间接免疫荧光法检测人红细胞NADH-细胞色素b5还原酶
作者：吴玉水 唐玉钗 朱忠勇
单位：吴玉水(南京军区福州总医院全军医学检验中心实验科，福建福州350025)；唐玉钗(南京军区福州总医院全军医学检验中心实验科，福建福州350025)；朱忠勇(南京军区福州总医院全军医学检验中心实验科，福建福州350025)
关键词：高铁血红蛋白血症；遗传性还原酶；细胞色素b5；红细胞；免疫荧光
细胞与分子免疫学杂志000130
中图号：R446.61 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0082-83
NADH细胞色素b5还原酶(b5R)缺陷可导致遗传性高铁血红蛋白血症(HM)。研究表明，b5R基因多种突变类型(包括点突变、碱基缺失、无义突变和RNA剪接突变等)均可导致该基因编码有缺陷的酶蛋白(即催化活性和稳定性)下降。检测b5R活性最理想的方法是用细胞色素b5作为底物进行测定，但目前尚无商品化的细胞色素b5产品。从动物肝脏组织自行提取、纯化十分困难，且难于标准化，故目前主要采用分光光度法测定b5R的活性，而该法又有操作繁琐，反应条件要求高等不足。我们以往研究表明，HM患者体内b5R活性的降低与其红细胞内b5R蛋白的含量降低有关〔1,2〕。为此，我们在已制备抗人红细胞b5R单克隆抗体(mAb)〔3〕的基础上，建立了红细胞内b5R的免疫荧光检测法。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 红细胞样本的制备：取正常成人和HM患者(其b5R基因突变类型为Leu72Pro〔4〕)末梢血各10 μL，分别加入10 mL/L戊二醛生理盐水0.05 mL中，4℃醛化40 min。用PBS(10 mmol/L pH7.2)洗涤2次，然后加PBS 200 μL重新悬浮。在载玻片上滴加5 μL红细胞悬液，室温自然干燥后，用冷丙酮固定5 min,置4℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 间接免疫荧光染色 用蒸馏水漂洗以上述方法制备的抗原片，冷风吹干。在抗原片上加纯化的抗b5R mAb 10 μL(0.2 mg/L)，阴性对照及空白对照分别加抗HCG mAb(本中心自制)及PBS。置37℃湿盒中反应45 min后，洗涤3次，每次3 min蒸馏水漂洗1次后，冷风吹干，每孔加10 μL 1∶30的兔抗鼠IgG mAbFITC(Dako公司产品)，置37℃湿盒中反应30 min后洗涤，避光保存，24 h内用荧光显微镜镜检。
, 百拇医药
1.2.2 阻断试验 取不同浓度的(1.0,0.2,0.04,0 g/L)b5R纯品(日本大分医学院 Yubisui博士惠赠)1 μL，各加入抗b5R mAb 2.0 μL(1 mg/L)和PBS 7 μL，混匀后，置37℃作用45 min。然后将抗b5R mAb分别加于正常人红细胞抗原片上反应45 min，再进行荧光抗体染色。
2 结 果
正常人红细胞的胞浆和胞膜均显示绿色荧光(图1)。用b5R纯品阻断后，荧光强度显著减弱。用终质量浓度为0.02 g/L的b5R，可完全阻断终质量浓度为0.2 mg/L的抗b5R mAb的作用。HM患者的红细胞胞质未见荧光着色(由于红细胞内无细胞器，镜下仅能分辨出极模糊的胞膜轮廓(结果未显示)。
图 1 正常人红细胞中b5R的免疫荧光检测×1000
3 讨 论
, 百拇医药
b5R是一种以FAD为辅基的黄素蛋白，以两种形式存在于细胞中，即膜结合型和胞浆可溶型。前者参与体内脂肪酸的延伸和去饱和，胆固醇的生物合成，以及P450介导的药物代谢等；后者主要是使红细胞内的高铁血红蛋白还原为有携氧能力的亚铁血红蛋白〔5〕。早先我们用ELISA和免疫斑点法，分析了RBC冻融裂解后胞浆内b5R的活性和蛋白含量，证明HM患者红细胞胞浆内b5R的活性和蛋白含量极低，甚至测不出〔1,2〕。本研究分析了完整红细胞内b5R的分布，用IFA法未能检出HM患者红细胞内的b5R，与以往报道的结果相符，提示我们所建立的检测红细胞内b5R的间接免疫荧光法，可用于HM的临床实验室诊断。
b5R作为一种生物还原酶尚未被充分研究。有报道许多不同的肿瘤细胞系含有活性高低不同的b5R〔6〕。b5R对抗肿瘤治疗的生物还原类药物(如丝裂霉素C等)具有潜在的激活作用〔7〕，因此，测定肿瘤细胞内b5R的活性，对于生物还原类抗肿瘤药物的应用具有重要意义。但目前尚无测定肿瘤细胞内b5R活性的理想方法，虽然b5R蛋白含量的测定不能完全替代酶活性的测定，然而，分析不同肿瘤细胞内可激活药物的酶蛋白含量也具有参考价值，也可为分析各种肿瘤细胞内b5R的表达提供简便的检测方法。
, 百拇医药
作者简介：吴玉水，男，36岁，主管技师，硕士
福州市西环北路156号，Tel.(0591)3732129
参考文献：
〔1〕 Lan FH, Tang YC, Huang CH, et al. Determination of concentration of cytosolic NADH-cytochrome b5 reductase in erythrocytes from chinese adults, neonates and patients with hereditary methemoglodinemia by double-antibody sandwich ELISA〔J〕 . Acta Haematol, 1998;100(1):44- 52.
