日本血吸虫感染小鼠脾细胞体外IL-2转录水平的实验观察
作者：田小军 薛燕萍 诸欣平 黄敏君
单位：田小军 薛燕萍 黄敏君(北京热带医学研究所)；诸欣平(首都医科大学)
关键词：日本血吸虫；可溶性虫卵抗原；白细胞介素-2；逆转录聚合酶链反应
首都医科大学学报000203 提要： 应用RT-PCR方法对日本血吸虫感染小鼠脾细胞体外在SEA与ConA诱导下产生的IL-2从mRNA转录水平进行研究，以探讨该细胞因子mRNA转录水平的动态变化及其在肉芽肿形成与调节过程中的作用。结果显示，未感染和感染3周小鼠脾细胞均无IL-2表达，感染后第5周的小鼠脾细胞出现IL-2特异性条带，感染后第8周IL-2表达明显增强，感染后第10、12周无论SEA或ConA都不能诱导IL-2 mRNA的转录。表明IL-2表达的动态变化与肉芽肿的形成、发展及调节相平行，提示IL-2可能在肉芽肿形成和调节过程中起重要作用。
, http://www.100md.com
中图分类号： R383.2
Experimental Observation of in Vitro
IL-2 Transcription on the Spleen Cells of
Mice Infected by Schistosoma japonicum
Tian Xiaojun Xue Yanping Huang Minjun
(Beijing Tropical Medicine Research Institute)
Zhu Xinping
(Capital University of Medical Sciences)
, 百拇医药
Abstract: In the present study, IL-2 mRNA levels was observed on the spleen cells of mice infected with Schistosoma japonicum by RT-PCR in order to find out how relevant the dynamics of the gene expression of the cytokines to granulomatous inflammation. It was found that the expression of IL-2 could not be detected in SEA or ConA treated spleen cells from both uninfected and 3 week infected mice. IL-2 mRNA could be found obviously expressed at 5 week infection, significantly increased at 8 week infection, However, neither 10 and 12 infected mice indicating the modulated expression of mRNA of the cytokine. The observation revealed that the dynamic of IL-2 gene expression paralleled to the granuloma formation and modulation in S. japonicum infected BALB/c mice and that IL-2 may play an important role in the modulation of granuloma formation in schistosomiasis japonica.
, 百拇医药
Key words: Schistosoma japonicum; soluble egg antigen; Interleukin-2; RT-PCR
血吸虫病是以虫卵肉芽肿为主要病变的一种免疫性疾病，由虫卵肉芽肿最终导致的肝纤维化严重危害人们的身体健康。近年来，对曼氏血吸虫虫卵肉芽肿的免疫病理研究发现，有多种细胞因子参与了肉芽肿的形成与调节过程。IL-2作为一种重要的细胞因子，在虫卵肉芽肿形成与调节中的作用已受到重视。Boros对曼氏血吸虫的研究结果显示[1]，IL-2的产生出现于感染后4～6周；感染后8周，随着虫卵肉芽肿体积达到峰值，IL-2的水平也最高，推测IL-2可能与曼氏血吸虫虫卵肉芽肿的成熟与维持有关。而有关日本血吸虫在这方面的研究还较少。
1999年5月至11月我们对感染日本血吸虫小鼠不同感染时期的脾细胞在体外经特异性日本血吸虫虫卵抗原(SEA)或有丝分裂原(ConA)刺激产生的IL-2，从mRNA转录水平进行了调查，以进一步探讨IL-2在虫卵肉芽肿形成与调节过程中的可能作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
实验动物为6～8周龄雄性BALB/c小鼠(购自中科院实验动物繁育场)，经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴20条/只(阳性钉螺由浙江省寄生虫病研究所提供)，未感染的同龄小鼠作为正常对照。
小鼠肝病理学检查：取感染后不同时期(3、5、8、10和12周)的小鼠解剖取肝脏，10%甲醛固定，常规石蜡切片，行HE染色。显微镜下测量所有含有单个虫卵且结构清晰的新生成的肉芽肿大小，以每个肉芽肿横径与纵径的均值作为直径，分别计算各感染期肉芽肿的平均直径。同时对每一肉芽肿直径取对数，所得数据应用Newman-Keuls方法进行统计学分析，P<0.05认为有显著性差异。
小鼠脾细胞培养与细胞总RNA提取：未感染的正常小鼠及感染后3、5、8、10和12周的小鼠，每组3～4只，处死后，无菌操作取出脾脏。按常规方法制备单细胞悬液，然后用RPMI 1640培养基将细胞数调整为2×106 mL-1，并分别加入SEA(7 mg/L)5 μL或Con A(5 mg/L)7 μL，置二氧化碳培养箱(37 ℃，5%CO2)培养4 h后，参照文献[2]的异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。用紫外分光光度计测定RNA的产量及纯度，OD 260/280>1.7，OD 260/230>2.0时方可使用。
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逆转录PCR：按逆转录试剂盒(美国Promega公司生产)说明操作。每20 μL反应体系内含4 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL 10×逆转录缓冲液，2 μL 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μL RNA 酶抑制剂，15 U AMV逆转录酶，0.5 μg Oligo(dT)引物，1 μg RNA模板。以上试剂混匀后于42 ℃反应60 min，然后于99 ℃加热5 min灭活生物酶活性，立即置冰浴10 min。
