不同种系动物诱导实验性变态反应性脑脊髓炎模型的研究
作者：彭聿平 邱一华 程纯 戴丽 黄慧伟
单位：南通医学院生理学教研室，南通 226001
关键词：实验性变态反应性脑脊髓炎；SD大鼠；Wistar大鼠；昆明种小鼠
南通医学院学报000109[摘 要] 目的：探索国内不同种系动物诱发实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的可能性，寻找诱导EAE的合适实验动物，以推进国内临床神经免疫学的研究。方法：用含异种动物脊髓的完全弗氏佐剂乳化物作为抗原，进行动物背部皮下多点注射，观察和比较动物的神经症状和病理变化。结果：(1)抗原诱导EAE，如果发病，一般都在注射抗原2周后开始出现症状，在注射后19天左右症状最明显，且脑组织出现明显的炎性病理变化。(2)SD大鼠的发病率为13%，Wistar大鼠的发病率为30%，昆明种(KM)小鼠的发病率为0。(3)未发病的Wistar大鼠再次注射抗原，观察2个月，仍未发病。结论：利用Wistar大鼠制备EAE动物模型在国内较适宜，而EAE发病的个体差异可能主要受遗传基因的控制。
, 百拇医药
[中图分类号] R593.1 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0022-02
STUDY OF VARIOUS KINDS OF ANIMALS INDUCING EXPERIMENTAL
ALLERGIC ENCEPHALOMYELITIS
PENG Yuping QIU Yihua CHENG Chun DAI Li HUANG Huiwei
(Department of Physiology, Nantong Medical College, Nantong 226001)
[Abstract] Objective: Experimental allergic encephalomyelitis (EAE), a T-cell mediated autoimmune disease, is widely considered as an animal model of multiple sclerosis. Various kinds of animals were used to induce EAE in order to search a domestic rat with high EAE incidence. Methods: Various kinds of animals were injected in 5 to 6 locations of the back of the body 0.5 ml with the guinea pig spinal cord in Freund's complete adjuvant and observed the clinical symptoms and histological alterations. Results:(1) The clinical symptoms of EAE of SD and Wistar rat occurred in two weeks after the rats were injected with antigens, the peak of the clinical symptoms and histological alterations on the 19th days.(2) The SD rat incidence of EAE was 13%, Wistar rat incidence of the disease was 30% and Kunming mouse incidence of the disease was 0%.(3) The Wistar rats without coming on EAE were secondly injected the antigen and observed for two months, EAE having still not occurrence.Conclusion: Wistar rat may be a fitter animal inducing EAE model in domestic usual experimental animals. The rat individual differences of EAE incidence may be mainly controlled by hereditary genes.
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[Key words] experimental allergic encephalomyelitis; Sprague-Dawley rat; Wistar rat; Kunming mouse
实验性变态反应性脑脊髓炎 (experimental allergic encephalomyelitis, EAE) 是经典的以细胞免疫损伤为主的自身免疫性疾病的动物模型，在临床神经免疫学的研究中具有很重要的意义[1]。国外30年代就有学者用异种脑组织匀浆给动物注射，成功地制备了EAE动物模型。后经一段时间的研究发现，不同种属动物或同一种属不同品系动物诱发EAE的敏感性不同。经过多年的探索，国外研究者发现，Lewis大鼠的EAE诱发率最高，最适宜制备EAE动物模型，用来研究许多神经系统疾病的发病机理和防治措施[2]。但由于国内没有Lewis大鼠品系，利用其它动物制备EAE模型的报道有一些，例如用豚鼠，但由于豚鼠不常用作实验对象，所以国内这方面的研究要比国外落后些。鉴于上述原因，我们选用国内常用SD大鼠、Wistar大鼠和昆明种(KM)小鼠来制备EAE动物模型，以寻找诱发EAE阳性率较高的动物品系，旨在较好的利用国内条件制备EAE的动物模型。
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1 材料与方法
