AngiostatinK(1－3)基因真核表达载体的构建、鉴定和表达
作者：吴景文 柴玉波 章翔 高大宽 易林华 刘先珍 王煊
单位：吴景文(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；柴玉波(基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西西安710033)；章翔(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；高大宽(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；易林华(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；刘先珍(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；王煊(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)
关键词：angiostatinK(1-3)；真核表达载体；构建；胶质瘤；表达
细胞与分子免疫学杂志000103
摘要:目的构建携带人angiostatinK(1-3)cDNA的真核表达载体，并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞中表达。方法将带有分泌信号的angiostatinK(1-3)cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3，构建CMV启动子控制的载体pcDNA-SAK(1-3)，采用酶切鉴定结果；以上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞(SHG44)，采用电镜和免疫荧光法鉴定其表达，应用牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性。结果成功地构建了真核表达载体pcDNASAK(1-3)，并转染入脑胶质瘤细胞，获得具有抗血管内皮细胞增殖活性的angiostatinK(1-3)蛋白。结论获得有表达功能活性的angiostatinK(1-3)真核表达载体，为脑胶质瘤的抗血管生成基因治疗提供了必要的条件。
, 百拇医药
中图号：Q78 文献标识码:A
文章编号:1007-8738(2000)01-0010-13
Construction,identification and expression of angiostatin K(1-3) gene eukaryotic expression vector
WU Jing-wen ZHANG Xiang GAO Da-kuan YI Li-hnua LIU Xian-zhen WANG Xuan
(Institute of Neurosurgery of Chinese PLA, Xijing Hospital, )
CHAI Yu-bo
, 百拇医药 (Department of Biochemistry and Molecular Biology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China)
Abstract:Aim To construct eukaryotic expression vector carrying human angiostatin K(1-3)cDNA and be expressed in cultured gliomas cells. Methods Angiostatin K(1-3) cDNA with secretive signal was cloned into polylinker site of eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct pcDNA-SAK(1-3)， in which the transcription of angiostatin K(1-3) cDNA was driven by CMV promoter; and angiostatin K(1-3) cDNA was identified by restriction enzyme digestion. The vector was transfected into glioma cells,SHG44. The expressed angiostatin K(1-3) protein was identified by electron microscopy and FCM. Its activity was examined by the bovine micrangium endotheliocyte inhibition test. Results The eukaryotic expression vector pcDNA-SAK(1-3) was successfully constructed and transfected into glioma cells. The angiostatin K(1-3) protein, which can inhibit endothelial cells proliferation, was obtained. Conclusion The eukaryotic expression vector of functional angiostatin K(1-3) gene is acquired. The vector is of significance for human gliomas- specific gene therapy.
, 百拇医药
Keywords:angiostatin K(1-3);eukaryotic expression vector; construction;gliomas;expression
