PDGF在低氧内皮细胞条件培养基促猪肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用*
作者：廖国宁 陈蓓蓓 雷景迈 何善述
单位：同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030
关键词：低氧；肺动脉高压；血小板源性生长因子；细胞增殖
同济医科大学学报000205 摘要：为了探索低氧条件下猪肺动脉内皮细胞(PAEC )对猪肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖调控关系，应用MTT比色法，DNA荧光测定法观察了 外源性PDGF促PASMC增殖作用，以及Suramin抑制PDGF促增殖作用的效应，并在此基础上研究 了猪肺动脉内皮细胞条件培养基(HECCM)中PDGF促PASMC增殖的作用。结果表明，HECCM促P ASMC增殖作用的效应可被Suramin部分抑制，由此证明，PDGF是低氧刺激PAEC产生的一种促P ASMC增殖的重要因子。
中图法分类号：R322.1， Q592.1， R364.4
, 百拇医药
The Effect of Platelet-derived Growth F actor in Hypoxic Endothelial Cells Conditioned Medium on the Pulmonary Artery Smooth Muscle Cell Proliferation
Liao Guoning，Chen Beibei，Lei Jingmai et al
Department of Biochemistry，Tongji Medical University ， Wuhan 430030
Abstract：In order to study the effect of platelet-derived grow th factor (PDGF) in hypoxic endothelial cells conditioned medium (HECCM) on the pulmonary artery smooth muscle cell (PASMC) proliferation, MTT colorimetry and D NA fluoremetry were used to observe the enhancement of PASMC proliferation by ex ogenous PEGF and the inhibitory effects of Suramin on the enhancement of PDGF. Based on the above findings, the promotion of PDGF in HECCM on PASMC pro liferation was studied. The results showed that PDGF in HECCM could promote the proliferation of PASMC, which could be partly inhibited by Suramin. It was sugg ested that PDGF, produced by pulmonary artery endotherial cells through hypoxic stimulation, might be an important factor promoting PASMC proliferation.
, 百拇医药
Key words：hypoxia; pulmonary artery hypertension; plaletet-d erived growth factor; cell proliferation
肺血管结构改建是低氧性肺动脉高压(pulmonary hypertension，PHT)形成的重要基础， 而肺血管平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell，PASMC)的异常增殖又是肺 血管壁结构改建的一个重要因素。研究发现低氧的猪肺动脉内皮细胞条件培养基(hypoxic endothelial cells conditioned medium，HECCM)对PASMC有明显的促增殖作用，常氧的猪 肺动脉内皮细胞条件培养基(normoxic endothelial cell conditioned medium，NECCM) 或直接低氧对PASMC均无明显增殖作用[1]。因而推断，低氧可能刺激肺动脉内皮细 胞(pu lmonary artery endothelial cell，PAEC)分泌某种或某些促进PASMC增殖的因子。近年来 实验表明慢性低氧可刺激EC增强表达PDGF-mRNA及其蛋白[2，3]。为此本课题就PD G F在HECCM促PASMC增殖中的作用进行了研究，为进一步深入探讨肺血管结构改建形成PHT的机 制提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
无血清培养基(SFM)、胎牛血清(FCS)、199培养基(M199)、血小板源性生长因子(PDG F)等购自Sigma公司；胰蛋白酶为进口分装；Suramin由英国伦敦大学医学院Dr.Mark Carro ll惠赠；二氧化碳培养箱(美国Shell实验室产品)。
1.2 方法
