抗鳗弧菌单克隆抗体的研制及鉴定
作者：夏永娟 黄威权 李元 黄宝成 李别虎 金晓航 张荣庆
单位：夏永娟 黄威权 金晓航 张荣庆(第四军医大学基础部 组织学与胚胎学教研室) 李元 黄宝成 李别虎(第四军医大学基础部 微生物学教研室,陕西西安710032)
关键词：鳗弧菌；单克隆抗体；杂交瘤
细胞与分子免疫学杂志000129
中图号：Q812.3 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0081-81
鳗弧菌感染是养殖及野生海水鱼的重要疾病之一，在淡水鱼中也有发病的记载，并可通过食物链感染人类，使人发生较严重的疾病[1]。目前，对此种菌的检测主要通过对鱼的临诊病理观察及细菌学检查，但检测速度和准确性受到一定的限制。我们制备了抗鳗弧菌的mAb，并对其进行了鉴定。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 实验所用鳗弧菌标准菌株由青岛海洋大学海洋生命学院提供。Sp2/0骨髓瘤细胞由第四军医大学863课题组惠赠。
1.2 方法 鳗弧菌菌体用100 mL/L福尔马林固定24 h灭活，生理盐水洗涤两次后，比浊记数。经腹腔免疫(8周龄、雌性)Balb/c小鼠，1×109个菌体/只小鼠。初次免疫后7，14和28 d，各腹腔注射1次，31 d融合。细胞融合、筛选、克隆化和mAb腹水的制备及纯化均为常规方法[2]。抗鳗弧菌mAb的效价测定及Ig亚类鉴定均采用间接ELISA法，所用系列羊抗鼠Ig血清，购自北京邦定生物医学公司；HRP标记的羊抗兔IgG购自华美生物工程公司。mAb与弧菌属其它几种细菌的交叉反应试验采用间接ELISA法，所用标准菌株购自北京生物制品公司。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 杂交瘤细胞系的建立 共进行两次细胞融合，融合率分别为54.5%和50.8%，抗体阳性率分别为30.6%和35.4%。经克隆化后，共获得9株能稳定分泌mAb的阳性细胞株，分别命名为：1D7，2H2，3B2，3D2，3A3，3C4，4A6，4E3和4E12。
2.2 mAb的特性鉴定①杂交瘤细胞培养上清及Balb/c小鼠腹水的ELISA效价分别为2×10-2～×10-3和1×10-5～1×10-7。②经鉴定2H2，3D2，4A6和4E12为IgG3；1D7，3B2和4E3为IgG2a；3A3和3C4为IgG1。③mAb与弧菌属其它几种细菌的交叉反应试验见表1。
表1 抗鳗弧菌mAb与弧菌属其它菌的反应性
菌 种
1D7
, 百拇医药
2H2
3B2
3D2
3A3
3C4
4E3
4A6
4E12
溶藻弧菌
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副溶血弧菌
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创伤弧菌
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河弧菌
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佛尼斯弧菌
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拟态弧菌
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麦氏弧菌
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霍利斯弧菌
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少女弧菌
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3 讨 论
鳗弧菌感染是养殖及野生海水鱼中的重要疾病，可通过损伤的皮肤及伤口而感染人，主要症状为体表点状出血(下颌及鳍最明显)，肝肾肿大，肝脏呈土黄色以及腹腔中有黄色腹水[1,3]。此菌引起的大范围发病给养殖业带来巨大的经济损失。抗鳗弧菌mAb及多克隆抗体的制备虽然在国外已有记载〔4〕但国内尚未见报道。我们用甲醛灭活的鳗弧菌菌体免疫Balb/c小鼠，经筛选、克隆化得到9株能稳定分泌mAb的细胞系。其中2株(2H2和3A3)经交叉实验证明，与弧菌属中其它几种菌均不出现反应，可用于特异性地检测鳗弧菌；其他几株mAb则不同程度的可分别检出溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、河弧菌、佛尼斯弧菌、拟态弧菌及麦氏弧菌中的一种或几种。抗鳗弧菌mAb对鳗弧菌病的诊断创造了条件，也为进一步研究奠定基础。
基金项目：国家863计划资助项目，No.819-02-06
, 百拇医药
作者简介:夏永娟，女，29岁,博士生(导师:黄威权教授)
Tel.(029)3374511;Email.xiahuang@pub.xaonline.com
参考文献:
[1] Toranzo AB, Santos Y, Barja JI. Immunization with bacterial antigens: vibrio infections[J]. Dev Biol Stand， 1997; 90:93- 105.
[2]徐志凯，主编.实用单克隆抗体技术[M].西安:陕西科学技术出版社,1992：27-102.
[3] Austin B, Austin DA. Bacterial fishpathogens:disease is farmed and wild fish[M]. Ellis Horwood:Chichester(UK),1987: 266- 268.
[4] Mutharia LM, Amor PA. Monoclonal antibodies against Vibrio anguillarum O2 and Vibrio ordalii identity antigenic differences in lipopolysaccharide O antigens[J]. FEMS Microbiol Lett， 1994; 123(3):289- 298.
