RP-HPLC荧光衍生化法测定人血清中胆固醇和胆甾烷醇含量
作者：周宏兵
单位：广东药学院药物分析教研室，广东广州 510224
关键词：RP-HPLC法；荧光衍生化；胆固醇；胆甾烷醇
广东药学院学报000108
摘 要 应用荧光试剂2-(4-羧基苯基)-4，5-萘骈咪唑(CNI)为衍生化试剂，用RP-HPLC法测定人血清中胆固醇和胆甾烷醇含量。色谱条件：zorbax Bp C8柱(250 mm×4.6 mm，ID)作色谱柱；乙腈-甲醇(90∶10)为流动相；二十二烷醇作内标。平均回收率分别是96.19%和94.81%，进样量20 μL时最低检出质量浓度分别为1.0 μg/L和1.5 μg/L。
中图号 R927.2 文献标识码:A 文章编号:1006-8783(2000)01-0028-02
, http://www.100md.com
正常人血清中胆固醇和胆甾烷醇的浓度通常是一个定值。某些疾病会引起该值的变化，例如，甲状腺机能减退、糖尿病、胆道阻塞等病症的患者，该值会升高；相反，甲状腺机能亢进、严重贫血、急性感染等病症的患者该值会降低[1]。有报告指出血清中胆固醇和胆甾烷醇浓度的变化可作为先天性代谢异常疾病的脑腱黄瘤病(Cerebrotendinous Xanthomatosis,CTX)诊断的重要指标[2]。因此其含量测定，在临床诊断及药物研究中是有重要意义的。
血清中胆固醇的测定方法有分光光度法、酶法、气相色谱法、气质联用法和高效液相色谱法等[3]。而血清胆甾烷醇浓度低，测定较困难。近年来，随着新的荧光衍生化试剂的开发，其定量方法迅速得到开发和利用[4、5]。本实验用作者自行合成并具有高灵敏度、衍生化条件温和的2-(4-羧基苯基)-4，5-萘骈咪唑衍生化试剂，参考笔者测定醇类所建立的方法[6]，测定了血清中胆固醇(Cholesterel,CE)和胆甾烷醇(Cholestanol,CA)的含量，得到满意的结果。
, 百拇医药
1 仪器与试药
日立650-10S荧光分光光度计；日本岛津LC-4A型高效液相色谱仪；岛津RF-530型荧光检测器；岛津C-R2AX型数据处理机。胆固醇、胆甾烷醇、二十二烷醇(均为东京化成化学工业公司产品，优级纯)分别用二氯甲烷配成1 mg/mL。胆甾烷醇和二十二烷醇临用前用二氯甲烷稀释成1 μg/mL，备用。4-Piperidino-pyridine(PIP,Aldrich公司产品，优级纯)，I-isopropyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide perchlorate(IDC,关东化学公司产品，优级纯)分别用CH2Cl2配成φ=0.4%的溶液备用。2-(4-羧基苯基)-4，5萘骈咪唑(CNI，本室合成，测定为纯品)用二氯甲烷配成φ=0.04%备用。其它试剂均为东京化成化学工业公司生产，优级纯；水为蒸馏后去离子水。
2 色谱条件
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色谱柱：zorbax Bp C8(250 mm×4.6 mm，ID)；流动相：乙腈-甲醇(90∶10)；流速：1.0mL/min；室温；荧光检测波长：λex345 nm,λem485 nm；内标：二十二烷醇。
3 线性关系考察
精密量取人血清0.01 mL 6份×2组，分置10 mL具塞离心管中，向其中一组各管分别加入0.01 mL内标溶液(1 mg/mL)，再分别加入胆固醇标准溶液0、5、10、15、20、25 μL；另一组各管分别加入0.01 mL内标溶液(1 μg/mL)，再分别加入稀释后的胆甾烷醇标准液0、5、10、15、20、25 μL；两组各管分别加入环己烷2.00 mL，水1.00 mL，旋涡混合1 min。取有机层1.00 mL，置另一具塞试管中，用氮气流挥去溶媒，再分别加入二氯甲烷0.7 mL、CNI溶液、PIP溶液(催化剂)、IDC溶液(缩合剂)各0.10 mL，具塞、混匀，80 ℃水浴加热10 min后，取出，用氮气流挥干溶剂，残留物用0.50 mL乙腈定容，取20 μL进样，HPLC分析。结果，从各项测得值中减去背景值后，以组分与内标峰高比对浓度作线性回归，分别测得血清胆固醇标准曲线为Y=0.3870X+0.011,r=0.9992,线性范围0～2.5 mg/mL。在1.0 mg/mL处测得日内精密度RSD为0.4%(n=9),日间精密度RSD为2.0%(n=5)。血清胆甾烷醇标准曲线为Y=0.3581X+0.019,r=0.9980,线性范围0～2.5 μg/mL，在1.0 μg/mL处测得日内精密度RSD为0.9%(n=9)，日间精密度为3.6%(n=5)。
