丙肝病毒DNA疫苗基础研究取得重要进展
http://www.100md.com
中国医学论坛报 总第699期
丙肝病毒DNA疫苗基础研究取得重要进展
浙医大附属第一医院
陈建忠
关键词：肝炎 疫苗 基因
本院传染病研究所以刘克洲教授为首的科研组，将编码HCV C区和C区加E区抗原基因，构建含有CMV启动子，在真核细胞内高效表达的重组质粒，并联合应用IL-12重组质粒，用DNA免疫技术，将其注入BALB/C小鼠肌肉内，通过检测目的基因表达及特异的细胞和体液免疫反应，证实HCV DNA疫苗在小鼠体内能诱导机体产生免疫效应，为进行灵长类动物实验和临床试验提供理论和实用的科学依据。现将研究结果报告如下：
一、为探讨丙型肝炎病人细胞免疫功能，本课题用3H-TdR掺入法研究丙型肝炎病人外周血单个核细胞(PBMC)对HCV合成肽CP9、NS4和基因重组抗原C、E1、E2、NS3的细胞增殖反应。用荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)检测了PBMC中CD4+、CD8+淋巴细胞亚群在HCV抗原刺激后的变化，从细胞免疫方面优选HCV抗原。结果表明：丙肝病人PBMC对HCV合成肽CP9、NS4和基因重组抗原C、E1、E2、NS3刺激后出现不同程度增殖反应。随着合成肽剂量加大，刺激指数(SI)也逐渐增大。荧光显微镜检测丙肝病人PBMC对HCV合成肽C9，NS4和基因重组抗原C刺激后，CD4+比CD8+细胞增殖反应明显增高，由43.26%分别上升为48.73%、47.07%、49.08%，对CP9和C区抗原增殖反应比刺激前有显著性差异(P<0.05)。
, http://www.100md.com
二、以我国主要流行株HCVⅡ型(1b)为研究株，将主要编码HCV结构蛋白的基因片段(C+E)插入到表达载体pCD-SRα1中，用RT-PCR、dot ELISA和Western blot方法，从基因和蛋白表达水平对重组体进行鉴定后，再以其免疫BALB/C小鼠。结果显示：(1)重组体pCD-HCV(100μg/只)3～4次接种BALB/C小鼠后，血清抗体为100%阳性，水平达0.707～0.773(OD值)，免疫鼠抗体水平达高峰后(0.707)，持续检测18周(0.68～0.75)。空载体pCD-SRα1免疫鼠血清抗体阴性。免疫鼠的脾细胞对HCV合成肽CP9和基因重组抗原C、E1刺激后均出现增殖反应；SI分别为4.14±0.90、3.98±1.58、4.02±1.24。(2)重组体pCD-HCV以不同剂量(10μg、50μg、100μg)分别免疫鼠(n=8)，抗体水平依次为0.11±0.09、0.33±0.04、0.70±0.07，三组间差异有显著性(P<0.01)。(3)pCD-HCV采用灌胃、腹腔注射、皮下注射、肌肉注射(100μg/只×3只)不同途径分别免疫小鼠，抗体产生水平依次为0.138±0.05，0.178±0.07，0.233±0.08，0.691±0.05，统计显示，肌肉注射途径产生的抗体水平最高(P<0.01)。(4)用普鲁卡因100μl(0.4mg)肌肉注射小鼠24小时后，再肌肉注射pCD-HCV(10μg/50μg/只×3次)，抗体水平分别为0.317±0.05和0.690±0.04，比直接肌肉注射同剂量重组体抗体水平(0.11±0.07和0.330±0.04)要明显增高(P<0.01)。
, 百拇医药
