冠心病患者血小板膜糖蛋白CD63，CD62p和TSD的表达
作者：张锑 张春青 丛亚琴 郭亦媛 徐从高
单位：张锑 张春青 丛亚琴 郭亦媛 徐从(山东医科大学附属医院肿瘤中心血研室，山东济南250012)
关键词：活化血小板；膜糖蛋白；流式细胞术；冠心病
细胞与分子免疫学杂志000114摘要：目的研究冠心病患者血小板膜糖蛋白的表达。方法采用流式细胞术(FCM)，对113例冠心病患者及37例健康人血小板膜糖蛋白(MGP)CD63，CD62P和凝血酶敏感蛋白(TSD)进行了检测。结果患者组CD63，CD62P和TDS3种MGP的阳性表达率分别为：(5.3±4.0)%，(5.8±3.3)%和(4.7±3.7)%，均显著高于正常对照组，分别为：(1.0±0.6)%，(1.4±0.5)%和(1.6±0.6)%(P∨0.01)。结论用FCM检测活化血小板，结果准确，特异性和灵敏度高，可反映单个或亚群血小板质膜上活化抗原的变化，对血栓性疾病的诊断及治疗具有重要的意义。
, 百拇医药
中图号：R446.61 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0042-44
Flow cytometric analysis of platelet membrane glycoproteins CD63, CD62p and TSD in patients with coronary heart disease
ZHANG Ti,ZHANG Chun-qing, CONG Ya-qin,GUO Yi-yuan, XU Cong-gao
Hematology Research Laboratory, First Affiliated Hospital, Shandong Medical University, Jinan 250012, Shandong Province, China
, 百拇医药
Abstract:Aim To evaluate the status of platelet activation in patients with coronary heart disease(CHD). Methods One hun-dred and thirteen(CHD)patients and 37 normal subjects were studied. Activated platelet markers including three membrane glycoproteins(MGP)CD63, CD62p and thrombospondin(TSD) were fluorescently labled with their corresponding monoclonal antibodies(mAb) and analyzed by flow cytometry(FCM). Results The positive rates of the three membrane glycoprotein expressions in CHD patients were significantly higher than those in control group(5.3± 4.0)% ， (5.8± 3.3)% and(4.7± 3.7)% vs(1.0 ± 0.6)% ， (1.4± 0.5)% and (1.6± 0.6)% ,(P∨ 0.01). Expressions of these membrane glycoproteins on activated platelets were observed to have some relation to disease severity, but without significant difference sfafisfically. FCM was a technique of detecting platelet activation, possessed rapidity reliability, high sensitivity and specificity in evaluating platelet functions of the CHD patients. Concluslon The above results may provide useful data for the diagnosis, treatment and prognosis of thrombus diseases.
, http://www.100md.com
Keywords: activated platelet; membrane glycoproteins; flow cytometry; coronary heart disease
近年来，随着识别活化血小板膜抗原单克隆抗体(mAb)的研制，流式细胞术(FCM)以其快速、敏感、准确、特异的优点，已被广泛用于临床活化血小板的检测，为临床评价血小板的活化程度提供了早期、特异诊断的指标。血小板在血栓性疾病的形成过程中起着重要的作用。由于其MGP是参与血栓形成中多种生理病理过程的标志物，因此，我们以抗活化血小板的mAb作为探针，检测了冠心病(CHD)患者113例及健康人37例3种MGP(CD63，CD62P和TSD)的变化，以探讨CHD患者血小板的活化程度及临床意义。
1 材料和方法
1.1 材料 CHD患者113例，均为本校附属医院住院或门诊病例；男81例，女32例；年龄37～78岁，平均60.3岁。其中不稳定型心绞痛(UA)76例，稳定型心绞痛(SA)26例，心肌梗死(MI)11例。全部患者均符合1979年WHO制定的缺血性心脏病的诊断标准。正常对照组37例，均为健康体检者，无心脑血管疾病、高血压及糖尿病史，两周内均无服用可影响血小板功能的药物史。FITC-抗CD63 mAb，藻红蛋白(PE)-抗TSD mAb，FITC-鼠IgG和PE-鼠IgG及相应的阴性对照，均为Immunotech公司的产品；FITC-抗CD62P mAb为PharMingen的产品。流式细胞仪为Becton Dickinson FACS Vantage的产品。
, 百拇医药
