CTLA4-lg融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究
作者：郑宇 沈倍奋 黎燕 舒翠玲 胡美茹 裴武红 王建安
单位：郑宇 沈倍奋 黎燕 舒翠玲 胡美茹 裴武红 王建安(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)
关键词：CTLA4；CTLA4-Ig；克隆；表达
细胞与分子免疫学杂志000104
摘要：目的获得CTLA4全长基因并在真核表达系统中表达。方法通过RTPCR方法，从MT2细胞系克隆CTLA4全长基因；经引物重叠和半巢式PCR改造，获得含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段DNA，然后克隆至真核表达载体pIg，转染COS和CHOK细胞表达。结果获得了CTLA4全长基因，序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。在COS和CHO-K细胞培养上清中有CTLA4-Ig的表达，该产物能抑制淋巴细胞转化。结论真核表达体系表达了有生物学活性的CTLA4-Ig。
, 百拇医药
中图号：Q78 文献标识码:A
文章编号:1007-8738(2000)01-0014-17
Expression and biological activities of CTLA4-Ig fusion protein
ZHENG Yu, SHEN Beifeng, LI Yan， SHU Cuiling, HU Meiru, PEI Wuhong, WANG Jianan
Institute of Basic Medical Sciences, Acadamy of Military Medical Sciences, Beijing 100850， China
Abstract: Aim To obtain and express the CTLA4 gene in eukaryocytes. Methods The full gene of the CTLA4 was amplified from MT2 cell lines by RT-PCR, reformed with an overlapping primers and nested primers, then cloned into the expression vector pIg, consequently, the CTLA4-Ig was expressed in the COS and CHO-K after transfection with pIg-CTLA4. Results Sequencing data indicated that the CTLA4 gene was exactly identical to the sequence in the GenBank. The CTLA4-Ig was expressed in the COS and CHO-K and it blocked the lymphocyte transformation. Conclusion The CTLA4Ig with biological activity was expressed in the eukaryotic system.
, 百拇医药
Keywords: CTLA4；CTLA4-Ig； clone; expression
即溶细胞性T细胞相关抗原4(CTLA4)，是表达在活化T细胞表面的标志分子之一。研究表明，CTLA4是维持体内T细胞稳定的负调控因子，能抑制活化T细胞的增殖，与CD28是一对重要的免疫调控因子〔1〕。目前，CTLA4被作作为一种免疫抑制受体，对临床移植排斥反应有明显的抑制作用〔2，3〕。因此，我们克隆了CTLA4的全长cDNA，并表达了CTLA4与人IgGγ链的融合蛋白。
1 材料和方法
1.1 主要材料MT2细胞株为本室保存。小量DNA纯化试剂盒购自Clontech公司。表达载体pIg由孙凯博士赠送。内切酶购自Biolab公司。RNA提取试剂盒与连接酶购自Gibco公司。载体pGEM购自Promega公司。所用引物P1～P5，均为本室全自动DNA合成仪合成。
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1.2 细胞总RNA的提取复苏MT2细胞，培养至对数生长期。参照试剂盒说明书提取RNA。最后，将RNA沉淀溶于20μL无RNA酶的水中，测定A280及A260并定量。
1.3 RT-PCR取含1μgRNA的溶液，分别加入5×buffer4μL、Oligo(dT)2μL及10mmol/LdNTP8μL，95℃变性2min后卒冷2min。加RNasin1μL，反转录酶5U～10U，42℃保温1h，产物即为cDNA第1链。然后在50μL反应体系中，分别加入cDNA第1链4μL，10×PCRbuffer5μL，P1和P2引物各2μL，2.5mmol/LdNTP4μL，H2O34μL，95℃变性10min，加Taq酶1U～2U。循环参数为：94℃45s，55℃45s，72℃45s，共35次循环，最后于72℃延伸10min〔4〕。
1.4 RT-PCR产物的回收、克隆及序列测定用Clontech公司的小量DNA纯化试剂盒，从琼脂糖凝胶中回收预期产物，并参照载体pGEM使用说明书连入载体pGEM中。酶切鉴定正确后，用全自动DNA测序仪测序。