三、为提高基因免疫的效果及改变基因免疫的免疫反应类型，对HCV结构区基因重组体联合重组体IL-12(pIL-12)进行实验研究。以稳定表达HCV C蛋白的P815细胞作为靶细胞体外检测CTL反应，稳定表达HCV C蛋白SP2/0细胞用于免疫鼠荷瘤，检测体内CTL反应。结果发现：(1)HCV结构区基因与pIL-12联合免疫，HCV特异性CTL活性明显增强，pC+pIL-12组特异性细胞杀伤率为60.11%±17.37%，pCE1E2+pIL-12为67.48%±15.51%，与pC(18.65%±5.71%)和pCE1E2(29.97%±11.11%)单独免疫组比较均差异显著(P<0.01)，提示pIL-12可增加HCV特异性细胞免疫反应。但联合免疫后抗HCV水平有所下降，pC组抗HCV A值为0.358±0.096，pC+pIL-12组A值为0.210±0.086，两组比较P<0.05：pCE1E2组A值为0.415±0.127，pCE1E2+pIL-12组A值为0.258±0.125，两组差异显著P<0.01，提示IL-12可指导DNA免疫反应由Th2向Th1转型，但单独肌注pIL-12重组体不能诱导出HCV特异CTL反应。(2)免疫鼠荷瘤体内CTL活性研究，在最后一次免疫后4周，于两侧腹部接种能稳定表达HCV C蛋白的SP2/0细胞荷瘤，观察肿瘤大小、发瘤部位和存活时间等，结果：pC和pCE1E2组免疫鼠的发瘤时间明显晚于对照组，并且存活时间明显延长，同样联合pIL-12后，与pC和pCE1E2相比发瘤时间滞后，显示HCV DNA免疫可以在体内诱导HCV特异的CTL反应，联合pIL-12后可显著增加其活性。
, http://www.100md.com
本研究结果为达到预防和治疗丙肝的目的，提供了有明显理论价值和实用意义的科学依据，为成功研制HCV疫苗打下基础。
乙型肝炎治疗疫苗的研究进展
上海医科大学分子病毒学研究室Wen等在第二届国际肝病学研讨会上报告了乙型肝炎抗原-抗体复合物治疗疫苗(CI)的研究进展。
慢性乙肝病毒(HBV)感染可产生严重的后果，如肝硬化和原发性肝癌。由于大多数慢乙肝病人血清HBsAg阳性、抗HBs阴性，而当抗HBs阳转时，HBV被清除，疾病痊愈。因此Wen等认为，对HBsAg的免疫耐受是HBV感染持久存在的主要原因。数种消除HBsAg免疫耐受和诱导免疫反应的免疫原首先在鸭HBV感染模型进行实验。结果显示，抗原-抗体复合物(DHBsAg-抗DHBs)可消除免疫耐受性。Wen等将血浆提取的HBsAg与过量高滴度人抗HBs免疫球蛋白(HBIG)结合物用作治疗疫苗，治疗了14例慢乙肝病人，效果良好。通过对小鼠的研究发现，其主要作用机制是，抗原呈递细胞的Fc受体通过抗HBs的Fc段增加了对HBsAg的摄取。当抗原呈递细胞和T细胞一起孵育时，复合物被摄取，T细胞增殖增加，干扰素γ(IFN-γ)和白介素2(IL-2)水平升高，提示对HBsAg抗原加工和呈递进行了调节。
, 百拇医药
重组HBsAg在免疫复合物中的应用
1998年中国禁止使用从血浆中提取的乙肝疫苗，因此，HBsAg-HBIG治疗疫苗的制备改用重组HBsAg。HBsAg和抗HBs的结合是制备这种免疫复合物治疗疫苗的关键。由于血浆提取抗原和重组抗原的糖基化存在差异，因此用相同来源抗原与其免疫生成的抗HBs的结合能力较好。在优化重组抗原/抗体比值制备免疫复合物疫苗过程中，用Balb/c小鼠来研究此复合物的免疫原性。结果显示，小鼠的抗HBs反应增强，与血浆提取IC的结果类似。
根据上述实验，用酵母菌表达重组HBsAg制备出免疫复合物治疗疫苗，并申请进行临床试验。
低应答小鼠对免疫复合物治疗疫苗的反应
