛标记的IL6cDNA探针进行原位杂交的结果显示，阳性者应染呈蓝黑色(但因衬染过深，核固红衬染，故照片中染呈紫红色)核染呈红色，表明组织中有IL6mRNA的表达；对照组核也呈红色，但无阳性颗粒(图A，B)。
A.原位杂交呈阳性，有明显颗粒NBT/BICP×400
B.原位杂交呈阴性，无颗粒NBT/BCIP×200
图1小肠组织石蜡切片的原位杂交结果
3 讨论
原位分子杂交技术是分子生物学研究中的重要手段之一。杂交方法有多种，其共同的缺点是应用到石蜡切片中杂交效果均不够理想，所以大多提倡用冰冻切片进行原位杂交〔2〕。这给实验带来了诸多不便，尤其是对许多需做回顾性研究的课题受到了限制。为克服这一缺点，提高原位杂交技术的实用性，我们通过反复摸索，找到了一种新的原位杂交方法。该法主要有以下优点：①既适用于组织的石蜡切片，亦适用于冰冻切片和培养细胞；②不需使用特殊的试剂，经济实用；③杂交信号强。
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原位分子杂交中，组织消化这一步十分重要。蔡文琴等〔2〕基本上都是采用蛋白酶K消化组织。通过实践我们认为，用蛋白酶K消化石蜡切片中的组织(尤其是小肠)效果不理想。为此我们改用0.2mol/LHCl消化组织。其优点是：一方面有利于组织中的碱性蛋白变性，避免碱性蛋白与探针结合而产生深背景；另一方面可使探针易渗透到组织中产生强杂交信号。原位分子杂交中探针的浓度非常关键。探针的浓度取决于所用探针cDNA片段的长短及探针标记的效率等许多因素。所以应用每种探针首次做杂交时，必须反复摸索至最佳浓度。探针的加样量，根据我们的经验一般每张切片以7～10μL足够。
原位分子杂交前的准备工作也是相当重要，由于杂交的是组织内的mRNA，所以任何一步操作都要考虑到保护其中的mRNA。为此，需注意以下3点：①尽量以无菌操作取组织块，用含1‰DEPC的多聚甲醛固定组织块。对未经上述处理的陈旧石蜡切片组织也可做杂交，但杂交信号可因组织内的mRNA部分丢失而有所减弱。②所有做杂交的器皿和试剂瓶都需于250℃干烤2h；配好的试剂要消毒，不能消毒的试剂需用无菌蒸馏水配制。③操作过程中，要戴手套以防切片污染。总之，由于该项技术经济、实用，不仅可用于组织石蜡切片，也可应用于冰冻切片和培养细胞，所以具有应用与推广的价值。]
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作者简介：刘贤华，女，28岁，实验师
重庆市高滩岩正街30号，Tel.(023)68752278
参考文献：
〔1〕丁萨姆布鲁克，金冬雁等.分子克隆实验指南〔M〕.北京：科学出版社，1996：928.
〔2〕蔡文琴，王伯，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术〔M〕.成都：四川科学技术出版社，1994：353-417.
收稿日期：1999-03-29
修回日期：1999-06-14, 百拇医药