1.2 方法 血小板的制备：于晨起活动前采集静脉血2 mL，加106 mmol/L枸橼酸钠抗凝(血液∶抗凝剂为体积比9∶1)，以800 r/min离心5 min，分离富含血小板的血浆(PRP)。加10 mL/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次(2000 r/min×5 min)，调整血小板的密度为3×1011/L，置4℃冰箱保存。免疫荧光标记：于实验管中加入洗涤、固定的血小板50 μL及相应的FITC-或PE-mAb 20 μL。对照管中加入FITC-鼠IgG或PE鼠IgG 20 μL，混匀后，避光置室温30 min，PBS洗涤2次，加1 mL PBS待测。FCM检测：所用激光光源为氩离子激光器，激发波长为488 nm，以Cell Quest软件进行资料采集和分析。根据前向角散射(FSC)与侧向角散射(SSC)的散点图，采用设门技术(gating)圈出欲分析的血小板群体，以避免其它细胞或噪声的干扰。样品上机前，用标准的荧光微球将CV值调整在5%以下，以确保其荧光的敏感度及线性。荧光检测值经对数放大，共检测10 000个血小板，将光散射及荧光数据存入软盘，测试完后分析结果。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 CHD患者MGP的表达 CHD患者3种MGP表达的阳性率及表达量分别见表1，2。US，SA和MI患者与正常对照组相比较，表达的阳性率(%)具有显著差异(P∨0.01)；而CHD患者各型间的表达阳性率则无显著差异(P∨0.05，表1)。
表1 不同类型CHD患者3种MGP的表达阳性率
Tab 1 Positive rates of three MGP expressions on activated
platelets in differernt types of CHD patients(
±s，%)
CHD type
, http://www.100md.com
n
CD63
CD62P
TSD
CHD
113
5.3±4.0b
5.8±3.3b
4.7±3.7b
SA
26
3.8±1.1ab
, 百拇医药
4.6±2.1ab
3.5±2.3ab
UA
76
5.9±3.7ab
5.8±3.2ab
4.5±4.0ab
MI
11
6.3±4.9ab
6.0±4.5ab
, 百拇医药
5.4±4.8ab
Control
37
1.0±0.6
1.4±0.5
1.6±0.6
bP<0.01 vs control.
aP<0.05 mutual comparison among SA, UA and IM.
表2 CHD患者3种MGP的表达量
Tab 2 Three MGP expression amounts on activated
, http://www.100md.com
platelets in CHD patients (±s，A)
Group
n
CD63
CD62P
TSD
CHD
113
21.5±1.5b
24.7±9.9b
, http://www.100md.com
27.1±0.6b
Control
37
2.9±0.9
3.2±1.1
3.6±1.5
bP<0.001 vs control.
2.2 CHD患者MGP的荧光图谱 CHD患者及正常对照3种MGP的荧光图谱见图1。
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s
图1 CHD患者3种MGP的荧光图谱
Fig1 Fluorescent map of three MGPs in CHD patients
3 讨 论
在血栓的发生、发展过程中，由于血管内皮损伤后胶原暴露，可促使血小板粘附并活化。原存在于静息血小板胞浆内α-颗粒膜上的糖蛋白CD62P(MGP140)，TSD和溶酶体膜上的CD63(GP53)，不能被相应的特异性mAb所识别。但在血小板活化时，随着活化血小板“脱颗粒”发生异位而与血小板质膜融合，上述MGP分子便暴露于活化血小板的膜表面，成为活化血小板的标志物，此时才能被相应的mAb所识别，并介导和促进血小板与粒细胞或内皮细胞的粘附和连接〔1-3〕。CD62P是一种富含半胱氨酸、高度糖基化的整合蛋白。当血小板或内皮细胞受刺激而活化时，CD62P便可随着α-颗粒中内容物的释放而与质膜融合，并持久存在于活化血小板质膜的表面，因而是活化血小板的重要标志之一。CD63抗原为一种溶酶体整合膜蛋白(LIMP-CD63)〔4〕，在静止血小板表面仅有极少量表达，而在活化血小板表面可大量表达，因此也是检测血小板活化的理想指标。以往测定血小板功能的方法(如血小板聚集法)，不仅要在体外加入外源性的致聚剂，且不能反映体内血小板活化的程度。近年来，随着抗活化血小板膜抗原mAb的问世，使临床上检测体内血小板的活化成为可能。
, 百拇医药
我们发现，CHD患者活化血小板膜抗原的表达明显升高，表明CHD患者体内血小板的活化处于亢强状态。这不仅为CHD患者应用抗血小板药物治疗提供了现论依据，而且可用于评价治疗药物的疗效。FCM用于测定活化血小板的研究为时不久，因此，用其对各种血栓前状态及其相关血栓栓塞性疾病监测的价值，尚需继续积累资料。本研究所检测了CHD患者3种活化血小板膜抗原的表达均有显著升高，但各种标志物升高的程度不同，以CD63和CD62P的升高较为明显，其意义仍有待进一步研究。
血小板在体外极易被多种因素激活，因此，在测定体内血小板的活化时，应避免一切可能导致血小板活化的因素，如标本的及时采集与送检；固定前不应冻存等。80年代以来，随着mAb研制的普遍开展，FCM作为一项新技术，以其快速、准确、特异等优点已被广泛应用于临床。应用FCM检测活化血小板的膜抗原，是近年来血栓研究的一项新技术。Cahill等〔5〕提出，CD63，CD62P和TSD均为血小板活化的重要指标〔5〕，因此，本文对这些标志物的检测，可为血栓性疾病的诊断、预后、疗效评估，以及抗血栓性药物的研究提供实验依据。
, 百拇医药
作者简介：张锑，女,48岁，主管技师
济南市文化路107号.Tel.( 0531) 6038449
参考文献：
〔1〕 Corash L. Measurement of platelet activation by fluorescence activated flow cytometry〔J〕 . Blood Cell, 1990;16:97.