, 百拇医药
1.5 CTLA4基因的改构用引物P3、P4和P5，通过引物重叠和半套式PCR两次，获得含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外片段〔3〕。
1.6 CTLA4-Ig表达载体的构建将改造后的目的基因，经限制性内切酶EcoRV和BamHI消化后，连接至经相同内切酶处理的真核表达载体pIg中，酶切鉴定。PCR产物及载体的酶切、克隆及阳性重组子的鉴定，具体操作方法参见《分子克隆》一书〔5〕。
1.7 细胞培养与转染调整CHO-K细胞至对数生长期。预先配制下述溶液：在100μL无血清、无抗生素的DMEM中，加入表达质粒DNA5μg，混匀备用；在100μL无血清、无抗生素的DMEM中，加入20μL脂质体，混匀。将上述两种溶液混匀，滴加在欲转染的细胞表面，于37℃、5%CO2条件下培养5h～12h，换有血清的培养液。24h后，换无血清的DMEM培养48h～72h，收集上清〔6〕。
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1.8 免疫印迹检测目的蛋白的表达将培养上清直接进行SDS-PAGE后，用抗人IgGFd片段和抗人CTLA4的mAb，做蛋白印迹检测CTLA4-Ig。
1.9 CTLA4-Ig生物学活性的检测采用MTT法，测定CTLA4-Ig对正常人外周血中淋巴细胞转化的影响。
2 结果
2.1 CTLA4基因的克隆与测序根据GenBank数据库中CTLA4的序列，设计并合成了引物P1和P2，引物的序列如下：
P1：5′GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTG3′
P2：5′TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAA-ATAAGGCTG3′
, 百拇医药 从MT2细胞中提取总RNA，经甲醛变性电泳检测，表明RNA未降解。用Oligo(dT)反转录得到CTLA4cDNA；用引物P1和P2，经PCR扩增后，获得CTLA4的全长基因。琼脂糖凝胶电泳可见1条约560bp的单一扩增条带，与预期的大小一致。同时，用胞外段下游引物P5与上游引物P3扩增出460bp的片段，与预期的大小一致(图1)。酶切鉴定表明，所得产物为CTLA4基因。回收该产物，插入载体pGEM，鉴定正确的重组质粒，命名为pGEM-CTLA4。对该质粒测序表明，在克隆基因的272位，与GenBank中的序列不同，由C变为T。GenBank数据库中已经提及这种变化，认为可能是等位基因的缘故。
图1 RT-PCR扩增的CTLA4基因产物的电泳图谱
Fig 1 Electrophoresis of products of CTLA4 gene amplified by RT-PCR
, 百拇医药
1:PBR322/BstNI marker;2:CTLA4 gene;3:Extracellular domain of CTLA4
2.2 CTLA4表达质粒的构建(图2)由于CTLA4基因的信号肽序列不明确，为表达该基因的胞外段，需要引入抑瘤素M的信号肽〔3〕，并为适合pIg质粒的要求，在胞外段下游引物P5中，引入了表达载体要求提供的剪切供体ACTTACCTGT。引物的序列如下：
P3:5′GGGGATATCCACCATGGGTGTACTGCTCACACAGAGG-ACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC3′
P4:5′CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAGCATGGCG-AGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC3′
P5:5′GCGGATCCACTTACCTGTAGAATCTGGGCACGG3′
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图2 重组质粒pIg-CTLA4的构建
Fig2 Construction of recombinanat plasmid pIg-CTLA4
用P4和P5引物，经半套式PCR扩增后，再用P3和P5引物，做引物重叠PCR，对CTLA4基因改构，获得抑瘤素M信号肽和CTLA4胞外段的融合基因。回收该产物，将其连入载体pGEM中，经EcoRI酶切鉴定正确的重组质粒命名为pGEM-OMCTLA4。PCR产物经限制性内切酶EcoRV和BamHI酶切及电泳回收，连接至经相同酶切的表达载体pIg。该载体含有可融合的人IgG1Fc，并要求欲表达的基因含剪切供体，其自身带有剪切受体。经酶切鉴定后，命名为pIg-CTLA4(图3)。
图3 重组质粒pGEM-OMCTLA4与pIg-CTLA4的酶切鉴定
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Fig3 Restriction emzyme analysis of recombinant plasmid pGEM-OMCTLA4 and pIg-CTLA4
1: DNA Marker, λ DNA/Hind III； 2： pIg-CTLA4/Hind III和 BamH I; 3:pGEM-OMCTLA4/EcoR I.