1.1 动物来源 SD大鼠体重180～220g，豚鼠体重300～350g，昆明种小鼠体重20～25g，由南通医学院实验动物中心提供。Wistar大鼠体重180～230g，由上海医科大学实验动物中心提供。以上动物均雌雄兼用。
1.2 抗原佐剂乳化物的制备 无菌取出豚鼠脊髓，剥去周围包膜，称重，按重量体积比加入生理盐水制成浓度为50%的脊髓匀浆，此匀浆再与完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,购自Sigma公司)等量混合，并用注射器反复抽打，最终制成油包水的乳剂。
1.3 EAE的诱导 实验动物背部皮肤常规消毒后，进行皮下多点注射(5～6点)抗原佐剂乳化物，剂量：大鼠0.5ml，小鼠0.2ml。注射后动物单笼饲养，给予自由进食和饮水，并每日观察动物的饮食、活动和体重等情况。
, http://www.100md.com 1.4 EAE神经症状分级 根据Kono等人[3]的标准略加修改，定为0～5级。0级：无异常，1级：尾巴麻痹，2级：后肢无力，3级：后肢瘫痪，4级：后肢和前肢均瘫痪，或人为翻身后不能复位，5级：动物死亡。
1.5 EAE病理标本制备 分别断头处死各种EAE症状级别的大鼠，取其脑和脊髓固定在10%甲醛液中，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋和切片。切片后烘干、脱蜡和HE染色。
2 结 果
2.1 首次注射抗原诱导EAE的发病情况 抗原诱导EAE，如果发病，一般都在首次注射抗原佐剂乳化物两周后开始出现症状。在注射后19天左右症状最明显，表现为进食减少，体重减轻，尾巴拖地不能抬起，后肢无力和跛行，直至后肢完全瘫痪。但抗原诱导的EAE均未出现4级和5级的症状。症状持续5天左右后逐步缓解，2周后完全恢复正常。如果首次注射抗原3周后未出现EAE症状，不再发病。
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2.2 EAE大鼠中枢神经系统的病理改变 在EAE3级症状的中枢神经系统中，可观察到脑血管周围明显的炎性细胞浸润，构成袖套征(见图1)；中性粒细胞浸入神经细胞内构成噬神经细胞现象；在变性的神经细胞周围有增生的少突胶质细胞围绕构成卫星现象(见图2)；以及变性坏死的神经细胞出现核溶解和核固缩等典型的脑炎症状。
图1 EAE大鼠脑组织的袖套征现象(3.3×20)
图2 EAE大鼠脑组织中的卫星现象(3.3×40)
2.3 各种动物诱发EAE的比较 用抗原佐剂乳化物分别给SD大鼠、Wistar大鼠和KM小鼠进行背部注射。结果见表1。 表1 各种动物诱发EAE的结果
动 物
n
神经症状分级
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发病率
(%)
0级
1级
2级
3级
SD大鼠
Wistar大鼠
KM小鼠
23
10
8
20
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7
8
1
1
0
0
1
0
2
1
0
3(13)
3(30)
0(0)
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2.4 二次注射抗原对Wistar大鼠诱发EAE的作用 选用首次注射抗原后未能发生EAE的Wistar大鼠7只，在首次注射后3周再给予抗原佐剂乳化物0.5 ml 进行腹部皮下多点注射。注射后观察2个月，均未发生EAE。
3 讨 论
用大鼠制备EAE，具有许多优点，如大鼠品系多，选择余地大，在同一品系中个体间差异较小， 繁殖快，饲养方便等，更重要的是鼠EAE的临床症状和病理变化与人类脱髓鞘病较为相似。由于国内没有Lewis大鼠品系，我们设想利用国内现有的条件，探讨国内常用的鼠类品系诱发EAE的可能性，并比较其发病率的高低。已有报道，诱导EAE的注射途径有皮下、皮内、肌肉、腹腔和静脉多种，其中以皮下多点注射发病率最高[4]。我们实验室以前的工作表明，诱导鼠类产生EAE的异种抗原，以新鲜豚鼠脊髓制备的抗原佐剂乳化物为最好，而且在一定范围内，注射抗原佐剂乳化物的剂量越大，EAE的发病率越高。据此，我们采用豚鼠脊髓佐剂乳化物作为抗原，给SD大鼠和Wistar大鼠0.5ml，KM小鼠0.2ml背部皮下多点注射，制备EAE模型。
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结果表明，在使用同一抗原佐剂乳化物的条件下，SD大鼠EAE的发病率为13%，Wistar大鼠的EAE发病率为30%，KM小鼠EAE的发病率为0%。提示鼠类不同品系诱发EAE具有明显的差异，其中Wistar大鼠的诱发率最高，比较适宜用来制备EAE动物模型。但其发病率尚较低，我们给未发病的Wistar大鼠二次注射抗原，2个月后仍未出现EAE症状。已有报道，EAE的发病，主要是由于异种动物脊髓中的髓鞘蛋白与T细胞表面的髓鞘蛋白受体结合，激活免疫系统，损伤自身神经组织，产生脑炎，而T细胞表面髓鞘蛋白受体的表达能力受EAE敏感基因的调控。因此，T细胞表面的髓鞘蛋白受体的表达能力不同是动物对EAE敏感性差别的重要原因。我们给未发病的Wistar大鼠二次诱导，仍未出现EAE症状，也间接说明EAE发病，主要受遗传基因的控制。
在本实验中，尽管Wistar大鼠的EAE诱发率最高，但其发病率尚较低，与临床神经免疫学研究的要求仍有一定的差距。最近，有报道说明EAE的发病还与动物的血脑屏障的形成有关[5]，提示改变注射抗原的时间可能会提高EAE的发病率，我们将在这方面作进一步探讨。
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[参考文献]
[1] Sandy KR. Influence of the pineal gland on the expression of experimental allergic encephalomyelitis[J]. Int J Neurosci, 1997, 90∶129.