1.2.1PAEC及PASMC的收集、培养：① PAEC：在无菌条件下取猪肺动脉干及左右肺动脉 ，向肺动脉腔内注入2.5g/L胰蛋白酶消化液，37℃消化15～20 min，加入EC培养液(含 20 0 ml/L FCS的M199)，1500 r/min离心5min，再加入EC培养液，37℃、5%CO2培养箱内 培养至次汇合后即可传代。② PASMC：在无菌条件下取猪肺动脉中膜肌层，切成约1 mm3 大小，置于胶原酶液中，37℃振摇消化8～12 h，1000 r/min离心5 min，加入SMC培养液( 含200 ml/L FCS的M199)，37℃、5% CO2培养箱内培养至次汇合后即可传代。
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1.2.2 内皮细胞条件培养基(ECCM)的制备： 将第二代生长融合的PAEC改换SFM 5 ml， 随机分成两组：NECCM组直接于37℃、5% CO2培养箱培养24 h，HECCM组在培养前先向培 养瓶内通入氮气，放入培养箱中培养24 h(相当于含3%的O2)，分别收集培养液，1000 r/min离心10 min，吸取上清液，经0.22 μm微孔滤膜除菌即为NECCM和HECCM，置-20℃保 存备用。
1.2.3 PASMC实验分组: 将第三代PASMC稀释至1.3×105/ml，种于96孔板(150 μl/ 孔)，培养24 h后，换用SFM培养36 h，使细胞处于G0/G1期。按下述分组加入条件培养 液(100 μl/孔)，培养48 h。①PDGF组：0.5 ng，0.1 ng，0.01 ng PDGF/100 μl SF M；②PDGF+Suramin组：上述PDGF各组中均加入0.143 mg Suramin；③ SFM对照组：100 μl SFM/孔；④ Suramin 对照组：0.143 mg Suramin/100 μl SFM；⑤ HE组：100 μl H ECCM；⑥ NE组：100 μl NECCM；⑦ HE+Suramin组：100 μl HECCM中含0.143mg Surami n；⑧ NE+Suramin组：100 μl NECCM中含0.143 mg Suramin。
, 百拇医药
1.2.4 细胞增殖指标采用MTT比色法及DNA荧光测定法: 将上述各实验组分别按MTT和细胞 DNA测定程序处理，进行MTT比色和细胞DNA微量荧光测定。
1.2.5 统计学处理: 上述各种检测结果均用SAS统计软件包进行统计分析处理。
2 结果
2.1 PAEC与PASMC的鉴定
参见文献[8]。
2.2 外源性PDGF对PASMC增殖的影响
MTT比色和DNA测定结果显示，不同PDGF含量组分别与SFM对照组相比差异均呈显著性 ，并呈明显正相关，不同PDGF含量组MTT比色结果和DNA测定结果的相关系数r值分别为0.97 7 8和0.993 5，提示外源PDGF能明显促进PASMC增殖，并呈很好的量效关系。Suramin具有 明显抑制PDGF促细胞增殖的作用。
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2.3 各种ECCM对PASMC增殖的影响
MTT比色和DNA测定结果显示，HE组与NE组、HE+Suramin组等各组之间差异均呈极显 著性，说明HECCM中含有一种内源性因子，且其促PASMC的增殖作用可被Suramin所抑制，参 照外源性PDGF促PASMC增殖实验的结果，推测这种促PASMC增殖的内源性因子是PDGF。NE组与 NE+Suramin组之间的差异没有显著性，说明这种内源性的PDGF是在低氧条件刺激下由EC合 成分泌的。
3 讨论
近年来，肺血管结构改建在PHT发生中的作用受到重视，有学者认为PHT不是功能性疾病，而 主要是一种器质性疾病。低氧引起PHT时，肺动脉壁内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的 增殖、分化及细胞外基质形成增多是肺血管器质性病变的原因和血管结构重组的基础。故低 氧条件下PAEC与PASMC相互作用的研究成为热点。1989年Madtes等推断PDGF参与了PHT的形成 过程[4]；Joseph等亦报道慢性低氧可以刺激EC产生PDGF[5]。故本文在充 分证明外源性PDGF对PASMC具有量效关系的促增殖作用，以及Suramin可完全抑制其作用的基 础上研究了HECCM中PDGF的促PASMC增殖作用。实验结果表明HECCM的促PASMC增殖效应同样可 被Suramin显著抑制(P<0.01)，提示低氧可刺激PAEC合成和分泌PDGF，后者是HECCM 促PASMC增殖的一个重要因子。PDGF促细胞增殖的作用是通过其与PASMC膜上的PDGF受体特异 性结合，引起受体自身磷酸化和细胞内相关蛋白磷酸化等多级信号传导步骤，诱导细胞DNA 合成和有丝分裂应答而实现的[6]。至于Suramin抑制PDGF作用的机理，可能是由于 Suramin能高亲和结合PDGF而阻止其与受体结合，对已与PDGF受体结合的PDGF，Suramin亦可 将其从PDGF受体上解离下来[7]。故根据目前资料Suramin对PDGF促细胞增殖的抑制 作用仅在细胞膜受体，对于胞内的信号传导途径有无影响尚待研究阐明。至于HE+Suramin 组与NE组相比差异有显著性，说明当HECCM中PDGF的促PASMC增殖效应被Suramin抑制后，尚 有其它生物活性因子引起的细胞增殖效应。推测至少尚有多胺的参与。这部分内容将在另篇 论文中报道[8]。
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国家自然科学基金资助项目(No. 39270295)
廖国宁，男，1962年生，博士研究生
参考文献