抗血管生成基因治疗是指应用基因表达与调控等手段抑制实体瘤的血管生长，切断肿瘤的营养供给，对肿瘤采取饥饿疗法，从而达到治疗肿瘤的目的。近年来，脑胶质瘤的抗血管生成基因治疗受到高度重视，原因在于胶质瘤具有高度的异质性和遗传突变性，这些特点严重影响了针对肿瘤细胞的化疗、放疗和抑癌基因治疗的有效作用；而脑胶质瘤因富含血管，且其血管内皮细胞的遗传性相对稳定，因此，采用针对肿瘤新生血管内皮细胞的基因治疗具有较大的优势。在这方面的研究中，血管抑素(angiostatin)是最新发现的强有力的新生血管内皮细胞生成的抑制剂，能够抑制体内多种实体瘤的生长，已显示出广阔的临床应用前景[1,2]。AngiostatinK(1-3)，以下简称AK(1-3)，是纤维蛋白溶酶原N端的前3个kringles片段，具有较强地抑制血管内皮细胞增殖的活性[3](图1)。在以往的研究中，我们克隆了AK(1-3)基因，并在此基础上，我们将该基因构建在真核表达载体上，转染入体外培养的胶质瘤细胞(SHG44)，获得了具有功能活性的AK(1-3)表达蛋白，为脑胶质瘤的抗血管生成的基因治疗奠定了基础。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达载体pcDNA3由本校生化教研室提供，目的基因为本室克隆所得，共916 bp。其中前57 bp为编码19个氨基酸的分泌信号肽序列，后859 bp为编码约280～286个氨基酸的AK(13)基因序列。该目的基因具有EcoR I和Xba I的酶切位点。其质粒pSAK(1-3)为本室保存。宿主菌E.Coli DH5α，EcoR I, Xba I, T4 DNA ligase，分别购自Promega公司和Gibco公司。兔抗人plasminogen单克隆抗体(mAb)购自American Diagnostic Company。细胞培养基RPMI 1640和胎牛血清为Gibco公司产品。脂质体(lipofectamine)和G418购自Sigma公司。PCR pure kit为Clontech公司产品。Plasmid purification kit为上海华顺公司产品。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 pcDNA-SAK(1-3)的构建 [4] 将1 μg质粒pSAK(1-3)以EcoR I和Xba I 双酶切，电泳回收目的基因片段并将其重溶于20 μL TE中；另将0.5 μg pcDNA3以上述酶双酶切，电泳回收载体片段, 并溶于20 μL TE中。连接时取1 μL pcDNA3和5μL目的基因片段，以1∶5的分子比将二者相连接，转化DH5α，接种于含Amp琼脂平板上，培养后长出约90个克隆。
1.2.2 pcDNA-SAK(1-3)的鉴定 随机选取上述8个克隆，小量提取质粒，以EcoR I和Xba I双酶切鉴定，切除约916 bp的克隆(阳性克隆)。将阳性克隆扩大培养，提取重组质粒，并将含有AK(13)基因的重组质粒命名为pcDNA-SAK(1-3)(图1)。将上述重组质粒大量扩增，以碱裂解法大量提取质粒，进行纯化和质粒定量，保存于-20℃备用。
1.2.3 pcDNA-SAK(1-3)基因的转染 参照lipofectamine说明书进行。经G418抗性筛选2 wk后，应 用单细胞显微镜操作法，挑取单个阳性克隆，继续在G418抗性培养液中筛选2 wk。将筛选转染成功的细胞扩大培养后，收集培养上清备用。上述转染细胞的后续培养始终在G418的筛选压力下进行，以防转入基因的丢失。
, http://www.100md.com
1.2.4 AK(1-3)对血管内皮细胞增殖的抑制作用
将体外分离的原代牛微血管内皮细胞培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，每4 ～5 d传代1次。传至第4代时，将内皮细胞(103/孔)接种于96孔板，置37℃ 50 mL/L CO2培养4 h～6 h。贴壁后弃上清，加入以100 mL/L胎牛血清 RPMI1640稀释成不同浓度[含AK(1-3)蛋白的]瘤细胞上清(200 μL/孔)。60 h后，加入MTT(5 g/L，20 μL/孔)，继续孵育4 h，小心吸去上清，加入DMSO(150 μL/孔)，充分震荡10 min，于酶联免疫检测仪上读取490 nm的A值。
1.2.5 AK(1-3)表达的鉴定 将SHG44细胞和转染pcDNA3和pcDNA-SAK(1-3)的SHG44细胞(各约3×106)，用无血清RPMI 1640培养液洗涤2次，用2.5 g/L胰酶消化后，离心1 800 r/min×10 min，沿管壁倒入20 mL/L戊二醛2 mL，固定2 h后，观察细胞的超微结构。免疫荧光法鉴定中，所用一抗为兔抗人纤溶酶原的mAb，(对照组加羊血清)，二抗为荧光素标记的鼠抗兔抗体。将上述3组细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液(1×106)，PBS洗两次，加入40 mL/L多聚甲醛固定40 min，离心、弃上清，悬于200 μL含100 mL/L小羊血清的1mL/L Triton X中。37℃作用1h后，PBS洗两次，依次加入100 μL 1∶50的一抗和1∶100荧光素标记的二抗(期间均同上作用及洗涤)，最后用PBS稀释至总量为400 μL后送检。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 pcDNA-SAK(1-3)的酶切鉴定 上述重组质粒扩大培养后，提取重组质粒进行EcoR I和Xba I双酶切鉴定，结果见图1。
图1 质粒pcDNA-SAK(1-3)的双酶切鉴定
Fig 1 Restriction enzyme analysis of plasmid pcDNA-SAK(1-3)
A，B:pcDNA-SAK(1-3)cut with EcoR I and Xba I;C:λDNA/Hind III marker(from top to bottom23130,9416,6557,4361,2322,2027 and 564 bp).
