乳腺浸润性导管癌组织中基质金属蛋白酶－9与PCNA及临床指标的研究
作者：梁建芳 郑绘霞 张毅 肖虹 程素珍 李士瑛
单位：梁建芳(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)；郑绘霞(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)；张毅(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)肖虹(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)；程素珍(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)；李士瑛(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)
关键词：乳腺肿瘤；金属蛋白酶类；免疫组织化学
山西医科大学学报000210
摘要： 目的 探讨基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及临床意义。方法 应用免疫组化SP法检测120例乳腺浸润性导管癌患者中MMP-9的表达。结果 120例乳腺癌患者中，阳性表达92例，占76.67%，其中高表达48例，占40%。MMP-9的表达与乳腺癌的PCNA表达、TNM分期、淋巴结状况、肿瘤大小相关，与年龄、月经状况、ER表达无关。结论 MMP-9的表达，可以作为估计乳腺浸润性导管癌预后及术后综合治疗的生物学指标。
, http://www.100md.com
中图分类号： R362 文献标识码： A
文章编号：1007-6611(2000)02-0119-03
Expression and significance of matrix metalloproteinase-9 and PCNA in breast cancer
Liang Jianfang,Zheng Huixia,Zhang Yi,et al
(Dept. of Pathological, 1st Clinical Medical College,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)
Abstract： Objective To study the expression and clinical significance of matrix metalloproteinase-9(MMP-9) in breast cancer.Method Applying SP immunohistochemical technique,expression of MMP-9 was studied in 120 patients with primary breast cancer.Results There were 76.67%(92/120) of patients with MMP-9 expression and 40%(48/120) with high MMP-9 expression.There was a significant correlation between MMP-9 expression and PCNA，TNM stage,lymph node status,tumor size.However,the relationship had not been found to patient age,menopause status as well as ER status.Conclusion MMP-9 appears to be an independent biological marker for predicting prognosis and comprehensive treat of breast cancer.
, 百拇医药
Key words: breast neoplasms; metalloproteinases; immunohistochemistrys
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其死亡率与癌细胞的增殖侵袭、转移潜能有密切关系。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)通过对细胞外基质(extracell matrix,ECM)降解促进癌细胞对周围组织的侵润[1]。而增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达状况与肿瘤细胞增殖活性和肿瘤生物学行为密切相关。我们应用免疫组化SP法，研究MMP-9在120例乳腺癌中的表达情况，探讨其在临床诊断、治疗中的意义。
1 材料与方法
1.1 标本 收取1997-06～1999-06在我院诊治的女性乳腺浸润性导管癌患者120例，年龄36～75岁，平均47岁。全组病例均行乳腺癌根治术或改良根治术，并经病理证实(术前均未行放疗、化疗)。临床分期参照1969年国际抗癌协会TNM分期方法分期。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 单克隆抗体MMP-9、PCNA、ER及SP试剂盒均购自迈新公司。
1.3 免疫组化SP法 第一抗体种类及工作浓度分别为NMP-9 1∶100，PCNA[PC10]1∶100，ER 1∶50，根据试剂盒说明书进行操作，苏木素复染胞核。用PBS液代替一抗作阴性对照，用已知阳性标本切片作阳性对照。
1.4 阳性结果判断 MMP-9以细胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞信号，PCNA及ER以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性信号，阳性细胞数<10%为阴性，阳性细胞数在10%～25%为(+)，25%～50%(
)，>50%为(
)，为高表达。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
MMP-9染色主要位于癌细胞胞浆中(见图1)，120例乳腺浸润性导管癌的病例中阳性表达92例，占76.67%，其中高表达48例，占40%。PCNA染色主要位于癌细胞细胞核中(见图2)，阳性表达75例，占62.5%。