收稿日期：1999-05-14
修稿日期：1999-08-24, 百拇医药
单位：夏永娟 黄威权 金晓航 张荣庆(第四军医大学基础部 组织学与胚胎学教研室) 李元 黄宝成 李别虎(第四军医大学基础部 微生物学教研室,陕西西安710032)
关键词：鳗弧菌；单克隆抗体；杂交瘤
细胞与分子免疫学杂志000129
中图号：Q812.3 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0081-81
鳗弧菌感染是养殖及野生海水鱼的重要疾病之一，在淡水鱼中也有发病的记载，并可通过食物链感染人类，使人发生较严重的疾病[1]。目前，对此种菌的检测主要通过对鱼的临诊病理观察及细菌学检查，但检测速度和准确性受到一定的限制。我们制备了抗鳗弧菌的mAb，并对其进行了鉴定。
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1 材料和方法
1.1 材料 实验所用鳗弧菌标准菌株由青岛海洋大学海洋生命学院提供。Sp2/0骨髓瘤细胞由第四军医大学863课题组惠赠。
1.2 方法 鳗弧菌菌体用100 mL/L福尔马林固定24 h灭活，生理盐水洗涤两次后，比浊记数。经腹腔免疫(8周龄、雌性)Balb/c小鼠，1×109个菌体/只小鼠。初次免疫后7，14和28 d，各腹腔注射1次，31 d融合。细胞融合、筛选、克隆化和mAb腹水的制备及纯化均为常规方法[2]。抗鳗弧菌mAb的效价测定及Ig亚类鉴定均采用间接ELISA法，所用系列羊抗鼠Ig血清，购自北京邦定生物医学公司；HRP标记的羊抗兔IgG购自华美生物工程公司。mAb与弧菌属其它几种细菌的交叉反应试验采用间接ELISA法，所用标准菌株购自北京生物制品公司。
2 结 果
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2.1 杂交瘤细胞系的建立 共进行两次细胞融合，融合率分别为54.5%和50.8%，抗体阳性率分别为30.6%和35.4%。经克隆化后，共获得9株能稳定分泌mAb的阳性细胞株，分别命名为：1D7，2H2，3B2，3D2，3A3，3C4，4A6，4E3和4E12。
2.2 mAb的特性鉴定①杂交瘤细胞培养上清及Balb/c小鼠腹水的ELISA效价分别为2×10-2～×10-3和1×10-5～1×10-7。②经鉴定2H2，3D2，4A6和4E12为IgG3；1D7，3B2和4E3为IgG2a；3A3和3C4为IgG1。③mAb与弧菌属其它几种细菌的交叉反应试验见表1。
表1 抗鳗弧菌mAb与弧菌属其它菌的反应性
菌 种
1D7
, 百拇医药
2H2
3B2
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溶藻弧菌
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3 讨 论
鳗弧菌感染是养殖及野生海水鱼中的重要疾病，可通过损伤的皮肤及伤口而感染人，主要症状为体表点状出血(下颌及鳍最明显)，肝肾肿大，肝脏呈土黄色以及腹腔中有黄色腹水[1,3]。此菌引起的大范围发病给养殖业带来巨大的经济损失。抗鳗弧菌mAb及多克隆抗体的制备虽然在国外已有记载〔4〕但国内尚未见报道。我们用甲醛灭活的鳗弧菌菌体免疫Balb/c小鼠，经筛选、克隆化得到9株能稳定分泌mAb的细胞系。其中2株(2H2和3A3)经交叉实验证明，与弧菌属中其它几种菌均不出现反应，可用于特异性地检测鳗弧菌；其他几株mAb则不同程度的可分别检出溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、河弧菌、佛尼斯弧菌、拟态弧菌及麦氏弧菌中的一种或几种。抗鳗弧菌mAb对鳗弧菌病的诊断创造了条件，也为进一步研究奠定基础。
基金项目：国家863计划资助项目，No.819-02-06
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作者简介:夏永娟，女，29岁,博士生(导师:黄威权教授)
Tel.(029)3374511;Email.xiahuang@pub.xaonline.com
参考文献:
[1] Toranzo AB, Santos Y, Barja JI. Immunization with bacterial antigens: vibrio infections[J]. Dev Biol Stand， 1997; 90:93- 105.
[2]徐志凯，主编.实用单克隆抗体技术[M].西安:陕西科学技术出版社,1992：27-102.
[3] Austin B, Austin DA. Bacterial fishpathogens:disease is farmed and wild fish[M]. Ellis Horwood:Chichester(UK),1987: 266- 268.
[4] Mutharia LM, Amor PA. Monoclonal antibodies against Vibrio anguillarum O2 and Vibrio ordalii identity antigenic differences in lipopolysaccharide O antigens[J]. FEMS Microbiol Lett， 1994; 123(3):289- 298.
收稿日期：1999-05-14
修稿日期：1999-08-24, 百拇医药