2.3 CTLA4基因的表达及表达产物的鉴定提取重组质粒pIg-CTLA4，转染COS7和CHO-K细胞。提取转染并经G418筛选的细胞基因组DNA，通过PCR扩增表明，确实将pIg-CTLA4转入表达细胞。收集表达上清，用抗人IgGFcmAb和抗人CTLA4mAb，通过免疫印迹证明，在暂时性表达载体pIg中获得表达(图4)。
图4 CTLA4-Ig表达产物的免疫印迹鉴定
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Fig 4 Western blot analysis of CTLA4-Ig ecpression product
A:IgG Fc assay using anti-IgG Fc mAb; B:CTLA4 assay using anti-CTLA4 mAb;1,2:Supernatant of cells transfected with pIg-CTLA4 and pIg, respectively; 3:Supernatant of CHO-K cells.
2.4 CTLA4-Ig表达上清的活性检测用MTT法检测了CTLA4-Ig表达上清对PHA刺激的人外周血淋巴细胞转化的影响。结果表明，表达上清与pIg空载体对照上清相比较，能明显抑制PHA对淋巴细胞的转化，即可阻断T细胞的活化(图5)。
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图5 CTLA4-Ig表达上清对PHA刺激T细胞转化的影响
Fig 5 Effect of CTLA4-Ig expression supernaatant on lympho-
cyte transformation stimulated by PHA
3 讨论
TCR与MHCII类分子和抗原作用提供的第1信号，以及辅助分子与其配体作用产生的第2信号，是细胞免疫应答的基础。其中公认的共刺激信号是由CD28与B7的相互作用而产生的。CD28分子属Ig超家族成员，包括CD28与CTLA4，二者共享配体B7，构成了精密调控免疫应答的开关〔7〕。CTLA4是维持体内免疫稳态的负调控因子，对该分子的研究有助于阐明许多重要的免疫机制。目前研究表明，CTLA4-IgG和CTLA4-IgM分子能抑制免疫排斥反应，使机体形成耐受，这不仅为临床组织和器官的移植提供了新的治疗方案，而且有望成为解决基因治疗中细胞表达被排斥这难题的辅助药物〔8，9〕。另外，抗CTLA4抗体还能够有效地用于抗肿瘤治疗。因此，我们克隆了CTLA4基因，并表达了融合蛋白CTLA4-Ig。
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基因的表达体系有原核与真核表达。原核表达虽产量高，但产物的复性差、活性低，且CTLA4基因中含较多的稀有密码子，不利于原核表达；而真核表达则需要考虑信号肽及表达的类型。CTLA4分子在T细胞中的表与分布非常特殊，绝大多数分子表达在胞内，且呈极性分布于高尔基体的成熟面，而对胞内段改构能使该分子由胞内表达变为胞外分泌性表达〔10〕。因此，表达该分子的首选策略是构建一种融合蛋白，以改变其表达和分布的限制性，使之能够由胞内分泌性表达到胞外。由于CTLA4基因的信号肽不清楚，我们设计并合成了抑瘤素M的信号肽P3和P4；加之，该分子在一般载体中很难表达，因而选用带人IgG1Fc段的表达载体pIg，并根据载体要求，设计了CTLA4胞外段下游引物P5，引入了剪切供体。这样，可使CTLA4分泌性表达于培养上清，便于用proteinA亲和层析纯化。同时，表达的融合蛋白本身是一种免疫粘附分子，利用免疫粘附分子在体内代谢较慢的优势，有利于观察其体内的效应。
构建表达的CTLA4-Ig，由于与Fc段的连接在铰链区，不影响融合的两部分正确折叠，也不影响CTLA4与B7分子的高亲和力结合。这种高亲和力是由CTLA4胞外段远膜端3个互补决定区(CDR)中CDR1和CDR3区的非保守性氨基酸所决定的〔11〕。因此，CTLA4-Ig可作为CD28的竞争性抑制剂，研究CD28与B7分子的作用。