图1 MMP-9在乳腺浸润性导管癌中的表达(×200)
图2 PCNA在乳腺浸润性导管癌中的表达(×400)
MMP-9的阳性表达，与患者的年龄、月经状况、ER状况无显著性差异，P值均大于0.05，与PCNA、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小有显著差异，P值均小于0.05。同时本研究还显示，高表达多见于PCNA阳性、TNM分期晚、肿瘤组织大及易发生侵润、转移的病例中，结果见表1。表1 MMP-9在乳腺癌中的表达与临床指标的关系 临床指标
, http://www.100md.com
n
MMP-9阳性表达
χ2
P
MMP-9高表达
χ2
P
+～
阳性率
(%)
百分率
(%)
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PCNA
-
45
75
24
68
53.33
90.67
21.913
<0.005
11
37
24.44
, http://www.100md.com
49.33
7.259
<0.01
ER状况
+
-
84
36
65
27
77.38
75.00
0.079 9
, 百拇医药
>0.05
36
12
42.86
33.33
0.952 4
>0.05
年龄
<50
≥50
56
64
41
, http://www.100md.com
51
73.21
79.69
0.699 5
>0.05
26
22
46.43
34.38
1.808
>0.05
肿瘤大小(cm)
<20cm
, http://www.100md.com
2.1～5.0cm
>5.0cm
36
54
30
23
41
28
63.89
75.93
93.33
7.98
<0.025
, 百拇医药
10
19
19
27.78
35.19
63.33
9.576
<0.01
月经状况
绝经前
绝经后
58
62
, 百拇医药
47
45
81.03
72.58
1.197 2
>0.05
26
22
44.83
34.92
1.090 1
>0.05
淋巴结转移
, 百拇医药
+
-
71
49
63
29
88.73
59.18
14.150 4
<0.005
37
11
52.11
, 百拇医药
22.45
10.629 5
<0.005
临床分期
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
45
33
22
20
28
, 百拇医药
27
19
18
62.22
81.82
86.36
90.00
10.265 1
<0.025
8
12
13
15
, http://www.100md.com
17.78
36.36
59.09
75.00
22.98
<0.005
3 讨论
乳腺癌的侵润和转移是一个复杂的过程，其中关键之一就是基底膜(basement membrane,BM)的降解，IV胶原是BM的主要支架。大量研究证明基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质(extracell matrix,ECM)，促进肿瘤的侵袭与转移，其中最主要的是MMP-9。MMP-9是基质金属蛋白酶家族中分子量最大的酶，它以酶原的形式分泌，被激活后，形成Ⅳ胶原酶，降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质中的Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶，然后肿瘤细胞沿着缺失的BM向周围组织侵润，最终导致肿瘤的侵袭和转移。
, http://www.100md.com
乳腺癌患者的预后不仅与手术时肿瘤分期和肿瘤切除的彻底性有关，而且与所采取的综合治疗措施有关。临床上虽然有些患者肿瘤分期、淋巴转移状况及治疗情况相同，但由于肿瘤生物学行为不尽一致，其预后也存在较大差异。因此，从分子水平研究其生物学行为，对术后治疗有重要意义。对MMPs的研究国内外不少学者从不同角度已做了不少工作。1993年，Davies等[3]应用明胶酶谱法发现明胶酶原B的表达和活性随着乳腺癌分级的增加而增高；Wolf等[4]报道了在乳腺癌中MMP-9 mRNA的表达与腋窝淋巴结的转移成正相关；Yoshimoto[5]等对结肠癌中基质溶解素mRNA的表达进行了研究，发现随着Dukes分期的增高，在肝转移癌中达到最高。国内卜文等[6]研究了肝癌中MMP-9的高表达原发性肝癌的侵润和转移有很强的相关性。关于乳腺癌中PCNA的研究，国内外学者都做了大量的工作，发现乳腺癌PCNA阳性核区域显著大于良性对照组，乳腺癌的PCNA分数大于高于临近的正常上皮，PCNA作为一个内源性增殖细胞的标记物，与乳腺癌的增生活性、癌的转移及预后关系密切[7]。
, 百拇医药
本组实验对120例乳腺浸润性导管癌应用免疫组织化学SP法进行了检测，结果显示MMP-9的表达与患者的年龄、月经状况及激素状况无关(P>0.05)。但MMP-9的表达在有淋巴结转移及无淋巴结转移的阳性率之间有显著差异(P<0.05)；MMP-9与PCNA的阳性表达率呈正相关(P<0.005)，推测基质金属蛋白酶的释放与细胞增殖活跃有一定的相关性；MMP-9的阳性表达率与TNM分期以及肿瘤大小呈正相关(均P<0.05)，与报道结果一致，其中高表达的差异更为显著(均P<0.01)。在肿瘤直径<2.0 cm的10例MMP-9高表达的患者中，有1例腋窝淋巴结内可见癌转移(1/15)。在淋巴结没有转移但MMP-9高表达的11例患者中，有2例在间质小血管内可见癌栓。从实验结果可以看出，MMP-9高表达者，在其TNM分期晚，肿瘤较大，分化不好，并且易出现淋巴结转移。MMP-9表达是影响乳腺癌生存率的高危因素，可以作为术后治疗的一个独立参数，尤其是肿瘤直径小、未见淋巴结转移，但MMP-9高表达者，其转移复发的机会很大，应引起重视。
综上所述，免疫组织化学SP法检测MMP-9结果与酶谱法、West-blotting结论一致，但SP法具有简便、快速、直观，有利于临床推广使用，根据染色阳性细胞数及强度，结合PCNA的检测有利于对容易出现转移的高危患者及早综合治疗，提高患者的生存率。
, 百拇医药
作者简介：梁建芳，男，1960年1月生，硕士，主治医师
参考文献：
[1] 吴登龙，张元芳.基质金属蛋白酶及其抑制剂与泌尿系肿瘤的侵润与转移[J].国外医学泌尿系统分册，1998，18(1)：30～33.