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4 回收率测定
分别取血清0.01 mL 3×5份×2组，其中一组分别加入3个不同体积的胆固醇标准液5、10、20 μL，每个体积5份；另一组分别加入不同体积的胆甾烷醇稀释后标准液5、10、20 μL，每个体积5份，依“线性关系考察”项下方法操作，分别测得浓度在0.5、1.0、2.0 mg/mL处胆固醇的回收率分别为95.4%±2.2%、96.2%±1.3%、97.0%±1.3%；浓度在0.5、1.0、2.0 μg/mL处胆甾烷醇的回收率分别为93.5%±3.7%、95.2%±3.3%、95.7%±1.1%。进样20 μL时，检测限分别为1.0 μg/L和1.5 μg/L。
5 样品测定
5.1 血清中总胆固醇和总胆甾烷醇的测定 精密量取人血清0.01 mL置10 mL具塞离心管中，加入内标溶液0.01 mL(1 mg/mL)及φ=3%KOH溶液1.0 mL，加塞，混和1 min，置37 ℃水浴，水解反应60 min后，冷至室温，依“线性关系考察”项下，从“精密加入环己烷2.0 mL……”起同样操作，测得结果用标准曲线计算胆固醇含量；用相同方法，但内标液换为浓度1 μg/mL，同法分析胆甾烷醇含量，结果见表1，色谱图见图1。
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5.2 游离胆固醇和胆甾烷醇测定，同上方法，但不加KOH溶液水解，进行提取、衍生化反应和色谱测定。结果见表1。
图1 血清中胆固醇和胆甾烷醇CNI
衍生物的HPLC色谱图
A 胆固醇胆甾烷醇和二十二烷醇CHI衍生物色谱图
B 血清中胆固醇和胆 甾烷醇色谱图(0.1AUFS)
C 血清中的胆甾烷醇色谱图(0.005AUFS)
1，2，5 杂质峰；3 二十二烷醇峰(i.s);
4 胆固醇峰;6 胆甾烷醇峰
表1 9例健康自愿者血清中胆固醇和胆甾烷醇含量 编号
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年龄
性别
CE(f)
mg/mL
CE(t)
mg/mL
CA(f)
μg/mL
CE(t)
μg/mL
CE(f/t)
%
CA(f/t)
, 百拇医药
%
CA(t)/CE(t)
%
1
46
男
0.65
2.47
0.78
2.16
26.3
26.1
0.09
, 百拇医药
2
42
男
0.54
2.09
0.63
1.98
25.8
31.8
0.10
3
35
男
, 百拇医药 0.42
1.60
0.44
1.40
26.3
31.4
0.09
4
35
男
0.39
1.56
0.47
, 百拇医药
1.48
25.0
31.7
0.10
5
24
男
0.55
1.56
0.54
1.91
35.2
28.3
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0.22
6
43
女
0.84
2.35
0.53
1.80
35.7
29.3
0.08
7
23
, 百拇医药
女
0.44
1.53
0.53
1.51
28.8
35.1
0.10
8
49
女
0.67
1.99
, 百拇医药
0.54
1.96
33.7
27.7
0.10
9
48
女
0.59
2.11
0.41
1.77
28.0
, 百拇医药
23.2
0.09
0.56
1.92
0.54
1.77
29.4
30.5
0.11
s
0.13
0.34
0.10
, 百拇医药
0.24
4.02
3.71
0.04
注：CE(f) 游离胆固醇 CE(t) 总胆固醇 CA(f) 游离胆甾烷醇 CA(t) 总胆甾烷醇6 讨论
6.1 该衍生化反应为酯化反应，为使反应顺利进行，并降低反应条件，经考察，以二氯甲烷为溶剂，并加入φ=0.4%的PIP作催化剂、φ=0.4%的IDC作缩水剂，效果最好。
6.2 由于胆甾烷醇血清浓度约为胆固醇的千分之一左右，因此内标液也稀释1000倍，以减少测量误差。
6.3 本实验测得人血清胆固醇的量与有关资料所报导一致，但胆甾烷醇不同方法测得结果有较大误差，估计由于体内浓度低以及仪器和人为误差造成，同时也存在个体差异，需进一步探讨[1，5]。
, 百拇医药
参考文献
[1]姚磊，刘军，徐桂荣，等.医学实用数据手册.北京：中国广播电视出版社，1993.971.