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我们成功地利用载体pIg表达了融合蛋白CTLA4-Ig，并通过测定表达上清对淋巴细胞转化的影响，证明了该表达产物的活性，为进一步研究该蛋白对淋巴细胞功能的影响打下了基础。
基金项目：国家八六三计划生物技术资助，No.102-09-01-03
作者简介：郑宇，男，32岁，博士北京市太平路27号，Tel.01066931327
参考文献：
〔1〕 Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al.Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in CTLA4〔J〕 . Science, 1995;270:985- 988.
, http://www.100md.com 〔2〕 Steurer W, Nickerson PW, Steele AW, et al. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes grafts tolerance〔J〕 . J Immunol, 1995;1;155(3):1165- 1174.
〔3〕 Hale DA, Gottschalk R, Maki T, et al. Use of CTLA4-Ig in combination with conventional immunosuppressive agents to prolong allograft survival〔J〕 . Transplantation, 1997; 27; 64(6):897- 900.
〔4〕 Linsley PS, Brady W, Urnes M, et al. CTLA4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7〔J〕 . J Exp Med, 1991; 174:561- 569.
, 百拇医药
〔5〕 金冬燕黎孟枫,等译.分子克隆实验指南〔M〕.第2版，北京：科学出版社. 1992:34-55.
〔6〕 Linsley P, Brady W, Grosmaire L, et al. Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation〔J〕 . J Exp Med, 1991; 173:721- 730.
〔7〕 Chambers CA, Krummel MF, Boitel B, et al.The role of the CTLA4 in the regulation and initiation of T cell responses〔J〕 . Immunol Rev,1996; 153:27- 46.
, 百拇医药
〔8〕 Paillard F. Adenoviral vector persis tence in vivo with a soluble of CTLA4〔J〕 . Hum Gene Ther, 1998; 10(12):1699- 1700.
〔9〕 Walter J, High KA. Gene therapy for the hemophilias〔J〕 . Adv Vet Med, 1997； 119- 134.
〔10〕 Leung HT, Bradyshow J, Cleaveland JS, et al. Cytotoxic T lymphocyte associated molecular location motif in its cytoplasmic tail〔J〕 . J Biol Chem, 1995;270:25107- 25114.
〔11〕 Peach RT, Bajorath J, Brady W, et al. Complementarity determing region(CDR1)-CDR3-analogous regions in CTLA4 and CD28 determine binding to B7〔J〕 . J Exp Med, 1994; 180:2049- 2058.