〔2〕 Nurden AT, Bihour C, Macchi L, et al. Platelet activation in thrombotic disorders〔J〕 . Now Rev Fr Hematol,1993;35(1):67- 71.
〔3〕 Tanoue K, Akamatsu N, Suzuki H, et al. Detection of circulating activated platelets by anti- GMP 140 momoclonal antibodies〔J〕 . Nippon Rinsho, 1992; 50(2):330- 331.
, 百拇医药
〔4〕 Metzelaar MJ, Wijngaard PL, Peters PJ, et al. CD63 antigen, a novel lysosomal membrane glycoprotein cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells〔J〕 . J Biol Chem, 1990; 70:838- 843.
〔5〕 Cahill MR, Macey MG, Dawson JR, et al. Platelet surface activation antigen expression at baseline and during elective angioplasty in patients with mild to moderate coronary artery disease〔J〕 . Blood Coagul Fibrinol, 1996; 7(2):165- 168.
收稿日期：1999-01-04
修回日期：1999-07-26, 百拇医药
单位：张锑 张春青 丛亚琴 郭亦媛 徐从(山东医科大学附属医院肿瘤中心血研室，山东济南250012)
关键词：活化血小板；膜糖蛋白；流式细胞术；冠心病
细胞与分子免疫学杂志000114摘要：目的研究冠心病患者血小板膜糖蛋白的表达。方法采用流式细胞术(FCM)，对113例冠心病患者及37例健康人血小板膜糖蛋白(MGP)CD63，CD62P和凝血酶敏感蛋白(TSD)进行了检测。结果患者组CD63，CD62P和TDS3种MGP的阳性表达率分别为：(5.3±4.0)%，(5.8±3.3)%和(4.7±3.7)%，均显著高于正常对照组，分别为：(1.0±0.6)%，(1.4±0.5)%和(1.6±0.6)%(P∨0.01)。结论用FCM检测活化血小板，结果准确，特异性和灵敏度高，可反映单个或亚群血小板质膜上活化抗原的变化，对血栓性疾病的诊断及治疗具有重要的意义。
, 百拇医药
中图号：R446.61 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0042-44
Flow cytometric analysis of platelet membrane glycoproteins CD63, CD62p and TSD in patients with coronary heart disease
ZHANG Ti,ZHANG Chun-qing, CONG Ya-qin,GUO Yi-yuan, XU Cong-gao
Hematology Research Laboratory, First Affiliated Hospital, Shandong Medical University, Jinan 250012, Shandong Province, China
, 百拇医药
Abstract:Aim To evaluate the status of platelet activation in patients with coronary heart disease(CHD). Methods One hun-dred and thirteen(CHD)patients and 37 normal subjects were studied. Activated platelet markers including three membrane glycoproteins(MGP)CD63, CD62p and thrombospondin(TSD) were fluorescently labled with their corresponding monoclonal antibodies(mAb) and analyzed by flow cytometry(FCM). Results The positive rates of the three membrane glycoprotein expressions in CHD patients were significantly higher than those in control group(5.3± 4.0)% ， (5.8± 3.3)% and(4.7± 3.7)% vs(1.0 ± 0.6)% ， (1.4± 0.5)% and (1.6± 0.6)% ,(P∨ 0.01). Expressions of these membrane glycoproteins on activated platelets were observed to have some relation to disease severity, but without significant difference sfafisfically. FCM was a technique of detecting platelet activation, possessed rapidity reliability, high sensitivity and specificity in evaluating platelet functions of the CHD patients. Concluslon The above results may provide useful data for the diagnosis, treatment and prognosis of thrombus diseases.