[2] Slavin DA, Bucher AE, Degano AL, Soria NW, Roth GA.Time course of biochemical and immunohistological alterations during experimental allergic encephalomyelitis[J]. Neurochem Int, 1996, 29∶597.
[3] Kono RH. Two minor determinant of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice[J]. J Exp Med, 1988, 168∶213.
, 百拇医药
[4] Funjinami RS, Paterson PY. Induction of experimental allergic encephalomyelitis in suckling Lewis rats: role of age and type of sensitizing neuroantigen[J]. J Immunol, 1977, 119∶1634.
[5] Degano AL,Bucher AE,Roth GA. Suppression of acute experimental allergic encephalomyelitis by intraperitoneal administration of synaptosomal antigens[J]. J Neurosci Res, 1998, 53∶187.
(1999-10-25收稿), 百拇医药
单位：南通医学院生理学教研室，南通 226001
关键词：实验性变态反应性脑脊髓炎；SD大鼠；Wistar大鼠；昆明种小鼠
南通医学院学报000109[摘 要] 目的：探索国内不同种系动物诱发实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的可能性，寻找诱导EAE的合适实验动物，以推进国内临床神经免疫学的研究。方法：用含异种动物脊髓的完全弗氏佐剂乳化物作为抗原，进行动物背部皮下多点注射，观察和比较动物的神经症状和病理变化。结果：(1)抗原诱导EAE，如果发病，一般都在注射抗原2周后开始出现症状，在注射后19天左右症状最明显，且脑组织出现明显的炎性病理变化。(2)SD大鼠的发病率为13%，Wistar大鼠的发病率为30%，昆明种(KM)小鼠的发病率为0。(3)未发病的Wistar大鼠再次注射抗原，观察2个月，仍未发病。结论：利用Wistar大鼠制备EAE动物模型在国内较适宜，而EAE发病的个体差异可能主要受遗传基因的控制。
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[中图分类号] R593.1 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0022-02
STUDY OF VARIOUS KINDS OF ANIMALS INDUCING EXPERIMENTAL
ALLERGIC ENCEPHALOMYELITIS
PENG Yuping QIU Yihua CHENG Chun DAI Li HUANG Huiwei
(Department of Physiology, Nantong Medical College, Nantong 226001)
[Abstract] Objective: Experimental allergic encephalomyelitis (EAE), a T-cell mediated autoimmune disease, is widely considered as an animal model of multiple sclerosis. Various kinds of animals were used to induce EAE in order to search a domestic rat with high EAE incidence. Methods: Various kinds of animals were injected in 5 to 6 locations of the back of the body 0.5 ml with the guinea pig spinal cord in Freund's complete adjuvant and observed the clinical symptoms and histological alterations. Results:(1) The clinical symptoms of EAE of SD and Wistar rat occurred in two weeks after the rats were injected with antigens, the peak of the clinical symptoms and histological alterations on the 19th days.(2) The SD rat incidence of EAE was 13%, Wistar rat incidence of the disease was 30% and Kunming mouse incidence of the disease was 0%.(3) The Wistar rats without coming on EAE were secondly injected the antigen and observed for two months, EAE having still not occurrence.Conclusion: Wistar rat may be a fitter animal inducing EAE model in domestic usual experimental animals. The rat individual differences of EAE incidence may be mainly controlled by hereditary genes.