Wen等与Davis协作，在2种小鼠比较了γIC和yHBsAg的免疫原性。B10.S小鼠是低应答种，其对应种B10应答正常。单用HBsAg免疫B10.S小鼠，其抗HBs滴度比B10小鼠低102倍。用IC免疫小鼠，在加强注射后，B10.S小鼠的抗BHs滴度和B10小鼠相似。证明IC的免疫原性较强，提示IC有可能使低应答病人产生抗HBs。
, 百拇医药
鼻内接种免疫复合物治疗疫苗可诱导体液免疫反应
McCluskie等给Balb/c小鼠鼻内接种HBsAg-抗HBs免疫复合物疫苗，结果发现鼻内接种1mg HBsAg不能诱导抗HBs IgG抗体生成，但接种1次IC(含1μg HBsAg)可诱导抗HBs生成(GMT～102)。加强接种后，HBsAg免疫组小鼠均无抗HBs生成，而IC免疫组小鼠抗HBs增加19倍。上述结果表明，黏膜接种IC可诱导良好的体液免疫反应，在我国某些边远地区，鼻内接种IC可取代乙肝疫苗注射接种。
根据上述研究，可以制备多种不同用途的IC治疗疫苗。由于乙型肝炎病人临床表现和发病机制不尽相同，因此需要多种治疗疫苗。
蒋鸿鑫摘译自J Gastroenterd Hepatol[1999,14(Suppl):A252]
, http://www.100md.com
肝炎和肝病基因治疗现状
德国弗莱堡大学医院第二内科
Hubert E. Blum
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是世界上某些地区最常见的感染性疾病，这些病因引起肝硬化和肝细胞癌(HCC)造成了相当高的发病率和病死率。HCC发病机制的核心是各种基因的突变和遗传上的不稳定性，这在大部分病例是因慢性肝病以及伴发的对肝细胞的再生和有丝分裂活性的促进所致。对病毒性肝炎和HCC基因治疗的概念可分为几个范畴：基因替代或修复、基因放大、基因表达的阻断以及DNA疫苗接种。
病毒性肝炎 从遗传学观点看，乙型和丙型病毒性肝炎是获得性遗传病(意为遗传对感染的易感性有重要影响)，对这些病是有可能通过在不同水平上阻断病毒基因的表达或阻断基因功能来治疗的。当前正在探索的遗传学的抗病毒策略包括核酶(ribozymes)反义寡核苷酸和干扰肽或蛋白质，包括优势负突变物(dominant negative mutants)以及单链抗体(“细胞内免疫”)。DNA疫苗接种是一种新的治疗学上的抗病毒策略，现已有人研究以此方法治疗乙型和丙型慢性肝炎。
, http://www.100md.com
肝细胞癌 鉴于肝癌发生原因的遗传学复杂性，迄今为止大多数研究都以基因放大的实验性治疗策略为重点。编码细胞因子，如IL-2、IL-4或肿瘤坏死因子(TNF)α的基因能诱发、促进或放大针对HCC细胞的免疫反应；“自杀基因”能编码一些酶， 这些酶能催化无毒性前体药转化为细胞毒性物质，并使被转导的恶性肿瘤细胞变得对无毒性前体药敏感。在恶性肿瘤表型与肿瘤抑制基因p53的突变相关的情况下，引入野生型p53基因能使肿瘤对化疗药物的敏感性恢复。进一步说，接种DNA疫苗可诱发一种针对HCC特异性抗原的细胞毒性免疫反应。从概念上说，基因疗法也可以包括以诱发癌休眠、抗血管生成为目的的疗法 。
尽管对病毒性肝炎和HCC以核酸为基础的疗法有令人兴奋的前景，但是在这些疗法进入临床应用之前必须对各类递送、针对目标的方法和安全性方面都要着手解决。显然，分子医学和基因疗法正在越来越多地成为我们治疗病人的一部分，并且最终将部分地取代现有的治疗策略。
除了开发和改进治疗病毒性肝炎和HCC的新策略外，实施现有的措施来防止疾病的发展是最重要的。这些措施包括对儿童普遍接种乙肝疫苗、防止食物被黄曲霉素污染、减少饮酒、治疗各种慢性肝炎。