[2]T.Iwata, H.Yamaguchi,M.Nakamura.Highly sensitive and Simple Determination of Cholesterod and Cholestanol in Human Serum hy High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection.J Chromatog,1987,421:43.
[3]由歧英刚.生化学分析法.东京：中山书店，1984.399.
[4]M.Katayama,R.Masuda,H.Taniguchi.Detemination of alcohols by HPLC after Pre-Column cleri vatization with 2-(4-carboxy phenyl)-5,6-alimethylbenzimialazole. J Chromatog,1991,585:219.
, 百拇医药
[5]M Nakajima,S.Yamata,H.Wakabayashi.High-Performance Liquid Chromatographicn Determination of cholesterol and cholestanol in Human Serum by precofumn Derivatization with 2-[2-(Isocyanat)ethyl]-3-methyl-1,4-naphthoquinone Combined with Platinum Catalyst Reduction and Electrochemical Detection.Biol.Pharm.Bull.1995.18(12):1762.
[6]周宏兵，向 夫.荧光衍生化试剂2-(4-羧基苯基)-4，5-苯并味唑的合成及在HPLC测定醇类中的应用.色谱，2000，18(1)：10.
(收稿日期 1999-09-16), 百拇医药
单位：广东药学院药物分析教研室，广东广州 510224
关键词：RP-HPLC法；荧光衍生化；胆固醇；胆甾烷醇
广东药学院学报000108
摘 要 应用荧光试剂2-(4-羧基苯基)-4，5-萘骈咪唑(CNI)为衍生化试剂，用RP-HPLC法测定人血清中胆固醇和胆甾烷醇含量。色谱条件：zorbax Bp C8柱(250 mm×4.6 mm，ID)作色谱柱；乙腈-甲醇(90∶10)为流动相；二十二烷醇作内标。平均回收率分别是96.19%和94.81%，进样量20 μL时最低检出质量浓度分别为1.0 μg/L和1.5 μg/L。
中图号 R927.2 文献标识码:A 文章编号:1006-8783(2000)01-0028-02
, http://www.100md.com
正常人血清中胆固醇和胆甾烷醇的浓度通常是一个定值。某些疾病会引起该值的变化，例如，甲状腺机能减退、糖尿病、胆道阻塞等病症的患者，该值会升高；相反，甲状腺机能亢进、严重贫血、急性感染等病症的患者该值会降低[1]。有报告指出血清中胆固醇和胆甾烷醇浓度的变化可作为先天性代谢异常疾病的脑腱黄瘤病(Cerebrotendinous Xanthomatosis,CTX)诊断的重要指标[2]。因此其含量测定，在临床诊断及药物研究中是有重要意义的。
血清中胆固醇的测定方法有分光光度法、酶法、气相色谱法、气质联用法和高效液相色谱法等[3]。而血清胆甾烷醇浓度低，测定较困难。近年来，随着新的荧光衍生化试剂的开发，其定量方法迅速得到开发和利用[4、5]。本实验用作者自行合成并具有高灵敏度、衍生化条件温和的2-(4-羧基苯基)-4，5-萘骈咪唑衍生化试剂，参考笔者测定醇类所建立的方法[6]，测定了血清中胆固醇(Cholesterel,CE)和胆甾烷醇(Cholestanol,CA)的含量，得到满意的结果。
, 百拇医药
1 仪器与试药
日立650-10S荧光分光光度计；日本岛津LC-4A型高效液相色谱仪；岛津RF-530型荧光检测器；岛津C-R2AX型数据处理机。胆固醇、胆甾烷醇、二十二烷醇(均为东京化成化学工业公司产品，优级纯)分别用二氯甲烷配成1 mg/mL。胆甾烷醇和二十二烷醇临用前用二氯甲烷稀释成1 μg/mL，备用。4-Piperidino-pyridine(PIP,Aldrich公司产品，优级纯)，I-isopropyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide perchlorate(IDC,关东化学公司产品，优级纯)分别用CH2Cl2配成φ=0.4%的溶液备用。2-(4-羧基苯基)-4，5萘骈咪唑(CNI，本室合成，测定为纯品)用二氯甲烷配成φ=0.04%备用。其它试剂均为东京化成化学工业公司生产，优级纯；水为蒸馏后去离子水。