, http://www.100md.com
2.2 AK(1-3)对血管内皮细胞增殖的抑制作用
取转染与未转染pcDNA-SAK(1-3)的胶质瘤细胞培养上清，经紫外分光光度计测定蛋白量后，加入体外原代培养的牛微血管内皮细胞中，用MTT法检测其抑制血管内皮细胞增殖的作用。转染pcDNA-SAK(1-3)的瘤细胞的表达产物对体外培养的牛微血管内皮细胞的增殖有明显地抑制作用，且呈剂量依赖的效应，即随AK(1-3)剂量的增加，对贴壁内皮细胞生长的抑制作用逐渐增强，镜下观察可见细胞脱落飘浮、甚至死亡(图2)，而对未转染组内皮细胞的生长则无抑制作用。
2.3 电镜和免疫荧光检测 转染和未转染pcDNA-SAK(1-3)的胶质瘤细胞(SHG44)，均表现为胞核增大，甚至出现多核现象，胞浆较少、内质网扩张和线粒体增大等。但转染pcDNA-SAK(1-3)的SHG44细胞胞浆中有分泌颗粒存在，见(图3)中的箭头所示。转染细胞的免疫荧光检测可见有AK(1-3)表达。其中A 组：未转染的SHG44细胞，加一抗兔抗人纤溶酶原mAb；B组：未转染的SHG44细胞，加羊血清代替一抗；C和D组：分别为转染空载体和转染pcDAN-SAK(1-3)的SHG44细胞，加一抗兔抗人纤溶酶原mAb。
, 百拇医药
图2 AK(1-3)对牛微血管内皮细胞生长的抑制作用
Fig 2 Inhibitiorg effect of AK(1-3)on bovinemicrangium endothelial cell growth
A：Control group; B：Experimental group.
图3 SHG44细胞转染前后的电镜照片
Fig 3 Electronmicrograph of SHG44 cells before and affer transfection
A: Without transfection;B: With transfection
, http://www.100md.com
1 Cell nucleus;2Microvillus;3Cytoplasm;4Secretory granules.
3 讨 论
脑胶质瘤的基因治疗已在国际上获得广泛研究，并开展了多种治疗方案，大体上可分为3类：1应用直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长的基因，如自杀基因、抑癌基因或反义基因；2免疫基因治疗，如导入细胞因子、MHC或B7分子；3抑制肿瘤细胞的间质，如抑制新生血管内皮细胞生成的基因治疗。恶性脑胶质瘤的病理特征是，内皮细胞大量扩增和液化坏死，且其与肿瘤的恶性程度正相关，因此，近年来应用抗血管生成治疗脑胶质瘤的研究受到高度重视。研究表明，腺病毒载体介导的小鼠angiostatin基因感染大鼠C6胶质瘤细胞后，可使其在裸鼠皮下致瘤性显著下降[5]。对其它荷瘤鼠静脉或皮下多次注射angiostatin蛋白后，能完全抑制肿瘤细胞的生长，且不产生耐药性。这是因为angiostatin阻断了肿瘤新生血管的生成，使肿瘤细胞营养缺乏，而处于休眠状态 [6,7]。以上研究表明，angiostatin为一种重要的抗血管生成抑制剂，具有广阔的临床应用前景。国外抗血管生成的治疗已进入III期临床实验，其中美国已将其用于人体临床实验阶段[8]。
, http://www.100md.com
获得angiostatin的方法主要有：①从人血浆中分离纤维蛋白溶酶原，然后经降解纯化得到angiostatin[9]；②采用基因工程的方法。前一种方法步骤较烦琐，获得的angiostatin量较少且代价昂贵；后一种方法获得的angiostatin蛋白产量丰富，表达量持续稳定，具有重要的临床研究和应用价值。但采用原核表达的angiostatin，由于提取和纯化的难度大，纯度要求高，目前还远不能满足人体实验的要求[8,9]。在本研究中，我们以自行克隆的带有分泌信号的AK(1-3)基因构建重组真核表达载体，并转入脑胶质瘤细胞(SHG44)中进行表达，获得了具有抑制牛微血管内皮细胞增殖活性的AK(1-3)蛋白。