照日摘译, http://www.100md.com
浙医大附属第一医院
陈建忠
关键词：肝炎 疫苗 基因
本院传染病研究所以刘克洲教授为首的科研组，将编码HCV C区和C区加E区抗原基因，构建含有CMV启动子，在真核细胞内高效表达的重组质粒，并联合应用IL-12重组质粒，用DNA免疫技术，将其注入BALB/C小鼠肌肉内，通过检测目的基因表达及特异的细胞和体液免疫反应，证实HCV DNA疫苗在小鼠体内能诱导机体产生免疫效应，为进行灵长类动物实验和临床试验提供理论和实用的科学依据。现将研究结果报告如下：
一、为探讨丙型肝炎病人细胞免疫功能，本课题用3H-TdR掺入法研究丙型肝炎病人外周血单个核细胞(PBMC)对HCV合成肽CP9、NS4和基因重组抗原C、E1、E2、NS3的细胞增殖反应。用荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)检测了PBMC中CD4+、CD8+淋巴细胞亚群在HCV抗原刺激后的变化，从细胞免疫方面优选HCV抗原。结果表明：丙肝病人PBMC对HCV合成肽CP9、NS4和基因重组抗原C、E1、E2、NS3刺激后出现不同程度增殖反应。随着合成肽剂量加大，刺激指数(SI)也逐渐增大。荧光显微镜检测丙肝病人PBMC对HCV合成肽C9，NS4和基因重组抗原C刺激后，CD4+比CD8+细胞增殖反应明显增高，由43.26%分别上升为48.73%、47.07%、49.08%，对CP9和C区抗原增殖反应比刺激前有显著性差异(P<0.05)。
, http://www.100md.com
二、以我国主要流行株HCVⅡ型(1b)为研究株，将主要编码HCV结构蛋白的基因片段(C+E)插入到表达载体pCD-SRα1中，用RT-PCR、dot ELISA和Western blot方法，从基因和蛋白表达水平对重组体进行鉴定后，再以其免疫BALB/C小鼠。结果显示：(1)重组体pCD-HCV(100μg/只)3～4次接种BALB/C小鼠后，血清抗体为100%阳性，水平达0.707～0.773(OD值)，免疫鼠抗体水平达高峰后(0.707)，持续检测18周(0.68～0.75)。空载体pCD-SRα1免疫鼠血清抗体阴性。免疫鼠的脾细胞对HCV合成肽CP9和基因重组抗原C、E1刺激后均出现增殖反应；SI分别为4.14±0.90、3.98±1.58、4.02±1.24。(2)重组体pCD-HCV以不同剂量(10μg、50μg、100μg)分别免疫鼠(n=8)，抗体水平依次为0.11±0.09、0.33±0.04、0.70±0.07，三组间差异有显著性(P<0.01)。(3)pCD-HCV采用灌胃、腹腔注射、皮下注射、肌肉注射(100μg/只×3只)不同途径分别免疫小鼠，抗体产生水平依次为0.138±0.05，0.178±0.07，0.233±0.08，0.691±0.05，统计显示，肌肉注射途径产生的抗体水平最高(P<0.01)。(4)用普鲁卡因100μl(0.4mg)肌肉注射小鼠24小时后，再肌肉注射pCD-HCV(10μg/50μg/只×3次)，抗体水平分别为0.317±0.05和0.690±0.04，比直接肌肉注射同剂量重组体抗体水平(0.11±0.07和0.330±0.04)要明显增高(P<0.01)。
, 百拇医药