2 色谱条件
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色谱柱：zorbax Bp C8(250 mm×4.6 mm，ID)；流动相：乙腈-甲醇(90∶10)；流速：1.0mL/min；室温；荧光检测波长：λex345 nm,λem485 nm；内标：二十二烷醇。
3 线性关系考察
精密量取人血清0.01 mL 6份×2组，分置10 mL具塞离心管中，向其中一组各管分别加入0.01 mL内标溶液(1 mg/mL)，再分别加入胆固醇标准溶液0、5、10、15、20、25 μL；另一组各管分别加入0.01 mL内标溶液(1 μg/mL)，再分别加入稀释后的胆甾烷醇标准液0、5、10、15、20、25 μL；两组各管分别加入环己烷2.00 mL，水1.00 mL，旋涡混合1 min。取有机层1.00 mL，置另一具塞试管中，用氮气流挥去溶媒，再分别加入二氯甲烷0.7 mL、CNI溶液、PIP溶液(催化剂)、IDC溶液(缩合剂)各0.10 mL，具塞、混匀，80 ℃水浴加热10 min后，取出，用氮气流挥干溶剂，残留物用0.50 mL乙腈定容，取20 μL进样，HPLC分析。结果，从各项测得值中减去背景值后，以组分与内标峰高比对浓度作线性回归，分别测得血清胆固醇标准曲线为Y=0.3870X+0.011,r=0.9992,线性范围0～2.5 mg/mL。在1.0 mg/mL处测得日内精密度RSD为0.4%(n=9),日间精密度RSD为2.0%(n=5)。血清胆甾烷醇标准曲线为Y=0.3581X+0.019,r=0.9980,线性范围0～2.5 μg/mL，在1.0 μg/mL处测得日内精密度RSD为0.9%(n=9)，日间精密度为3.6%(n=5)。
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4 回收率测定
分别取血清0.01 mL 3×5份×2组，其中一组分别加入3个不同体积的胆固醇标准液5、10、20 μL，每个体积5份；另一组分别加入不同体积的胆甾烷醇稀释后标准液5、10、20 μL，每个体积5份，依“线性关系考察”项下方法操作，分别测得浓度在0.5、1.0、2.0 mg/mL处胆固醇的回收率分别为95.4%±2.2%、96.2%±1.3%、97.0%±1.3%；浓度在0.5、1.0、2.0 μg/mL处胆甾烷醇的回收率分别为93.5%±3.7%、95.2%±3.3%、95.7%±1.1%。进样20 μL时，检测限分别为1.0 μg/L和1.5 μg/L。
5 样品测定
5.1 血清中总胆固醇和总胆甾烷醇的测定 精密量取人血清0.01 mL置10 mL具塞离心管中，加入内标溶液0.01 mL(1 mg/mL)及φ=3%KOH溶液1.0 mL，加塞，混和1 min，置37 ℃水浴，水解反应60 min后，冷至室温，依“线性关系考察”项下，从“精密加入环己烷2.0 mL……”起同样操作，测得结果用标准曲线计算胆固醇含量；用相同方法，但内标液换为浓度1 μg/mL，同法分析胆甾烷醇含量，结果见表1，色谱图见图1。
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5.2 游离胆固醇和胆甾烷醇测定，同上方法，但不加KOH溶液水解，进行提取、衍生化反应和色谱测定。结果见表1。
图1 血清中胆固醇和胆甾烷醇CNI
衍生物的HPLC色谱图
A 胆固醇胆甾烷醇和二十二烷醇CHI衍生物色谱图
B 血清中胆固醇和胆 甾烷醇色谱图(0.1AUFS)
C 血清中的胆甾烷醇色谱图(0.005AUFS)
1，2，5 杂质峰；3 二十二烷醇峰(i.s);
4 胆固醇峰;6 胆甾烷醇峰
表1 9例健康自愿者血清中胆固醇和胆甾烷醇含量 编号
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年龄
性别
CE(f)
mg/mL
CE(t)
mg/mL
CA(f)
μg/mL
CE(t)
μg/mL
CE(f/t)
%
CA(f/t)
, 百拇医药
%
CA(t)/CE(t)
%
1
46
男
0.65
2.47
0.78
2.16
26.3
26.1
0.09
, 百拇医药