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[Key words] experimental allergic encephalomyelitis; Sprague-Dawley rat; Wistar rat; Kunming mouse
实验性变态反应性脑脊髓炎 (experimental allergic encephalomyelitis, EAE) 是经典的以细胞免疫损伤为主的自身免疫性疾病的动物模型，在临床神经免疫学的研究中具有很重要的意义[1]。国外30年代就有学者用异种脑组织匀浆给动物注射，成功地制备了EAE动物模型。后经一段时间的研究发现，不同种属动物或同一种属不同品系动物诱发EAE的敏感性不同。经过多年的探索，国外研究者发现，Lewis大鼠的EAE诱发率最高，最适宜制备EAE动物模型，用来研究许多神经系统疾病的发病机理和防治措施[2]。但由于国内没有Lewis大鼠品系，利用其它动物制备EAE模型的报道有一些，例如用豚鼠，但由于豚鼠不常用作实验对象，所以国内这方面的研究要比国外落后些。鉴于上述原因，我们选用国内常用SD大鼠、Wistar大鼠和昆明种(KM)小鼠来制备EAE动物模型，以寻找诱发EAE阳性率较高的动物品系，旨在较好的利用国内条件制备EAE的动物模型。
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1 材料与方法
1.1 动物来源 SD大鼠体重180～220g，豚鼠体重300～350g，昆明种小鼠体重20～25g，由南通医学院实验动物中心提供。Wistar大鼠体重180～230g，由上海医科大学实验动物中心提供。以上动物均雌雄兼用。
1.2 抗原佐剂乳化物的制备 无菌取出豚鼠脊髓，剥去周围包膜，称重，按重量体积比加入生理盐水制成浓度为50%的脊髓匀浆，此匀浆再与完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,购自Sigma公司)等量混合，并用注射器反复抽打，最终制成油包水的乳剂。
1.3 EAE的诱导 实验动物背部皮肤常规消毒后，进行皮下多点注射(5～6点)抗原佐剂乳化物，剂量：大鼠0.5ml，小鼠0.2ml。注射后动物单笼饲养，给予自由进食和饮水，并每日观察动物的饮食、活动和体重等情况。
, http://www.100md.com 1.4 EAE神经症状分级 根据Kono等人[3]的标准略加修改，定为0～5级。0级：无异常，1级：尾巴麻痹，2级：后肢无力，3级：后肢瘫痪，4级：后肢和前肢均瘫痪，或人为翻身后不能复位，5级：动物死亡。
1.5 EAE病理标本制备 分别断头处死各种EAE症状级别的大鼠，取其脑和脊髓固定在10%甲醛液中，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋和切片。切片后烘干、脱蜡和HE染色。
2 结 果
2.1 首次注射抗原诱导EAE的发病情况 抗原诱导EAE，如果发病，一般都在首次注射抗原佐剂乳化物两周后开始出现症状。在注射后19天左右症状最明显，表现为进食减少，体重减轻，尾巴拖地不能抬起，后肢无力和跛行，直至后肢完全瘫痪。但抗原诱导的EAE均未出现4级和5级的症状。症状持续5天左右后逐步缓解，2周后完全恢复正常。如果首次注射抗原3周后未出现EAE症状，不再发病。
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2.2 EAE大鼠中枢神经系统的病理改变 在EAE3级症状的中枢神经系统中，可观察到脑血管周围明显的炎性细胞浸润，构成袖套征(见图1)；中性粒细胞浸入神经细胞内构成噬神经细胞现象；在变性的神经细胞周围有增生的少突胶质细胞围绕构成卫星现象(见图2)；以及变性坏死的神经细胞出现核溶解和核固缩等典型的脑炎症状。
图1 EAE大鼠脑组织的袖套征现象(3.3×20)
图2 EAE大鼠脑组织中的卫星现象(3.3×40)
2.3 各种动物诱发EAE的比较 用抗原佐剂乳化物分别给SD大鼠、Wistar大鼠和KM小鼠进行背部注射。结果见表1。 表1 各种动物诱发EAE的结果
动 物
n
神经症状分级
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发病率
(%)
0级
1级
2级
3级
SD大鼠
Wistar大鼠
KM小鼠
23
10
8
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7
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3(13)