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Keywords: activated platelet; membrane glycoproteins; flow cytometry; coronary heart disease
近年来，随着识别活化血小板膜抗原单克隆抗体(mAb)的研制，流式细胞术(FCM)以其快速、敏感、准确、特异的优点，已被广泛用于临床活化血小板的检测，为临床评价血小板的活化程度提供了早期、特异诊断的指标。血小板在血栓性疾病的形成过程中起着重要的作用。由于其MGP是参与血栓形成中多种生理病理过程的标志物，因此，我们以抗活化血小板的mAb作为探针，检测了冠心病(CHD)患者113例及健康人37例3种MGP(CD63，CD62P和TSD)的变化，以探讨CHD患者血小板的活化程度及临床意义。
1 材料和方法
1.1 材料 CHD患者113例，均为本校附属医院住院或门诊病例；男81例，女32例；年龄37～78岁，平均60.3岁。其中不稳定型心绞痛(UA)76例，稳定型心绞痛(SA)26例，心肌梗死(MI)11例。全部患者均符合1979年WHO制定的缺血性心脏病的诊断标准。正常对照组37例，均为健康体检者，无心脑血管疾病、高血压及糖尿病史，两周内均无服用可影响血小板功能的药物史。FITC-抗CD63 mAb，藻红蛋白(PE)-抗TSD mAb，FITC-鼠IgG和PE-鼠IgG及相应的阴性对照，均为Immunotech公司的产品；FITC-抗CD62P mAb为PharMingen的产品。流式细胞仪为Becton Dickinson FACS Vantage的产品。
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1.2 方法 血小板的制备：于晨起活动前采集静脉血2 mL，加106 mmol/L枸橼酸钠抗凝(血液∶抗凝剂为体积比9∶1)，以800 r/min离心5 min，分离富含血小板的血浆(PRP)。加10 mL/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次(2000 r/min×5 min)，调整血小板的密度为3×1011/L，置4℃冰箱保存。免疫荧光标记：于实验管中加入洗涤、固定的血小板50 μL及相应的FITC-或PE-mAb 20 μL。对照管中加入FITC-鼠IgG或PE鼠IgG 20 μL，混匀后，避光置室温30 min，PBS洗涤2次，加1 mL PBS待测。FCM检测：所用激光光源为氩离子激光器，激发波长为488 nm，以Cell Quest软件进行资料采集和分析。根据前向角散射(FSC)与侧向角散射(SSC)的散点图，采用设门技术(gating)圈出欲分析的血小板群体，以避免其它细胞或噪声的干扰。样品上机前，用标准的荧光微球将CV值调整在5%以下，以确保其荧光的敏感度及线性。荧光检测值经对数放大，共检测10 000个血小板，将光散射及荧光数据存入软盘，测试完后分析结果。
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2 结 果
2.1 CHD患者MGP的表达 CHD患者3种MGP表达的阳性率及表达量分别见表1，2。US，SA和MI患者与正常对照组相比较，表达的阳性率(%)具有显著差异(P∨0.01)；而CHD患者各型间的表达阳性率则无显著差异(P∨0.05，表1)。
表1 不同类型CHD患者3种MGP的表达阳性率
Tab 1 Positive rates of three MGP expressions on activated
platelets in differernt types of CHD patients(
±s，%)CHD type
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n
CD63
CD62P
TSD
CHD
113
5.3±4.0b
5.8±3.3b
4.7±3.7b
SA
26
3.8±1.1ab
, 百拇医药
4.6±2.1ab
3.5±2.3ab
UA
76
5.9±3.7ab
5.8±3.2ab
4.5±4.0ab
MI
11
6.3±4.9ab
6.0±4.5ab
, 百拇医药
5.4±4.8ab
Control
37
1.0±0.6
1.4±0.5
1.6±0.6
bP<0.01 vs control.
aP<0.05 mutual comparison among SA, UA and IM.