1，肖芳，车东媛，张婉蓉. 缺氧内皮细胞条件培养基对肺动脉平滑肌细胞生长的 影响. 中华病理学杂志，1993，22(3)：166
2，Kouembanas S，Hannon R L. Oxygen tension regulates the expression of the platelet-derived growth factor-B chain gene in human endothelial cells. J Clin Invest，1990，86：670
3，Paul E，Daniel F，Bowen P. Cultured endothelial cells produce a plat elet-derived growth factor-like protein. Proc Natl Acad Sci USA，1983，80：191 9
, http://www.100md.com
4，Madtes D K. Modulation of local concentrations of platelet-derived growth factor. Am Rev Respir Dis ，1989，140：1118
5，Joseph P M，Thompson B T. Effect of hypoxia on the secretion of plat elet-derived growth factor by bovine pulmonary artery endothelial cell. Am R ev Respir Dis，1990，141：A346
6，Lena W. Platelet-derived growth factor receptor signals. J Biol Che m，1994，269：32023
7，Hhosang M. Suramin binds to platelet-derived growth factor and inhi bits its biological activity. J Cell Biochem，1985，29：265
8，廖国宁，雷景迈，何善述. 多胺在低氧内皮细胞条件培养基促猪肺动脉平滑肌 细胞增殖中的作用. 同济医科大学学报，1998，27(4)：249
(收稿：1998-04-20), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030
关键词：低氧；肺动脉高压；血小板源性生长因子；细胞增殖
同济医科大学学报000205 摘要：为了探索低氧条件下猪肺动脉内皮细胞(PAEC )对猪肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖调控关系，应用MTT比色法，DNA荧光测定法观察了 外源性PDGF促PASMC增殖作用，以及Suramin抑制PDGF促增殖作用的效应，并在此基础上研究 了猪肺动脉内皮细胞条件培养基(HECCM)中PDGF促PASMC增殖的作用。结果表明，HECCM促P ASMC增殖作用的效应可被Suramin部分抑制，由此证明，PDGF是低氧刺激PAEC产生的一种促P ASMC增殖的重要因子。
中图法分类号：R322.1， Q592.1， R364.4
, 百拇医药
The Effect of Platelet-derived Growth F actor in Hypoxic Endothelial Cells Conditioned Medium on the Pulmonary Artery Smooth Muscle Cell Proliferation
Liao Guoning，Chen Beibei，Lei Jingmai et al
Department of Biochemistry，Tongji Medical University ， Wuhan 430030
Abstract：In order to study the effect of platelet-derived grow th factor (PDGF) in hypoxic endothelial cells conditioned medium (HECCM) on the pulmonary artery smooth muscle cell (PASMC) proliferation, MTT colorimetry and D NA fluoremetry were used to observe the enhancement of PASMC proliferation by ex ogenous PEGF and the inhibitory effects of Suramin on the enhancement of PDGF. Based on the above findings, the promotion of PDGF in HECCM on PASMC pro liferation was studied. The results showed that PDGF in HECCM could promote the proliferation of PASMC, which could be partly inhibited by Suramin. It was sugg ested that PDGF, produced by pulmonary artery endotherial cells through hypoxic stimulation, might be an important factor promoting PASMC proliferation.