本实验中，我们对携带AK(1-3)基因的质粒pSAK(1-3)采用EcoR I和Xba I双酶切后进行电泳。结果证实，目的基因的全长为916 bp。在此基础上，再将真核表达载体pcDNA3用相同的酶双酶切，电泳后显示，完全切开的1个条带约为5.4 kb。将回收纯化的目的基因克隆入pcDNA3中的EcoR I和Xba I位点，转化DH5α后，选择阳性克隆进行EcoR I 和Xba I双酶切鉴定。电泳结果显示，所获两条带分别为5.4 kb的pcDNA3和916 bp的A K(1-3)，说明已成功地构建真核表达载体pcDNA-SAK(1-3)。我们采用脂质体法，将该真核表达载体转染入脑胶质瘤细胞SHG44后，用G418筛选pcDNA-SAK(1-3)转染的瘤细胞，并始终在G418的压力筛选下进行培养，以防止外源质粒的丢失。研究结果表明，转染外源基因的脑胶质瘤细胞能分泌表达AK(1-3)蛋白，并具有显著抑制体外培养的牛微血管内皮细胞生长的活性。
, 百拇医药
胶质瘤形成的早期(肿瘤∶<0.4 mm3)没有血管生成，肿瘤呈缓慢的线性生长；当其大小超过0.4 mm3时，肿瘤开始形成自身的血管系统并呈快速的近指数生长，并可依赖肿瘤血管床的延伸而出现远处转移[10]。因此，转染pcDNA-SAK(1-3)的胶质瘤细胞SHG44的建立，为进一步开展皮下致瘤性和抗肿瘤血管生成的研究创造必要的条件。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39970854
作者简介：吴景文，男，32岁，主治医师，博士生西安市长乐西路15号, Tel.(029)3375330;
参考文献:
[1] Kim.B, Lee S, Michael S, et al. Recombinant angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer[J]. Cancer Res, 1997; (57):1329-1334.
, 百拇医药
[2] Boehm T, Folkman J, Browder T, et al. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance[J]. Nature, 1997;(390):404-407.
[3] Cao Y, Richard WJ, Von D, et al. Kringle domains of human angiostatin[J]. J Bio Chem, 1996; 271(46): 29461-29467.
[4] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:16-35.
, http://www.100md.com
[5] Frank G, Li H, Annelise BG, et al. Angiostatin gene transfer: inhibition of tumor growth in vivo by blockage of endothelial cell proliferation associated with a mitosis arrest[J]. Med Sci, 1998;95(11): 6367-6372.
[6] CaoY, O'Reilly MS, Marshall B, et al. Expression of angiostatin cDNA in a murine fibrosarcoma suppresses primary tumor growth and produces long- term dormancy of metastases[J]. J Clin Invest, 1998; 101(5):1055-1063.
, http://www.100md.com
[7] Tanaka T, CaoY, Folkman J, et al. Viral vector- targeted antiangiogenic gene therapy utilizing an angiostatin complementary DNA[J]. Cancer Res, 1998; 58(15):3362-3369.
[8] Nelson NJ. Inhibitors of angiogenesis enter phase III testing[J]. J Natl Cancer Inst, 1998; 90(13):960-963.
[9] Paul SK, Melinda F, Lisa JM, et al. Generation of angiostatin by reduction and proteolysis of plasmin[J]. J Biol Chem, 1997; 272 (33):20641-20645.
[10] 吴景文,章翔.血管抑素与肿瘤的抗血管生成治疗[J].国外医学肿瘤学分册, 1998;25(6):16-17.