〔2〕 Lan FH, Tang YC, Huang CH, et al. Antibody-based spot test for NADH-cytochrome b5 reductase activity for the laboratory diagnosis of congenital methemoglobinemia〔J〕 . Clin Chim Acta. 1998;273(1):13- 20.
, http://www.100md.com
〔3〕 Lan FH, Tang YC, Huang CH, et al. Establishments of monoclonal antibodies against human erythrocyte NADH-cytochrome b5 reductase〔J〕 . Hybridoma, 1996;15(4):295- 298.
〔4〕 Wu YS, Huang CH, Wang Y, et al. Identification of a novel point mutation (Leu72Pro) in the NADH-cytochrome b5 reductase gene of a patient with hereditary methaemoglobinemia type I〔J〕 .Br J Haem-atol, 1998;102:575- 577.
〔5〕吴玉水，黄长晖，朱忠勇.细胞色素b5还原酶缺陷的分子生物学研究进展〔J〕.国外医学输血与血液学分册，1997；20(6):350-353.
, 百拇医药
〔6〕 Barham HM, Inglis R, Chinje EC, Stratford IJ. Development of a spectrophotometric assay for measuring the activity of NADH: cytochrome b5 reductase in human tumour cells〔J〕 . Br J Cancer, 1996;74:1188- 1193.
〔7〕 Hodnick WF, Sartorelli AC. Reductive activation of mitomycin C by NADH: cytochrome b5 reductase〔J〕 . Cancer Res, 1993;53:4907- 4912.
收稿日期：1999-03-04
修回日期：1999-05-19, 百拇医药
单位：吴玉水(南京军区福州总医院全军医学检验中心实验科，福建福州350025)；唐玉钗(南京军区福州总医院全军医学检验中心实验科，福建福州350025)；朱忠勇(南京军区福州总医院全军医学检验中心实验科，福建福州350025)
关键词：高铁血红蛋白血症；遗传性还原酶；细胞色素b5；红细胞；免疫荧光
细胞与分子免疫学杂志000130
中图号：R446.61 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0082-83
NADH细胞色素b5还原酶(b5R)缺陷可导致遗传性高铁血红蛋白血症(HM)。研究表明，b5R基因多种突变类型(包括点突变、碱基缺失、无义突变和RNA剪接突变等)均可导致该基因编码有缺陷的酶蛋白(即催化活性和稳定性)下降。检测b5R活性最理想的方法是用细胞色素b5作为底物进行测定，但目前尚无商品化的细胞色素b5产品。从动物肝脏组织自行提取、纯化十分困难，且难于标准化，故目前主要采用分光光度法测定b5R的活性，而该法又有操作繁琐，反应条件要求高等不足。我们以往研究表明，HM患者体内b5R活性的降低与其红细胞内b5R蛋白的含量降低有关〔1,2〕。为此，我们在已制备抗人红细胞b5R单克隆抗体(mAb)〔3〕的基础上，建立了红细胞内b5R的免疫荧光检测法。
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1 材料和方法
1.1 材料 红细胞样本的制备：取正常成人和HM患者(其b5R基因突变类型为Leu72Pro〔4〕)末梢血各10 μL，分别加入10 mL/L戊二醛生理盐水0.05 mL中，4℃醛化40 min。用PBS(10 mmol/L pH7.2)洗涤2次，然后加PBS 200 μL重新悬浮。在载玻片上滴加5 μL红细胞悬液，室温自然干燥后，用冷丙酮固定5 min,置4℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 间接免疫荧光染色 用蒸馏水漂洗以上述方法制备的抗原片，冷风吹干。在抗原片上加纯化的抗b5R mAb 10 μL(0.2 mg/L)，阴性对照及空白对照分别加抗HCG mAb(本中心自制)及PBS。置37℃湿盒中反应45 min后，洗涤3次，每次3 min蒸馏水漂洗1次后，冷风吹干，每孔加10 μL 1∶30的兔抗鼠IgG mAbFITC(Dako公司产品)，置37℃湿盒中反应30 min后洗涤，避光保存，24 h内用荧光显微镜镜检。