表2 CHD患者3种MGP的表达量
Tab 2 Three MGP expression amounts on activated
, http://www.100md.com
platelets in CHD patients (
±s，A)Group
n
CD63
CD62P
TSD
CHD
113
21.5±1.5b
24.7±9.9b
, http://www.100md.com
27.1±0.6b
Control
37
2.9±0.9
3.2±1.1
3.6±1.5
bP<0.001 vs control.
2.2 CHD患者MGP的荧光图谱 CHD患者及正常对照3种MGP的荧光图谱见图1。
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图1 CHD患者3种MGP的荧光图谱
Fig1 Fluorescent map of three MGPs in CHD patients
3 讨 论
在血栓的发生、发展过程中，由于血管内皮损伤后胶原暴露，可促使血小板粘附并活化。原存在于静息血小板胞浆内α-颗粒膜上的糖蛋白CD62P(MGP140)，TSD和溶酶体膜上的CD63(GP53)，不能被相应的特异性mAb所识别。但在血小板活化时，随着活化血小板“脱颗粒”发生异位而与血小板质膜融合，上述MGP分子便暴露于活化血小板的膜表面，成为活化血小板的标志物，此时才能被相应的mAb所识别，并介导和促进血小板与粒细胞或内皮细胞的粘附和连接〔1-3〕。CD62P是一种富含半胱氨酸、高度糖基化的整合蛋白。当血小板或内皮细胞受刺激而活化时，CD62P便可随着α-颗粒中内容物的释放而与质膜融合，并持久存在于活化血小板质膜的表面，因而是活化血小板的重要标志之一。CD63抗原为一种溶酶体整合膜蛋白(LIMP-CD63)〔4〕，在静止血小板表面仅有极少量表达，而在活化血小板表面可大量表达，因此也是检测血小板活化的理想指标。以往测定血小板功能的方法(如血小板聚集法)，不仅要在体外加入外源性的致聚剂，且不能反映体内血小板活化的程度。近年来，随着抗活化血小板膜抗原mAb的问世，使临床上检测体内血小板的活化成为可能。
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我们发现，CHD患者活化血小板膜抗原的表达明显升高，表明CHD患者体内血小板的活化处于亢强状态。这不仅为CHD患者应用抗血小板药物治疗提供了现论依据，而且可用于评价治疗药物的疗效。FCM用于测定活化血小板的研究为时不久，因此，用其对各种血栓前状态及其相关血栓栓塞性疾病监测的价值，尚需继续积累资料。本研究所检测了CHD患者3种活化血小板膜抗原的表达均有显著升高，但各种标志物升高的程度不同，以CD63和CD62P的升高较为明显，其意义仍有待进一步研究。
血小板在体外极易被多种因素激活，因此，在测定体内血小板的活化时，应避免一切可能导致血小板活化的因素，如标本的及时采集与送检；固定前不应冻存等。80年代以来，随着mAb研制的普遍开展，FCM作为一项新技术，以其快速、准确、特异等优点已被广泛应用于临床。应用FCM检测活化血小板的膜抗原，是近年来血栓研究的一项新技术。Cahill等〔5〕提出，CD63，CD62P和TSD均为血小板活化的重要指标〔5〕，因此，本文对这些标志物的检测，可为血栓性疾病的诊断、预后、疗效评估，以及抗血栓性药物的研究提供实验依据。
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作者简介：张锑，女,48岁，主管技师
济南市文化路107号.Tel.( 0531) 6038449
参考文献：
〔1〕 Corash L. Measurement of platelet activation by fluorescence activated flow cytometry〔J〕 . Blood Cell, 1990;16:97.
〔2〕 Nurden AT, Bihour C, Macchi L, et al. Platelet activation in thrombotic disorders〔J〕 . Now Rev Fr Hematol,1993;35(1):67- 71.
〔3〕 Tanoue K, Akamatsu N, Suzuki H, et al. Detection of circulating activated platelets by anti- GMP 140 momoclonal antibodies〔J〕 . Nippon Rinsho, 1992; 50(2):330- 331.
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〔4〕 Metzelaar MJ, Wijngaard PL, Peters PJ, et al. CD63 antigen, a novel lysosomal membrane glycoprotein cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells〔J〕 . J Biol Chem, 1990; 70:838- 843.
〔5〕 Cahill MR, Macey MG, Dawson JR, et al. Platelet surface activation antigen expression at baseline and during elective angioplasty in patients with mild to moderate coronary artery disease〔J〕 . Blood Coagul Fibrinol, 1996; 7(2):165- 168.
收稿日期：1999-01-04
修回日期：1999-07-26, 百拇医药