收稿日期：1999-04-06
修回日期：1999-05-28, 百拇医药
单位：吴景文(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；柴玉波(基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西西安710033)；章翔(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；高大宽(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；易林华(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；刘先珍(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)；王煊(第四军医大学1西京医院全军神经外科研究所)
关键词：angiostatinK(1-3)；真核表达载体；构建；胶质瘤；表达
细胞与分子免疫学杂志000103
摘要:目的构建携带人angiostatinK(1-3)cDNA的真核表达载体，并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞中表达。方法将带有分泌信号的angiostatinK(1-3)cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3，构建CMV启动子控制的载体pcDNA-SAK(1-3)，采用酶切鉴定结果；以上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞(SHG44)，采用电镜和免疫荧光法鉴定其表达，应用牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性。结果成功地构建了真核表达载体pcDNASAK(1-3)，并转染入脑胶质瘤细胞，获得具有抗血管内皮细胞增殖活性的angiostatinK(1-3)蛋白。结论获得有表达功能活性的angiostatinK(1-3)真核表达载体，为脑胶质瘤的抗血管生成基因治疗提供了必要的条件。
, 百拇医药
中图号：Q78 文献标识码:A
文章编号:1007-8738(2000)01-0010-13
Construction,identification and expression of angiostatin K(1-3) gene eukaryotic expression vector
WU Jing-wen ZHANG Xiang GAO Da-kuan YI Li-hnua LIU Xian-zhen WANG Xuan
(Institute of Neurosurgery of Chinese PLA, Xijing Hospital, )
CHAI Yu-bo
, 百拇医药 (Department of Biochemistry and Molecular Biology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China)
Abstract:Aim To construct eukaryotic expression vector carrying human angiostatin K(1-3)cDNA and be expressed in cultured gliomas cells. Methods Angiostatin K(1-3) cDNA with secretive signal was cloned into polylinker site of eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct pcDNA-SAK(1-3)， in which the transcription of angiostatin K(1-3) cDNA was driven by CMV promoter; and angiostatin K(1-3) cDNA was identified by restriction enzyme digestion. The vector was transfected into glioma cells,SHG44. The expressed angiostatin K(1-3) protein was identified by electron microscopy and FCM. Its activity was examined by the bovine micrangium endotheliocyte inhibition test. Results The eukaryotic expression vector pcDNA-SAK(1-3) was successfully constructed and transfected into glioma cells. The angiostatin K(1-3) protein, which can inhibit endothelial cells proliferation, was obtained. Conclusion The eukaryotic expression vector of functional angiostatin K(1-3) gene is acquired. The vector is of significance for human gliomas- specific gene therapy.
, 百拇医药
Keywords:angiostatin K(1-3);eukaryotic expression vector; construction;gliomas;expression