[2] 陈忠年，沈铭昌，郭慕依.实用外科病理学[M].上海：上海医科大学出版社,1997.601.
[3] Davies B,Miles DW,Happerefield LC,et al.Activity of type Ⅳ collagenases in benign and malignant breast disease[J]. Br J Cancer,1993，67:1126～1131.
[4] Wolf C,Rouyer N,Lutz Y,et al.Stromelysin 3 belongs to a subgroup of proteinases expressed in breast carcinoma fibroblastic cells and possibly implicated in tumor progression[J].Proc Natl Acade Sci USA,1993,90:1843.
[5] Yoshimoto M.Itoh F,Yamamoto H,et al.Expression of MMP-7 mRNA in human colorectal cancers[J].Int J Cancer,1993,54:614～618.
[6] 卜文，汤钊，刘康达,等.基质金 属蛋白酶在肝癌侵袭转移中的作用[J].中华外科杂志，1998，36(9)：571.
[7] 许凤琼.增殖细胞核抗原与乳腺癌预后的关系[J].广西医学，1997，19(3)：397～398.
收稿日期：1999-12-02, 百拇医药
单位：梁建芳(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)；郑绘霞(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)；张毅(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)肖虹(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)；程素珍(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)；李士瑛(山西医科大学第一临床医学院病理科 太原 030001)
关键词：乳腺肿瘤；金属蛋白酶类；免疫组织化学
山西医科大学学报000210
摘要： 目的 探讨基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及临床意义。方法 应用免疫组化SP法检测120例乳腺浸润性导管癌患者中MMP-9的表达。结果 120例乳腺癌患者中，阳性表达92例，占76.67%，其中高表达48例，占40%。MMP-9的表达与乳腺癌的PCNA表达、TNM分期、淋巴结状况、肿瘤大小相关，与年龄、月经状况、ER表达无关。结论 MMP-9的表达，可以作为估计乳腺浸润性导管癌预后及术后综合治疗的生物学指标。
, http://www.100md.com
中图分类号： R362 文献标识码： A
文章编号：1007-6611(2000)02-0119-03
Expression and significance of matrix metalloproteinase-9 and PCNA in breast cancer
Liang Jianfang,Zheng Huixia,Zhang Yi,et al
(Dept. of Pathological, 1st Clinical Medical College,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)
Abstract： Objective To study the expression and clinical significance of matrix metalloproteinase-9(MMP-9) in breast cancer.Method Applying SP immunohistochemical technique,expression of MMP-9 was studied in 120 patients with primary breast cancer.Results There were 76.67%(92/120) of patients with MMP-9 expression and 40%(48/120) with high MMP-9 expression.There was a significant correlation between MMP-9 expression and PCNA，TNM stage,lymph node status,tumor size.However,the relationship had not been found to patient age,menopause status as well as ER status.Conclusion MMP-9 appears to be an independent biological marker for predicting prognosis and comprehensive treat of breast cancer.