三、为提高基因免疫的效果及改变基因免疫的免疫反应类型，对HCV结构区基因重组体联合重组体IL-12(pIL-12)进行实验研究。以稳定表达HCV C蛋白的P815细胞作为靶细胞体外检测CTL反应，稳定表达HCV C蛋白SP2/0细胞用于免疫鼠荷瘤，检测体内CTL反应。结果发现：(1)HCV结构区基因与pIL-12联合免疫，HCV特异性CTL活性明显增强，pC+pIL-12组特异性细胞杀伤率为60.11%±17.37%，pCE1E2+pIL-12为67.48%±15.51%，与pC(18.65%±5.71%)和pCE1E2(29.97%±11.11%)单独免疫组比较均差异显著(P<0.01)，提示pIL-12可增加HCV特异性细胞免疫反应。但联合免疫后抗HCV水平有所下降，pC组抗HCV A值为0.358±0.096，pC+pIL-12组A值为0.210±0.086，两组比较P<0.05：pCE1E2组A值为0.415±0.127，pCE1E2+pIL-12组A值为0.258±0.125，两组差异显著P<0.01，提示IL-12可指导DNA免疫反应由Th2向Th1转型，但单独肌注pIL-12重组体不能诱导出HCV特异CTL反应。(2)免疫鼠荷瘤体内CTL活性研究，在最后一次免疫后4周，于两侧腹部接种能稳定表达HCV C蛋白的SP2/0细胞荷瘤，观察肿瘤大小、发瘤部位和存活时间等，结果：pC和pCE1E2组免疫鼠的发瘤时间明显晚于对照组，并且存活时间明显延长，同样联合pIL-12后，与pC和pCE1E2相比发瘤时间滞后，显示HCV DNA免疫可以在体内诱导HCV特异的CTL反应，联合pIL-12后可显著增加其活性。
, http://www.100md.com
本研究结果为达到预防和治疗丙肝的目的，提供了有明显理论价值和实用意义的科学依据，为成功研制HCV疫苗打下基础。
乙型肝炎治疗疫苗的研究进展
上海医科大学分子病毒学研究室Wen等在第二届国际肝病学研讨会上报告了乙型肝炎抗原-抗体复合物治疗疫苗(CI)的研究进展。
慢性乙肝病毒(HBV)感染可产生严重的后果，如肝硬化和原发性肝癌。由于大多数慢乙肝病人血清HBsAg阳性、抗HBs阴性，而当抗HBs阳转时，HBV被清除，疾病痊愈。因此Wen等认为，对HBsAg的免疫耐受是HBV感染持久存在的主要原因。数种消除HBsAg免疫耐受和诱导免疫反应的免疫原首先在鸭HBV感染模型进行实验。结果显示，抗原-抗体复合物(DHBsAg-抗DHBs)可消除免疫耐受性。Wen等将血浆提取的HBsAg与过量高滴度人抗HBs免疫球蛋白(HBIG)结合物用作治疗疫苗，治疗了14例慢乙肝病人，效果良好。通过对小鼠的研究发现，其主要作用机制是，抗原呈递细胞的Fc受体通过抗HBs的Fc段增加了对HBsAg的摄取。当抗原呈递细胞和T细胞一起孵育时，复合物被摄取，T细胞增殖增加，干扰素γ(IFN-γ)和白介素2(IL-2)水平升高，提示对HBsAg抗原加工和呈递进行了调节。
, 百拇医药
重组HBsAg在免疫复合物中的应用
1998年中国禁止使用从血浆中提取的乙肝疫苗，因此，HBsAg-HBIG治疗疫苗的制备改用重组HBsAg。HBsAg和抗HBs的结合是制备这种免疫复合物治疗疫苗的关键。由于血浆提取抗原和重组抗原的糖基化存在差异，因此用相同来源抗原与其免疫生成的抗HBs的结合能力较好。在优化重组抗原/抗体比值制备免疫复合物疫苗过程中，用Balb/c小鼠来研究此复合物的免疫原性。结果显示，小鼠的抗HBs反应增强，与血浆提取IC的结果类似。
根据上述实验，用酵母菌表达重组HBsAg制备出免疫复合物治疗疫苗，并申请进行临床试验。
低应答小鼠对免疫复合物治疗疫苗的反应