抗血管生成基因治疗是指应用基因表达与调控等手段抑制实体瘤的血管生长，切断肿瘤的营养供给，对肿瘤采取饥饿疗法，从而达到治疗肿瘤的目的。近年来，脑胶质瘤的抗血管生成基因治疗受到高度重视，原因在于胶质瘤具有高度的异质性和遗传突变性，这些特点严重影响了针对肿瘤细胞的化疗、放疗和抑癌基因治疗的有效作用；而脑胶质瘤因富含血管，且其血管内皮细胞的遗传性相对稳定，因此，采用针对肿瘤新生血管内皮细胞的基因治疗具有较大的优势。在这方面的研究中，血管抑素(angiostatin)是最新发现的强有力的新生血管内皮细胞生成的抑制剂，能够抑制体内多种实体瘤的生长，已显示出广阔的临床应用前景[1,2]。AngiostatinK(1-3)，以下简称AK(1-3)，是纤维蛋白溶酶原N端的前3个kringles片段，具有较强地抑制血管内皮细胞增殖的活性[3](图1)。在以往的研究中，我们克隆了AK(1-3)基因，并在此基础上，我们将该基因构建在真核表达载体上，转染入体外培养的胶质瘤细胞(SHG44)，获得了具有功能活性的AK(1-3)表达蛋白，为脑胶质瘤的抗血管生成的基因治疗奠定了基础。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达载体pcDNA3由本校生化教研室提供，目的基因为本室克隆所得，共916 bp。其中前57 bp为编码19个氨基酸的分泌信号肽序列，后859 bp为编码约280～286个氨基酸的AK(13)基因序列。该目的基因具有EcoR I和Xba I的酶切位点。其质粒pSAK(1-3)为本室保存。宿主菌E.Coli DH5α，EcoR I, Xba I, T4 DNA ligase，分别购自Promega公司和Gibco公司。兔抗人plasminogen单克隆抗体(mAb)购自American Diagnostic Company。细胞培养基RPMI 1640和胎牛血清为Gibco公司产品。脂质体(lipofectamine)和G418购自Sigma公司。PCR pure kit为Clontech公司产品。Plasmid purification kit为上海华顺公司产品。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 pcDNA-SAK(1-3)的构建 [4] 将1 μg质粒pSAK(1-3)以EcoR I和Xba I 双酶切，电泳回收目的基因片段并将其重溶于20 μL TE中；另将0.5 μg pcDNA3以上述酶双酶切，电泳回收载体片段, 并溶于20 μL TE中。连接时取1 μL pcDNA3和5μL目的基因片段，以1∶5的分子比将二者相连接，转化DH5α，接种于含Amp琼脂平板上，培养后长出约90个克隆。
1.2.2 pcDNA-SAK(1-3)的鉴定 随机选取上述8个克隆，小量提取质粒，以EcoR I和Xba I双酶切鉴定，切除约916 bp的克隆(阳性克隆)。将阳性克隆扩大培养，提取重组质粒，并将含有AK(13)基因的重组质粒命名为pcDNA-SAK(1-3)(图1)。将上述重组质粒大量扩增，以碱裂解法大量提取质粒，进行纯化和质粒定量，保存于-20℃备用。
1.2.3 pcDNA-SAK(1-3)基因的转染 参照lipofectamine说明书进行。经G418抗性筛选2 wk后，应 用单细胞显微镜操作法，挑取单个阳性克隆，继续在G418抗性培养液中筛选2 wk。将筛选转染成功的细胞扩大培养后，收集培养上清备用。上述转染细胞的后续培养始终在G418的筛选压力下进行，以防转入基因的丢失。
, http://www.100md.com
1.2.4 AK(1-3)对血管内皮细胞增殖的抑制作用
将体外分离的原代牛微血管内皮细胞培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，每4 ～5 d传代1次。传至第4代时，将内皮细胞(103/孔)接种于96孔板，置37℃ 50 mL/L CO2培养4 h～6 h。贴壁后弃上清，加入以100 mL/L胎牛血清 RPMI1640稀释成不同浓度[含AK(1-3)蛋白的]瘤细胞上清(200 μL/孔)。60 h后，加入MTT(5 g/L，20 μL/孔)，继续孵育4 h，小心吸去上清，加入DMSO(150 μL/孔)，充分震荡10 min，于酶联免疫检测仪上读取490 nm的A值。
1.2.5 AK(1-3)表达的鉴定 将SHG44细胞和转染pcDNA3和pcDNA-SAK(1-3)的SHG44细胞(各约3×106)，用无血清RPMI 1640培养液洗涤2次，用2.5 g/L胰酶消化后，离心1 800 r/min×10 min，沿管壁倒入20 mL/L戊二醛2 mL，固定2 h后，观察细胞的超微结构。免疫荧光法鉴定中，所用一抗为兔抗人纤溶酶原的mAb，(对照组加羊血清)，二抗为荧光素标记的鼠抗兔抗体。将上述3组细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液(1×106)，PBS洗两次，加入40 mL/L多聚甲醛固定40 min，离心、弃上清，悬于200 μL含100 mL/L小羊血清的1mL/L Triton X中。37℃作用1h后，PBS洗两次，依次加入100 μL 1∶50的一抗和1∶100荧光素标记的二抗(期间均同上作用及洗涤)，最后用PBS稀释至总量为400 μL后送检。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 pcDNA-SAK(1-3)的酶切鉴定 上述重组质粒扩大培养后，提取重组质粒进行EcoR I和Xba I双酶切鉴定，结果见图1。
图1 质粒pcDNA-SAK(1-3)的双酶切鉴定
Fig 1 Restriction enzyme analysis of plasmid pcDNA-SAK(1-3)
A，B:pcDNA-SAK(1-3)cut with EcoR I and Xba I;C:λDNA/Hind III marker(from top to bottom23130,9416,6557,4361,2322,2027 and 564 bp).