收稿日期：1999-02-12
修回日期：1999-05-04, http://www.100md.com
单位：郑宇 沈倍奋 黎燕 舒翠玲 胡美茹 裴武红 王建安(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)
关键词：CTLA4；CTLA4-Ig；克隆；表达
细胞与分子免疫学杂志000104
摘要：目的获得CTLA4全长基因并在真核表达系统中表达。方法通过RTPCR方法，从MT2细胞系克隆CTLA4全长基因；经引物重叠和半巢式PCR改造，获得含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段DNA，然后克隆至真核表达载体pIg，转染COS和CHOK细胞表达。结果获得了CTLA4全长基因，序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。在COS和CHO-K细胞培养上清中有CTLA4-Ig的表达，该产物能抑制淋巴细胞转化。结论真核表达体系表达了有生物学活性的CTLA4-Ig。
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中图号：Q78 文献标识码:A
文章编号:1007-8738(2000)01-0014-17
Expression and biological activities of CTLA4-Ig fusion protein
ZHENG Yu, SHEN Beifeng, LI Yan， SHU Cuiling, HU Meiru, PEI Wuhong, WANG Jianan
Institute of Basic Medical Sciences, Acadamy of Military Medical Sciences, Beijing 100850， China
Abstract: Aim To obtain and express the CTLA4 gene in eukaryocytes. Methods The full gene of the CTLA4 was amplified from MT2 cell lines by RT-PCR, reformed with an overlapping primers and nested primers, then cloned into the expression vector pIg, consequently, the CTLA4-Ig was expressed in the COS and CHO-K after transfection with pIg-CTLA4. Results Sequencing data indicated that the CTLA4 gene was exactly identical to the sequence in the GenBank. The CTLA4-Ig was expressed in the COS and CHO-K and it blocked the lymphocyte transformation. Conclusion The CTLA4Ig with biological activity was expressed in the eukaryotic system.
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Keywords: CTLA4；CTLA4-Ig； clone; expression
即溶细胞性T细胞相关抗原4(CTLA4)，是表达在活化T细胞表面的标志分子之一。研究表明，CTLA4是维持体内T细胞稳定的负调控因子，能抑制活化T细胞的增殖，与CD28是一对重要的免疫调控因子〔1〕。目前，CTLA4被作作为一种免疫抑制受体，对临床移植排斥反应有明显的抑制作用〔2，3〕。因此，我们克隆了CTLA4的全长cDNA，并表达了CTLA4与人IgGγ链的融合蛋白。
1 材料和方法
1.1 主要材料MT2细胞株为本室保存。小量DNA纯化试剂盒购自Clontech公司。表达载体pIg由孙凯博士赠送。内切酶购自Biolab公司。RNA提取试剂盒与连接酶购自Gibco公司。载体pGEM购自Promega公司。所用引物P1～P5，均为本室全自动DNA合成仪合成。
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1.2 细胞总RNA的提取复苏MT2细胞，培养至对数生长期。参照试剂盒说明书提取RNA。最后，将RNA沉淀溶于20μL无RNA酶的水中，测定A280及A260并定量。
1.3 RT-PCR取含1μgRNA的溶液，分别加入5×buffer4μL、Oligo(dT)2μL及10mmol/LdNTP8μL，95℃变性2min后卒冷2min。加RNasin1μL，反转录酶5U～10U，42℃保温1h，产物即为cDNA第1链。然后在50μL反应体系中，分别加入cDNA第1链4μL，10×PCRbuffer5μL，P1和P2引物各2μL，2.5mmol/LdNTP4μL，H2O34μL，95℃变性10min，加Taq酶1U～2U。循环参数为：94℃45s，55℃45s，72℃45s，共35次循环，最后于72℃延伸10min〔4〕。
1.4 RT-PCR产物的回收、克隆及序列测定用Clontech公司的小量DNA纯化试剂盒，从琼脂糖凝胶中回收预期产物，并参照载体pGEM使用说明书连入载体pGEM中。酶切鉴定正确后，用全自动DNA测序仪测序。
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1.5 CTLA4基因的改构用引物P3、P4和P5，通过引物重叠和半套式PCR两次，获得含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外片段〔3〕。