, 百拇医药
Key words: breast neoplasms; metalloproteinases; immunohistochemistrys
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其死亡率与癌细胞的增殖侵袭、转移潜能有密切关系。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)通过对细胞外基质(extracell matrix,ECM)降解促进癌细胞对周围组织的侵润[1]。而增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达状况与肿瘤细胞增殖活性和肿瘤生物学行为密切相关。我们应用免疫组化SP法，研究MMP-9在120例乳腺癌中的表达情况，探讨其在临床诊断、治疗中的意义。
1 材料与方法
1.1 标本 收取1997-06～1999-06在我院诊治的女性乳腺浸润性导管癌患者120例，年龄36～75岁，平均47岁。全组病例均行乳腺癌根治术或改良根治术，并经病理证实(术前均未行放疗、化疗)。临床分期参照1969年国际抗癌协会TNM分期方法分期。
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1.2 试剂 单克隆抗体MMP-9、PCNA、ER及SP试剂盒均购自迈新公司。
1.3 免疫组化SP法 第一抗体种类及工作浓度分别为NMP-9 1∶100，PCNA[PC10]1∶100，ER 1∶50，根据试剂盒说明书进行操作，苏木素复染胞核。用PBS液代替一抗作阴性对照，用已知阳性标本切片作阳性对照。
1.4 阳性结果判断 MMP-9以细胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞信号，PCNA及ER以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性信号，阳性细胞数<10%为阴性，阳性细胞数在10%～25%为(+)，25%～50%(
)，>50%为()，为高表达。, 百拇医药
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
MMP-9染色主要位于癌细胞胞浆中(见图1)，120例乳腺浸润性导管癌的病例中阳性表达92例，占76.67%，其中高表达48例，占40%。PCNA染色主要位于癌细胞细胞核中(见图2)，阳性表达75例，占62.5%。
图1 MMP-9在乳腺浸润性导管癌中的表达(×200)
图2 PCNA在乳腺浸润性导管癌中的表达(×400)
MMP-9的阳性表达，与患者的年龄、月经状况、ER状况无显著性差异，P值均大于0.05，与PCNA、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小有显著差异，P值均小于0.05。同时本研究还显示，高表达多见于PCNA阳性、TNM分期晚、肿瘤组织大及易发生侵润、转移的病例中，结果见表1。表1 MMP-9在乳腺癌中的表达与临床指标的关系 临床指标
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n
MMP-9阳性表达
χ2
P
MMP-9高表达
χ2
P
+～
阳性率
(%)
百分率
(%)
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PCNA
-
45
75
24
68
53.33
90.67
21.913
<0.005
11
37
24.44
, http://www.100md.com
49.33
7.259
<0.01
ER状况
+
-
84
36
65
27
77.38
75.00
0.079 9
, 百拇医药
>0.05
36
12
42.86
33.33
0.952 4
>0.05
年龄
<50
≥50
56
64
41
, http://www.100md.com
51
73.21
79.69
0.699 5
>0.05
26
22
46.43
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1.808
>0.05
肿瘤大小(cm)
<20cm
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2.1～5.0cm
>5.0cm
36
54
30
23
41
28
63.89
75.93
93.33
7.98
<0.025
, 百拇医药
10
19
19
27.78
35.19
63.33
9.576
<0.01
月经状况
绝经前
绝经后
58
62
, 百拇医药
47
45
81.03
72.58
1.197 2
>0.05
26
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>0.05
淋巴结转移
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+
-
71
49
63
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88.73
59.18
14.150 4
<0.005
37
11
52.11
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22.45
10.629 5
<0.005
临床分期
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
45
33
22
20
28
, 百拇医药
27
19
18
62.22
81.82
86.36
90.00
10.265 1
<0.025
8