, http://www.100md.com
2.2 AK(1-3)对血管内皮细胞增殖的抑制作用
取转染与未转染pcDNA-SAK(1-3)的胶质瘤细胞培养上清，经紫外分光光度计测定蛋白量后，加入体外原代培养的牛微血管内皮细胞中，用MTT法检测其抑制血管内皮细胞增殖的作用。转染pcDNA-SAK(1-3)的瘤细胞的表达产物对体外培养的牛微血管内皮细胞的增殖有明显地抑制作用，且呈剂量依赖的效应，即随AK(1-3)剂量的增加，对贴壁内皮细胞生长的抑制作用逐渐增强，镜下观察可见细胞脱落飘浮、甚至死亡(图2)，而对未转染组内皮细胞的生长则无抑制作用。
2.3 电镜和免疫荧光检测 转染和未转染pcDNA-SAK(1-3)的胶质瘤细胞(SHG44)，均表现为胞核增大，甚至出现多核现象，胞浆较少、内质网扩张和线粒体增大等。但转染pcDNA-SAK(1-3)的SHG44细胞胞浆中有分泌颗粒存在，见(图3)中的箭头所示。转染细胞的免疫荧光检测可见有AK(1-3)表达。其中A 组：未转染的SHG44细胞，加一抗兔抗人纤溶酶原mAb；B组：未转染的SHG44细胞，加羊血清代替一抗；C和D组：分别为转染空载体和转染pcDAN-SAK(1-3)的SHG44细胞，加一抗兔抗人纤溶酶原mAb。
, 百拇医药
图2 AK(1-3)对牛微血管内皮细胞生长的抑制作用
Fig 2 Inhibitiorg effect of AK(1-3)on bovinemicrangium endothelial cell growth
A：Control group; B：Experimental group.
图3 SHG44细胞转染前后的电镜照片
Fig 3 Electronmicrograph of SHG44 cells before and affer transfection
A: Without transfection;B: With transfection
, http://www.100md.com
1 Cell nucleus;2Microvillus;3Cytoplasm;4Secretory granules.
3 讨 论
脑胶质瘤的基因治疗已在国际上获得广泛研究，并开展了多种治疗方案，大体上可分为3类：1应用直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长的基因，如自杀基因、抑癌基因或反义基因；2免疫基因治疗，如导入细胞因子、MHC或B7分子；3抑制肿瘤细胞的间质，如抑制新生血管内皮细胞生成的基因治疗。恶性脑胶质瘤的病理特征是，内皮细胞大量扩增和液化坏死，且其与肿瘤的恶性程度正相关，因此，近年来应用抗血管生成治疗脑胶质瘤的研究受到高度重视。研究表明，腺病毒载体介导的小鼠angiostatin基因感染大鼠C6胶质瘤细胞后，可使其在裸鼠皮下致瘤性显著下降[5]。对其它荷瘤鼠静脉或皮下多次注射angiostatin蛋白后，能完全抑制肿瘤细胞的生长，且不产生耐药性。这是因为angiostatin阻断了肿瘤新生血管的生成，使肿瘤细胞营养缺乏，而处于休眠状态 [6,7]。以上研究表明，angiostatin为一种重要的抗血管生成抑制剂，具有广阔的临床应用前景。国外抗血管生成的治疗已进入III期临床实验，其中美国已将其用于人体临床实验阶段[8]。
, http://www.100md.com
获得angiostatin的方法主要有：①从人血浆中分离纤维蛋白溶酶原，然后经降解纯化得到angiostatin[9]；②采用基因工程的方法。前一种方法步骤较烦琐，获得的angiostatin量较少且代价昂贵；后一种方法获得的angiostatin蛋白产量丰富，表达量持续稳定，具有重要的临床研究和应用价值。但采用原核表达的angiostatin，由于提取和纯化的难度大，纯度要求高，目前还远不能满足人体实验的要求[8,9]。在本研究中，我们以自行克隆的带有分泌信号的AK(1-3)基因构建重组真核表达载体，并转入脑胶质瘤细胞(SHG44)中进行表达，获得了具有抑制牛微血管内皮细胞增殖活性的AK(1-3)蛋白。
本实验中，我们对携带AK(1-3)基因的质粒pSAK(1-3)采用EcoR I和Xba I双酶切后进行电泳。结果证实，目的基因的全长为916 bp。在此基础上，再将真核表达载体pcDNA3用相同的酶双酶切，电泳后显示，完全切开的1个条带约为5.4 kb。将回收纯化的目的基因克隆入pcDNA3中的EcoR I和Xba I位点，转化DH5α后，选择阳性克隆进行EcoR I 和Xba I双酶切鉴定。电泳结果显示，所获两条带分别为5.4 kb的pcDNA3和916 bp的A K(1-3)，说明已成功地构建真核表达载体pcDNA-SAK(1-3)。我们采用脂质体法，将该真核表达载体转染入脑胶质瘤细胞SHG44后，用G418筛选pcDNA-SAK(1-3)转染的瘤细胞，并始终在G418的压力筛选下进行培养，以防止外源质粒的丢失。研究结果表明，转染外源基因的脑胶质瘤细胞能分泌表达AK(1-3)蛋白，并具有显著抑制体外培养的牛微血管内皮细胞生长的活性。