1.6 CTLA4-Ig表达载体的构建将改造后的目的基因，经限制性内切酶EcoRV和BamHI消化后，连接至经相同内切酶处理的真核表达载体pIg中，酶切鉴定。PCR产物及载体的酶切、克隆及阳性重组子的鉴定，具体操作方法参见《分子克隆》一书〔5〕。
1.7 细胞培养与转染调整CHO-K细胞至对数生长期。预先配制下述溶液：在100μL无血清、无抗生素的DMEM中，加入表达质粒DNA5μg，混匀备用；在100μL无血清、无抗生素的DMEM中，加入20μL脂质体，混匀。将上述两种溶液混匀，滴加在欲转染的细胞表面，于37℃、5%CO2条件下培养5h～12h，换有血清的培养液。24h后，换无血清的DMEM培养48h～72h，收集上清〔6〕。
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1.8 免疫印迹检测目的蛋白的表达将培养上清直接进行SDS-PAGE后，用抗人IgGFd片段和抗人CTLA4的mAb，做蛋白印迹检测CTLA4-Ig。
1.9 CTLA4-Ig生物学活性的检测采用MTT法，测定CTLA4-Ig对正常人外周血中淋巴细胞转化的影响。
2 结果
2.1 CTLA4基因的克隆与测序根据GenBank数据库中CTLA4的序列，设计并合成了引物P1和P2，引物的序列如下：
P1：5′GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTG3′
P2：5′TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAA-ATAAGGCTG3′
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图1 RT-PCR扩增的CTLA4基因产物的电泳图谱
Fig 1 Electrophoresis of products of CTLA4 gene amplified by RT-PCR
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1:PBR322/BstNI marker;2:CTLA4 gene;3:Extracellular domain of CTLA4
2.2 CTLA4表达质粒的构建(图2)由于CTLA4基因的信号肽序列不明确，为表达该基因的胞外段，需要引入抑瘤素M的信号肽〔3〕，并为适合pIg质粒的要求，在胞外段下游引物P5中，引入了表达载体要求提供的剪切供体ACTTACCTGT。引物的序列如下：
P3:5′GGGGATATCCACCATGGGTGTACTGCTCACACAGAGG-ACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC3′
P4:5′CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAGCATGGCG-AGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC3′
P5:5′GCGGATCCACTTACCTGTAGAATCTGGGCACGG3′
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图2 重组质粒pIg-CTLA4的构建
Fig2 Construction of recombinanat plasmid pIg-CTLA4
用P4和P5引物，经半套式PCR扩增后，再用P3和P5引物，做引物重叠PCR，对CTLA4基因改构，获得抑瘤素M信号肽和CTLA4胞外段的融合基因。回收该产物，将其连入载体pGEM中，经EcoRI酶切鉴定正确的重组质粒命名为pGEM-OMCTLA4。PCR产物经限制性内切酶EcoRV和BamHI酶切及电泳回收，连接至经相同酶切的表达载体pIg。该载体含有可融合的人IgG1Fc，并要求欲表达的基因含剪切供体，其自身带有剪切受体。经酶切鉴定后，命名为pIg-CTLA4(图3)。
图3 重组质粒pGEM-OMCTLA4与pIg-CTLA4的酶切鉴定
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Fig3 Restriction emzyme analysis of recombinant plasmid pGEM-OMCTLA4 and pIg-CTLA4
1: DNA Marker, λ DNA/Hind III； 2： pIg-CTLA4/Hind III和 BamH I; 3:pGEM-OMCTLA4/EcoR I.
2.3 CTLA4基因的表达及表达产物的鉴定提取重组质粒pIg-CTLA4，转染COS7和CHO-K细胞。提取转染并经G418筛选的细胞基因组DNA，通过PCR扩增表明，确实将pIg-CTLA4转入表达细胞。收集表达上清，用抗人IgGFcmAb和抗人CTLA4mAb，通过免疫印迹证明，在暂时性表达载体pIg中获得表达(图4)。
图4 CTLA4-Ig表达产物的免疫印迹鉴定
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Fig 4 Western blot analysis of CTLA4-Ig ecpression product
A:IgG Fc assay using anti-IgG Fc mAb; B:CTLA4 assay using anti-CTLA4 mAb;1,2:Supernatant of cells transfected with pIg-CTLA4 and pIg, respectively; 3:Supernatant of CHO-K cells.