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13
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17.78
36.36
59.09
75.00
22.98
<0.005
3 讨论
乳腺癌的侵润和转移是一个复杂的过程，其中关键之一就是基底膜(basement membrane,BM)的降解，IV胶原是BM的主要支架。大量研究证明基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质(extracell matrix,ECM)，促进肿瘤的侵袭与转移，其中最主要的是MMP-9。MMP-9是基质金属蛋白酶家族中分子量最大的酶，它以酶原的形式分泌，被激活后，形成Ⅳ胶原酶，降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质中的Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶，然后肿瘤细胞沿着缺失的BM向周围组织侵润，最终导致肿瘤的侵袭和转移。
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乳腺癌患者的预后不仅与手术时肿瘤分期和肿瘤切除的彻底性有关，而且与所采取的综合治疗措施有关。临床上虽然有些患者肿瘤分期、淋巴转移状况及治疗情况相同，但由于肿瘤生物学行为不尽一致，其预后也存在较大差异。因此，从分子水平研究其生物学行为，对术后治疗有重要意义。对MMPs的研究国内外不少学者从不同角度已做了不少工作。1993年，Davies等[3]应用明胶酶谱法发现明胶酶原B的表达和活性随着乳腺癌分级的增加而增高；Wolf等[4]报道了在乳腺癌中MMP-9 mRNA的表达与腋窝淋巴结的转移成正相关；Yoshimoto[5]等对结肠癌中基质溶解素mRNA的表达进行了研究，发现随着Dukes分期的增高，在肝转移癌中达到最高。国内卜文等[6]研究了肝癌中MMP-9的高表达原发性肝癌的侵润和转移有很强的相关性。关于乳腺癌中PCNA的研究，国内外学者都做了大量的工作，发现乳腺癌PCNA阳性核区域显著大于良性对照组，乳腺癌的PCNA分数大于高于临近的正常上皮，PCNA作为一个内源性增殖细胞的标记物，与乳腺癌的增生活性、癌的转移及预后关系密切[7]。
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本组实验对120例乳腺浸润性导管癌应用免疫组织化学SP法进行了检测，结果显示MMP-9的表达与患者的年龄、月经状况及激素状况无关(P>0.05)。但MMP-9的表达在有淋巴结转移及无淋巴结转移的阳性率之间有显著差异(P<0.05)；MMP-9与PCNA的阳性表达率呈正相关(P<0.005)，推测基质金属蛋白酶的释放与细胞增殖活跃有一定的相关性；MMP-9的阳性表达率与TNM分期以及肿瘤大小呈正相关(均P<0.05)，与报道结果一致，其中高表达的差异更为显著(均P<0.01)。在肿瘤直径<2.0 cm的10例MMP-9高表达的患者中，有1例腋窝淋巴结内可见癌转移(1/15)。在淋巴结没有转移但MMP-9高表达的11例患者中，有2例在间质小血管内可见癌栓。从实验结果可以看出，MMP-9高表达者，在其TNM分期晚，肿瘤较大，分化不好，并且易出现淋巴结转移。MMP-9表达是影响乳腺癌生存率的高危因素，可以作为术后治疗的一个独立参数，尤其是肿瘤直径小、未见淋巴结转移，但MMP-9高表达者，其转移复发的机会很大，应引起重视。
综上所述，免疫组织化学SP法检测MMP-9结果与酶谱法、West-blotting结论一致，但SP法具有简便、快速、直观，有利于临床推广使用，根据染色阳性细胞数及强度，结合PCNA的检测有利于对容易出现转移的高危患者及早综合治疗，提高患者的生存率。
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作者简介：梁建芳，男，1960年1月生，硕士，主治医师
参考文献：
[1] 吴登龙，张元芳.基质金属蛋白酶及其抑制剂与泌尿系肿瘤的侵润与转移[J].国外医学泌尿系统分册，1998，18(1)：30～33.
[2] 陈忠年，沈铭昌，郭慕依.实用外科病理学[M].上海：上海医科大学出版社,1997.601.
[3] Davies B,Miles DW,Happerefield LC,et al.Activity of type Ⅳ collagenases in benign and malignant breast disease[J]. Br J Cancer,1993，67:1126～1131.
[4] Wolf C,Rouyer N,Lutz Y,et al.Stromelysin 3 belongs to a subgroup of proteinases expressed in breast carcinoma fibroblastic cells and possibly implicated in tumor progression[J].Proc Natl Acade Sci USA,1993,90:1843.
[5] Yoshimoto M.Itoh F,Yamamoto H,et al.Expression of MMP-7 mRNA in human colorectal cancers[J].Int J Cancer,1993,54:614～618.
[6] 卜文，汤钊，刘康达,等.基质金 属蛋白酶在肝癌侵袭转移中的作用[J].中华外科杂志，1998，36(9)：571.
[7] 许凤琼.增殖细胞核抗原与乳腺癌预后的关系[J].广西医学，1997，19(3)：397～398.
收稿日期：1999-12-02, 百拇医药