, 百拇医药
胶质瘤形成的早期(肿瘤∶<0.4 mm3)没有血管生成，肿瘤呈缓慢的线性生长；当其大小超过0.4 mm3时，肿瘤开始形成自身的血管系统并呈快速的近指数生长，并可依赖肿瘤血管床的延伸而出现远处转移[10]。因此，转染pcDNA-SAK(1-3)的胶质瘤细胞SHG44的建立，为进一步开展皮下致瘤性和抗肿瘤血管生成的研究创造必要的条件。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39970854
作者简介：吴景文，男，32岁，主治医师，博士生西安市长乐西路15号, Tel.(029)3375330;
参考文献:
[1] Kim.B, Lee S, Michael S, et al. Recombinant angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer[J]. Cancer Res, 1997; (57):1329-1334.
, 百拇医药
[2] Boehm T, Folkman J, Browder T, et al. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance[J]. Nature, 1997;(390):404-407.
[3] Cao Y, Richard WJ, Von D, et al. Kringle domains of human angiostatin[J]. J Bio Chem, 1996; 271(46): 29461-29467.
[4] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:16-35.
, http://www.100md.com
[5] Frank G, Li H, Annelise BG, et al. Angiostatin gene transfer: inhibition of tumor growth in vivo by blockage of endothelial cell proliferation associated with a mitosis arrest[J]. Med Sci, 1998;95(11): 6367-6372.
[6] CaoY, O'Reilly MS, Marshall B, et al. Expression of angiostatin cDNA in a murine fibrosarcoma suppresses primary tumor growth and produces long- term dormancy of metastases[J]. J Clin Invest, 1998; 101(5):1055-1063.
, http://www.100md.com
[7] Tanaka T, CaoY, Folkman J, et al. Viral vector- targeted antiangiogenic gene therapy utilizing an angiostatin complementary DNA[J]. Cancer Res, 1998; 58(15):3362-3369.
[8] Nelson NJ. Inhibitors of angiogenesis enter phase III testing[J]. J Natl Cancer Inst, 1998; 90(13):960-963.
[9] Paul SK, Melinda F, Lisa JM, et al. Generation of angiostatin by reduction and proteolysis of plasmin[J]. J Biol Chem, 1997; 272 (33):20641-20645.
[10] 吴景文,章翔.血管抑素与肿瘤的抗血管生成治疗[J].国外医学肿瘤学分册, 1998;25(6):16-17.
收稿日期：1999-04-06
修回日期：1999-05-28, 百拇医药