3(30)
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2.4 二次注射抗原对Wistar大鼠诱发EAE的作用 选用首次注射抗原后未能发生EAE的Wistar大鼠7只，在首次注射后3周再给予抗原佐剂乳化物0.5 ml 进行腹部皮下多点注射。注射后观察2个月，均未发生EAE。
3 讨 论
用大鼠制备EAE，具有许多优点，如大鼠品系多，选择余地大，在同一品系中个体间差异较小， 繁殖快，饲养方便等，更重要的是鼠EAE的临床症状和病理变化与人类脱髓鞘病较为相似。由于国内没有Lewis大鼠品系，我们设想利用国内现有的条件，探讨国内常用的鼠类品系诱发EAE的可能性，并比较其发病率的高低。已有报道，诱导EAE的注射途径有皮下、皮内、肌肉、腹腔和静脉多种，其中以皮下多点注射发病率最高[4]。我们实验室以前的工作表明，诱导鼠类产生EAE的异种抗原，以新鲜豚鼠脊髓制备的抗原佐剂乳化物为最好，而且在一定范围内，注射抗原佐剂乳化物的剂量越大，EAE的发病率越高。据此，我们采用豚鼠脊髓佐剂乳化物作为抗原，给SD大鼠和Wistar大鼠0.5ml，KM小鼠0.2ml背部皮下多点注射，制备EAE模型。
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结果表明，在使用同一抗原佐剂乳化物的条件下，SD大鼠EAE的发病率为13%，Wistar大鼠的EAE发病率为30%，KM小鼠EAE的发病率为0%。提示鼠类不同品系诱发EAE具有明显的差异，其中Wistar大鼠的诱发率最高，比较适宜用来制备EAE动物模型。但其发病率尚较低，我们给未发病的Wistar大鼠二次注射抗原，2个月后仍未出现EAE症状。已有报道，EAE的发病，主要是由于异种动物脊髓中的髓鞘蛋白与T细胞表面的髓鞘蛋白受体结合，激活免疫系统，损伤自身神经组织，产生脑炎，而T细胞表面髓鞘蛋白受体的表达能力受EAE敏感基因的调控。因此，T细胞表面的髓鞘蛋白受体的表达能力不同是动物对EAE敏感性差别的重要原因。我们给未发病的Wistar大鼠二次诱导，仍未出现EAE症状，也间接说明EAE发病，主要受遗传基因的控制。
在本实验中，尽管Wistar大鼠的EAE诱发率最高，但其发病率尚较低，与临床神经免疫学研究的要求仍有一定的差距。最近，有报道说明EAE的发病还与动物的血脑屏障的形成有关[5]，提示改变注射抗原的时间可能会提高EAE的发病率，我们将在这方面作进一步探讨。
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[参考文献]
[1] Sandy KR. Influence of the pineal gland on the expression of experimental allergic encephalomyelitis[J]. Int J Neurosci, 1997, 90∶129.
[2] Slavin DA, Bucher AE, Degano AL, Soria NW, Roth GA.Time course of biochemical and immunohistological alterations during experimental allergic encephalomyelitis[J]. Neurochem Int, 1996, 29∶597.
[3] Kono RH. Two minor determinant of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice[J]. J Exp Med, 1988, 168∶213.
, 百拇医药
[4] Funjinami RS, Paterson PY. Induction of experimental allergic encephalomyelitis in suckling Lewis rats: role of age and type of sensitizing neuroantigen[J]. J Immunol, 1977, 119∶1634.
[5] Degano AL,Bucher AE,Roth GA. Suppression of acute experimental allergic encephalomyelitis by intraperitoneal administration of synaptosomal antigens[J]. J Neurosci Res, 1998, 53∶187.
(1999-10-25收稿), 百拇医药