2
42
男
0.54
2.09
0.63
1.98
25.8
31.8
0.10
3
35
男
, 百拇医药 0.42
1.60
0.44
1.40
26.3
31.4
0.09
4
35
男
0.39
1.56
0.47
, 百拇医药
1.48
25.0
31.7
0.10
5
24
男
0.55
1.56
0.54
1.91
35.2
28.3
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0.22
6
43
女
0.84
2.35
0.53
1.80
35.7
29.3
0.08
7
23
, 百拇医药
女
0.44
1.53
0.53
1.51
28.8
35.1
0.10
8
49
女
0.67
1.99
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0.54
1.96
33.7
27.7
0.10
9
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女
0.59
2.11
0.41
1.77
28.0
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23.2
0.09
0.56
1.92
0.54
1.77
29.4
30.5
0.11
s
0.13
0.34
0.10
, 百拇医药
0.24
4.02
3.71
0.04
注：CE(f) 游离胆固醇 CE(t) 总胆固醇 CA(f) 游离胆甾烷醇 CA(t) 总胆甾烷醇6 讨论
6.1 该衍生化反应为酯化反应，为使反应顺利进行，并降低反应条件，经考察，以二氯甲烷为溶剂，并加入φ=0.4%的PIP作催化剂、φ=0.4%的IDC作缩水剂，效果最好。
6.2 由于胆甾烷醇血清浓度约为胆固醇的千分之一左右，因此内标液也稀释1000倍，以减少测量误差。
6.3 本实验测得人血清胆固醇的量与有关资料所报导一致，但胆甾烷醇不同方法测得结果有较大误差，估计由于体内浓度低以及仪器和人为误差造成，同时也存在个体差异，需进一步探讨[1，5]。
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参考文献
[1]姚磊，刘军，徐桂荣，等.医学实用数据手册.北京：中国广播电视出版社，1993.971.
[2]T.Iwata, H.Yamaguchi,M.Nakamura.Highly sensitive and Simple Determination of Cholesterod and Cholestanol in Human Serum hy High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection.J Chromatog,1987,421:43.
[3]由歧英刚.生化学分析法.东京：中山书店，1984.399.
[4]M.Katayama,R.Masuda,H.Taniguchi.Detemination of alcohols by HPLC after Pre-Column cleri vatization with 2-(4-carboxy phenyl)-5,6-alimethylbenzimialazole. J Chromatog,1991,585:219.
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[5]M Nakajima,S.Yamata,H.Wakabayashi.High-Performance Liquid Chromatographicn Determination of cholesterol and cholestanol in Human Serum by precofumn Derivatization with 2-[2-(Isocyanat)ethyl]-3-methyl-1,4-naphthoquinone Combined with Platinum Catalyst Reduction and Electrochemical Detection.Biol.Pharm.Bull.1995.18(12):1762.
[6]周宏兵，向 夫.荧光衍生化试剂2-(4-羧基苯基)-4，5-苯并味唑的合成及在HPLC测定醇类中的应用.色谱，2000，18(1)：10.
(收稿日期 1999-09-16), 百拇医药