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Key words：hypoxia; pulmonary artery hypertension; plaletet-d erived growth factor; cell proliferation
肺血管结构改建是低氧性肺动脉高压(pulmonary hypertension，PHT)形成的重要基础， 而肺血管平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell，PASMC)的异常增殖又是肺 血管壁结构改建的一个重要因素。研究发现低氧的猪肺动脉内皮细胞条件培养基(hypoxic endothelial cells conditioned medium，HECCM)对PASMC有明显的促增殖作用，常氧的猪 肺动脉内皮细胞条件培养基(normoxic endothelial cell conditioned medium，NECCM) 或直接低氧对PASMC均无明显增殖作用[1]。因而推断，低氧可能刺激肺动脉内皮细 胞(pu lmonary artery endothelial cell，PAEC)分泌某种或某些促进PASMC增殖的因子。近年来 实验表明慢性低氧可刺激EC增强表达PDGF-mRNA及其蛋白[2，3]。为此本课题就PD G F在HECCM促PASMC增殖中的作用进行了研究，为进一步深入探讨肺血管结构改建形成PHT的机 制提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 材料
无血清培养基(SFM)、胎牛血清(FCS)、199培养基(M199)、血小板源性生长因子(PDG F)等购自Sigma公司；胰蛋白酶为进口分装；Suramin由英国伦敦大学医学院Dr.Mark Carro ll惠赠；二氧化碳培养箱(美国Shell实验室产品)。
1.2 方法
1.2.1PAEC及PASMC的收集、培养：① PAEC：在无菌条件下取猪肺动脉干及左右肺动脉 ，向肺动脉腔内注入2.5g/L胰蛋白酶消化液，37℃消化15～20 min，加入EC培养液(含 20 0 ml/L FCS的M199)，1500 r/min离心5min，再加入EC培养液，37℃、5%CO2培养箱内 培养至次汇合后即可传代。② PASMC：在无菌条件下取猪肺动脉中膜肌层，切成约1 mm3 大小，置于胶原酶液中，37℃振摇消化8～12 h，1000 r/min离心5 min，加入SMC培养液( 含200 ml/L FCS的M199)，37℃、5% CO2培养箱内培养至次汇合后即可传代。
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1.2.2 内皮细胞条件培养基(ECCM)的制备： 将第二代生长融合的PAEC改换SFM 5 ml， 随机分成两组：NECCM组直接于37℃、5% CO2培养箱培养24 h，HECCM组在培养前先向培 养瓶内通入氮气，放入培养箱中培养24 h(相当于含3%的O2)，分别收集培养液，1000 r/min离心10 min，吸取上清液，经0.22 μm微孔滤膜除菌即为NECCM和HECCM，置-20℃保 存备用。
1.2.3 PASMC实验分组: 将第三代PASMC稀释至1.3×105/ml，种于96孔板(150 μl/ 孔)，培养24 h后，换用SFM培养36 h，使细胞处于G0/G1期。按下述分组加入条件培养 液(100 μl/孔)，培养48 h。①PDGF组：0.5 ng，0.1 ng，0.01 ng PDGF/100 μl SF M；②PDGF+Suramin组：上述PDGF各组中均加入0.143 mg Suramin；③ SFM对照组：100 μl SFM/孔；④ Suramin 对照组：0.143 mg Suramin/100 μl SFM；⑤ HE组：100 μl H ECCM；⑥ NE组：100 μl NECCM；⑦ HE+Suramin组：100 μl HECCM中含0.143mg Surami n；⑧ NE+Suramin组：100 μl NECCM中含0.143 mg Suramin。
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1.2.4 细胞增殖指标采用MTT比色法及DNA荧光测定法: 将上述各实验组分别按MTT和细胞 DNA测定程序处理，进行MTT比色和细胞DNA微量荧光测定。
1.2.5 统计学处理: 上述各种检测结果均用SAS统计软件包进行统计分析处理。
2 结果
2.1 PAEC与PASMC的鉴定
参见文献[8]。
2.2 外源性PDGF对PASMC增殖的影响
MTT比色和DNA测定结果显示，不同PDGF含量组分别与SFM对照组相比差异均呈显著性 ，并呈明显正相关，不同PDGF含量组MTT比色结果和DNA测定结果的相关系数r值分别为0.97 7 8和0.993 5，提示外源PDGF能明显促进PASMC增殖，并呈很好的量效关系。Suramin具有 明显抑制PDGF促细胞增殖的作用。