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1.2.2 阻断试验 取不同浓度的(1.0,0.2,0.04,0 g/L)b5R纯品(日本大分医学院 Yubisui博士惠赠)1 μL，各加入抗b5R mAb 2.0 μL(1 mg/L)和PBS 7 μL，混匀后，置37℃作用45 min。然后将抗b5R mAb分别加于正常人红细胞抗原片上反应45 min，再进行荧光抗体染色。
2 结 果
正常人红细胞的胞浆和胞膜均显示绿色荧光(图1)。用b5R纯品阻断后，荧光强度显著减弱。用终质量浓度为0.02 g/L的b5R，可完全阻断终质量浓度为0.2 mg/L的抗b5R mAb的作用。HM患者的红细胞胞质未见荧光着色(由于红细胞内无细胞器，镜下仅能分辨出极模糊的胞膜轮廓(结果未显示)。
图 1 正常人红细胞中b5R的免疫荧光检测×1000
3 讨 论
, 百拇医药
b5R是一种以FAD为辅基的黄素蛋白，以两种形式存在于细胞中，即膜结合型和胞浆可溶型。前者参与体内脂肪酸的延伸和去饱和，胆固醇的生物合成，以及P450介导的药物代谢等；后者主要是使红细胞内的高铁血红蛋白还原为有携氧能力的亚铁血红蛋白〔5〕。早先我们用ELISA和免疫斑点法，分析了RBC冻融裂解后胞浆内b5R的活性和蛋白含量，证明HM患者红细胞胞浆内b5R的活性和蛋白含量极低，甚至测不出〔1,2〕。本研究分析了完整红细胞内b5R的分布，用IFA法未能检出HM患者红细胞内的b5R，与以往报道的结果相符，提示我们所建立的检测红细胞内b5R的间接免疫荧光法，可用于HM的临床实验室诊断。
b5R作为一种生物还原酶尚未被充分研究。有报道许多不同的肿瘤细胞系含有活性高低不同的b5R〔6〕。b5R对抗肿瘤治疗的生物还原类药物(如丝裂霉素C等)具有潜在的激活作用〔7〕，因此，测定肿瘤细胞内b5R的活性，对于生物还原类抗肿瘤药物的应用具有重要意义。但目前尚无测定肿瘤细胞内b5R活性的理想方法，虽然b5R蛋白含量的测定不能完全替代酶活性的测定，然而，分析不同肿瘤细胞内可激活药物的酶蛋白含量也具有参考价值，也可为分析各种肿瘤细胞内b5R的表达提供简便的检测方法。
, 百拇医药
作者简介：吴玉水，男，36岁，主管技师，硕士
福州市西环北路156号，Tel.(0591)3732129
参考文献：
〔1〕 Lan FH, Tang YC, Huang CH, et al. Determination of concentration of cytosolic NADH-cytochrome b5 reductase in erythrocytes from chinese adults, neonates and patients with hereditary methemoglodinemia by double-antibody sandwich ELISA〔J〕 . Acta Haematol, 1998;100(1):44- 52.
〔2〕 Lan FH, Tang YC, Huang CH, et al. Antibody-based spot test for NADH-cytochrome b5 reductase activity for the laboratory diagnosis of congenital methemoglobinemia〔J〕 . Clin Chim Acta. 1998;273(1):13- 20.
, http://www.100md.com
〔3〕 Lan FH, Tang YC, Huang CH, et al. Establishments of monoclonal antibodies against human erythrocyte NADH-cytochrome b5 reductase〔J〕 . Hybridoma, 1996;15(4):295- 298.
〔4〕 Wu YS, Huang CH, Wang Y, et al. Identification of a novel point mutation (Leu72Pro) in the NADH-cytochrome b5 reductase gene of a patient with hereditary methaemoglobinemia type I〔J〕 .Br J Haem-atol, 1998;102:575- 577.
〔5〕吴玉水，黄长晖，朱忠勇.细胞色素b5还原酶缺陷的分子生物学研究进展〔J〕.国外医学输血与血液学分册，1997；20(6):350-353.
, 百拇医药
〔6〕 Barham HM, Inglis R, Chinje EC, Stratford IJ. Development of a spectrophotometric assay for measuring the activity of NADH: cytochrome b5 reductase in human tumour cells〔J〕 . Br J Cancer, 1996;74:1188- 1193.
〔7〕 Hodnick WF, Sartorelli AC. Reductive activation of mitomycin C by NADH: cytochrome b5 reductase〔J〕 . Cancer Res, 1993;53:4907- 4912.
收稿日期：1999-03-04
修回日期：1999-05-19, 百拇医药