2.4 CTLA4-Ig表达上清的活性检测用MTT法检测了CTLA4-Ig表达上清对PHA刺激的人外周血淋巴细胞转化的影响。结果表明，表达上清与pIg空载体对照上清相比较，能明显抑制PHA对淋巴细胞的转化，即可阻断T细胞的活化(图5)。
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图5 CTLA4-Ig表达上清对PHA刺激T细胞转化的影响
Fig 5 Effect of CTLA4-Ig expression supernaatant on lympho-
cyte transformation stimulated by PHA
3 讨论
TCR与MHCII类分子和抗原作用提供的第1信号，以及辅助分子与其配体作用产生的第2信号，是细胞免疫应答的基础。其中公认的共刺激信号是由CD28与B7的相互作用而产生的。CD28分子属Ig超家族成员，包括CD28与CTLA4，二者共享配体B7，构成了精密调控免疫应答的开关〔7〕。CTLA4是维持体内免疫稳态的负调控因子，对该分子的研究有助于阐明许多重要的免疫机制。目前研究表明，CTLA4-IgG和CTLA4-IgM分子能抑制免疫排斥反应，使机体形成耐受，这不仅为临床组织和器官的移植提供了新的治疗方案，而且有望成为解决基因治疗中细胞表达被排斥这难题的辅助药物〔8，9〕。另外，抗CTLA4抗体还能够有效地用于抗肿瘤治疗。因此，我们克隆了CTLA4基因，并表达了融合蛋白CTLA4-Ig。
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基因的表达体系有原核与真核表达。原核表达虽产量高，但产物的复性差、活性低，且CTLA4基因中含较多的稀有密码子，不利于原核表达；而真核表达则需要考虑信号肽及表达的类型。CTLA4分子在T细胞中的表与分布非常特殊，绝大多数分子表达在胞内，且呈极性分布于高尔基体的成熟面，而对胞内段改构能使该分子由胞内表达变为胞外分泌性表达〔10〕。因此，表达该分子的首选策略是构建一种融合蛋白，以改变其表达和分布的限制性，使之能够由胞内分泌性表达到胞外。由于CTLA4基因的信号肽不清楚，我们设计并合成了抑瘤素M的信号肽P3和P4；加之，该分子在一般载体中很难表达，因而选用带人IgG1Fc段的表达载体pIg，并根据载体要求，设计了CTLA4胞外段下游引物P5，引入了剪切供体。这样，可使CTLA4分泌性表达于培养上清，便于用proteinA亲和层析纯化。同时，表达的融合蛋白本身是一种免疫粘附分子，利用免疫粘附分子在体内代谢较慢的优势，有利于观察其体内的效应。
构建表达的CTLA4-Ig，由于与Fc段的连接在铰链区，不影响融合的两部分正确折叠，也不影响CTLA4与B7分子的高亲和力结合。这种高亲和力是由CTLA4胞外段远膜端3个互补决定区(CDR)中CDR1和CDR3区的非保守性氨基酸所决定的〔11〕。因此，CTLA4-Ig可作为CD28的竞争性抑制剂，研究CD28与B7分子的作用。
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我们成功地利用载体pIg表达了融合蛋白CTLA4-Ig，并通过测定表达上清对淋巴细胞转化的影响，证明了该表达产物的活性，为进一步研究该蛋白对淋巴细胞功能的影响打下了基础。
基金项目：国家八六三计划生物技术资助，No.102-09-01-03
作者简介：郑宇，男，32岁，博士北京市太平路27号，Tel.01066931327
参考文献：
〔1〕 Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al.Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in CTLA4〔J〕 . Science, 1995;270:985- 988.
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收稿日期：1999-02-12
修回日期：1999-05-04, http://www.100md.com