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2.3 各种ECCM对PASMC增殖的影响
MTT比色和DNA测定结果显示，HE组与NE组、HE+Suramin组等各组之间差异均呈极显 著性，说明HECCM中含有一种内源性因子，且其促PASMC的增殖作用可被Suramin所抑制，参 照外源性PDGF促PASMC增殖实验的结果，推测这种促PASMC增殖的内源性因子是PDGF。NE组与 NE+Suramin组之间的差异没有显著性，说明这种内源性的PDGF是在低氧条件刺激下由EC合 成分泌的。
3 讨论
近年来，肺血管结构改建在PHT发生中的作用受到重视，有学者认为PHT不是功能性疾病，而 主要是一种器质性疾病。低氧引起PHT时，肺动脉壁内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的 增殖、分化及细胞外基质形成增多是肺血管器质性病变的原因和血管结构重组的基础。故低 氧条件下PAEC与PASMC相互作用的研究成为热点。1989年Madtes等推断PDGF参与了PHT的形成 过程[4]；Joseph等亦报道慢性低氧可以刺激EC产生PDGF[5]。故本文在充 分证明外源性PDGF对PASMC具有量效关系的促增殖作用，以及Suramin可完全抑制其作用的基 础上研究了HECCM中PDGF的促PASMC增殖作用。实验结果表明HECCM的促PASMC增殖效应同样可 被Suramin显著抑制(P<0.01)，提示低氧可刺激PAEC合成和分泌PDGF，后者是HECCM 促PASMC增殖的一个重要因子。PDGF促细胞增殖的作用是通过其与PASMC膜上的PDGF受体特异 性结合，引起受体自身磷酸化和细胞内相关蛋白磷酸化等多级信号传导步骤，诱导细胞DNA 合成和有丝分裂应答而实现的[6]。至于Suramin抑制PDGF作用的机理，可能是由于 Suramin能高亲和结合PDGF而阻止其与受体结合，对已与PDGF受体结合的PDGF，Suramin亦可 将其从PDGF受体上解离下来[7]。故根据目前资料Suramin对PDGF促细胞增殖的抑制 作用仅在细胞膜受体，对于胞内的信号传导途径有无影响尚待研究阐明。至于HE+Suramin 组与NE组相比差异有显著性，说明当HECCM中PDGF的促PASMC增殖效应被Suramin抑制后，尚 有其它生物活性因子引起的细胞增殖效应。推测至少尚有多胺的参与。这部分内容将在另篇 论文中报道[8]。
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国家自然科学基金资助项目(No. 39270295)
廖国宁，男，1962年生，博士研究生
参考文献
1，肖芳，车东媛，张婉蓉. 缺氧内皮细胞条件培养基对肺动脉平滑肌细胞生长的 影响. 中华病理学杂志，1993，22(3)：166
2，Kouembanas S，Hannon R L. Oxygen tension regulates the expression of the platelet-derived growth factor-B chain gene in human endothelial cells. J Clin Invest，1990，86：670
3，Paul E，Daniel F，Bowen P. Cultured endothelial cells produce a plat elet-derived growth factor-like protein. Proc Natl Acad Sci USA，1983，80：191 9
, http://www.100md.com
4，Madtes D K. Modulation of local concentrations of platelet-derived growth factor. Am Rev Respir Dis ，1989，140：1118
5，Joseph P M，Thompson B T. Effect of hypoxia on the secretion of plat elet-derived growth factor by bovine pulmonary artery endothelial cell. Am R ev Respir Dis，1990，141：A346
6，Lena W. Platelet-derived growth factor receptor signals. J Biol Che m，1994，269：32023
7，Hhosang M. Suramin binds to platelet-derived growth factor and inhi bits its biological activity. J Cell Biochem，1985，29：265
8，廖国宁，雷景迈，何善述. 多胺在低氧内皮细胞条件培养基促猪肺动脉平滑肌 细胞增殖中的作用. 同济医科大学学报，1998，27(4)：249
(收稿：1998-04-20), 百拇医药