Wen等与Davis协作，在2种小鼠比较了γIC和yHBsAg的免疫原性。B10.S小鼠是低应答种，其对应种B10应答正常。单用HBsAg免疫B10.S小鼠，其抗HBs滴度比B10小鼠低102倍。用IC免疫小鼠，在加强注射后，B10.S小鼠的抗BHs滴度和B10小鼠相似。证明IC的免疫原性较强，提示IC有可能使低应答病人产生抗HBs。
, 百拇医药
鼻内接种免疫复合物治疗疫苗可诱导体液免疫反应
McCluskie等给Balb/c小鼠鼻内接种HBsAg-抗HBs免疫复合物疫苗，结果发现鼻内接种1mg HBsAg不能诱导抗HBs IgG抗体生成，但接种1次IC(含1μg HBsAg)可诱导抗HBs生成(GMT～102)。加强接种后，HBsAg免疫组小鼠均无抗HBs生成，而IC免疫组小鼠抗HBs增加19倍。上述结果表明，黏膜接种IC可诱导良好的体液免疫反应，在我国某些边远地区，鼻内接种IC可取代乙肝疫苗注射接种。
根据上述研究，可以制备多种不同用途的IC治疗疫苗。由于乙型肝炎病人临床表现和发病机制不尽相同，因此需要多种治疗疫苗。
蒋鸿鑫摘译自J Gastroenterd Hepatol[1999,14(Suppl):A252]
, http://www.100md.com
肝炎和肝病基因治疗现状
德国弗莱堡大学医院第二内科
Hubert E. Blum
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是世界上某些地区最常见的感染性疾病，这些病因引起肝硬化和肝细胞癌(HCC)造成了相当高的发病率和病死率。HCC发病机制的核心是各种基因的突变和遗传上的不稳定性，这在大部分病例是因慢性肝病以及伴发的对肝细胞的再生和有丝分裂活性的促进所致。对病毒性肝炎和HCC基因治疗的概念可分为几个范畴：基因替代或修复、基因放大、基因表达的阻断以及DNA疫苗接种。
病毒性肝炎 从遗传学观点看，乙型和丙型病毒性肝炎是获得性遗传病(意为遗传对感染的易感性有重要影响)，对这些病是有可能通过在不同水平上阻断病毒基因的表达或阻断基因功能来治疗的。当前正在探索的遗传学的抗病毒策略包括核酶(ribozymes)反义寡核苷酸和干扰肽或蛋白质，包括优势负突变物(dominant negative mutants)以及单链抗体(“细胞内免疫”)。DNA疫苗接种是一种新的治疗学上的抗病毒策略，现已有人研究以此方法治疗乙型和丙型慢性肝炎。
, http://www.100md.com
肝细胞癌 鉴于肝癌发生原因的遗传学复杂性，迄今为止大多数研究都以基因放大的实验性治疗策略为重点。编码细胞因子，如IL-2、IL-4或肿瘤坏死因子(TNF)α的基因能诱发、促进或放大针对HCC细胞的免疫反应；“自杀基因”能编码一些酶， 这些酶能催化无毒性前体药转化为细胞毒性物质，并使被转导的恶性肿瘤细胞变得对无毒性前体药敏感。在恶性肿瘤表型与肿瘤抑制基因p53的突变相关的情况下，引入野生型p53基因能使肿瘤对化疗药物的敏感性恢复。进一步说，接种DNA疫苗可诱发一种针对HCC特异性抗原的细胞毒性免疫反应。从概念上说，基因疗法也可以包括以诱发癌休眠、抗血管生成为目的的疗法 。
尽管对病毒性肝炎和HCC以核酸为基础的疗法有令人兴奋的前景，但是在这些疗法进入临床应用之前必须对各类递送、针对目标的方法和安全性方面都要着手解决。显然，分子医学和基因疗法正在越来越多地成为我们治疗病人的一部分，并且最终将部分地取代现有的治疗策略。
除了开发和改进治疗病毒性肝炎和HCC的新策略外，实施现有的措施来防止疾病的发展是最重要的。这些措施包括对儿童普遍接种乙肝疫苗、防止食物被黄曲霉素污染、减少饮酒、治疗各种慢性肝炎。
照日摘译, http://www.100md.com