每50 μL反应体系内含10×PCR缓冲液5 μL，25 mmol/L MgCl2 4 μL，10 mmol/L dNTP混合物4 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL(2.5 U)，40 pmol/L引物，逆转录产物1 μL。在基因扩增仪上进行PCR反应，扩增条件为：模板变性94 ℃ 5 min后进入循环，即模板变性94 ℃ 1 min，退火50 ℃ 1 min，引物 延伸72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。
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每批模板均同时进行β-actin mRNA的扩增作为阳性对照。实验中所用引物序列及扩增片段长度参见文献[3，4]。
电泳：将2%琼脂糖内加入溴乙锭至终质量浓度为0.5 mg/L。在电压80 V，电流强度60 mA条件下，在紫外检测仪上观察结果。
2 结果
对日本血吸虫小鼠感染后不同时期由SEA诱导形成的肝脏虫卵肉芽肿体积测量的结果见表1。表1显示，感染后3周未见肉芽肿形成，感染后5周，肉芽肿开始形成，但体积较小。感染后8周，肉芽肿体积明显增大，达到峰值。感染后10周，肉芽肿体积明显减小，表明虫卵肉芽肿炎性反应免疫调节开始于感染后第10周。感染后第12周尽管肉芽肿体积较第10周进一步减小，但与感染后10周并未显示显著性差异(P>0.05)。
表1 感染BALB/c小鼠肝脏肉芽肿测量结果 t(感染)/周
, 百拇医药
测量个数
d(平均)/μm
lg(d/μm)
+
5
33
74.5
6.19±11.5
8
52
247.8
, http://www.100md.com 7.92±32.4*
10
64
171.2
7.39±31.7△
12
57
168.1
7.37±35.2
*与感染后5周比较P<0.05；△与感染后8周比较P<0.05 不同感染时期SEA诱导脾细胞产生IL-2 mRNA转录水平见图1。正常小鼠及感染后3周的小鼠脾细胞经SEA刺激，不产生IL-2的特异性条带，而在这个时期却有β-actin mRNA的表达(图2)。感染后5周，SEA能诱导脾细胞产生IL-2相应的特异扩增条带(扩增片段长度为441 bp)。感染后8周，SEA诱导的IL-2表达明显增强。感染后10周，SEA诱导脾细胞产生的IL-2水平也显著下降，IL-2特异性条带消失。
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图1 正常小鼠及感染后不同时期小鼠脾细
胞经SEA诱导后IL-2扩增产物比较
图2 正常小鼠及感染后不同时期小
鼠脾细胞β-actin扩增产物比较
显示各时期β-actin扩增条带亮度基本相同
ConA在感染不同时期刺激产生的IL-2 mRNA转录水平的升高与降低的趋势与SEA结果一致，在感染后第10周同样未能发现IL-2的表达(图3)。
图3 正常小鼠及感染后不同时期小鼠脾细
, 百拇医药
胞经ConA诱导后IL-2扩增产物比较
3 讨论
本实验对IL-2在日本血吸虫虫卵肉芽肿形成与调节中的作用进行了研究。对感染后不同时期的日本血吸虫小鼠脾细胞体外经ConA与SEA诱导，在不同时期IL-2 mRNA水平的动态研究结果显示，感染后5周出现IL-2的表达，感染后8周IL-2的水平明显升高，感染后10周IL-2显著下降。表明SEA诱导的IL-2 mRNA转录的出现、高峰及下降的动态变化与SEA诱导和虫卵肉芽肿的形成、发展、调节的变化相平行，提示IL-2可能与日本血吸虫虫卵肉芽肿的形成与免疫调节有关。考虑到IL-2具有能诱导成熟T细胞增殖分化并能诱导和促进某些炎性因子(IFN-γ、MAF和CSF等)的产生等生物活性[5，6]，推测IL-2可能直接促进T细胞的增殖和炎性因子的产生，从而促进虫卵肉芽肿的形成。
UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases资助课题
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Boros D L. The role of cytokines in the formation of the schistosome egg granuloma. Immunobiology, 1994,191:441～450
2，Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156～159
3，Montgomery R A. Analysis of cytokine gene expression during fetal thymic ontogeny using the polymerase chain reaction. J Immunol, 1991,147:554～560
, 百拇医药
4，Gorczynski R M. Altered patterns of migration of cytokine-producing T lymphocytes in skin-grafted naive or immune mice following in vivo administration of anti-VCAM-1 or ICAM-1. Immunology, 1996,87:573～580
5，Von Beohmer M A. Absence of growth by most recepter-expressing fetal thymocytes in the presence of interleukin-2. Nature, 1985,314:539～540
6，Kelso A. Secretion of interleukin 2, macrophage-activating factor, interferon, and colony-stimulating factor by alloreactive T lymphocyte clones. J Immunol, 1984,132:2924～2931
收稿日期：1999-12-29, http://www.100md.com
单位：田小军 薛燕萍 黄敏君(北京热带医学研究所)；诸欣平(首都医科大学)
关键词：日本血吸虫；可溶性虫卵抗原；白细胞介素-2；逆转录聚合酶链反应
首都医科大学学报000203 提要： 应用RT-PCR方法对日本血吸虫感染小鼠脾细胞体外在SEA与ConA诱导下产生的IL-2从mRNA转录水平进行研究，以探讨该细胞因子mRNA转录水平的动态变化及其在肉芽肿形成与调节过程中的作用。结果显示，未感染和感染3周小鼠脾细胞均无IL-2表达，感染后第5周的小鼠脾细胞出现IL-2特异性条带，感染后第8周IL-2表达明显增强，感染后第10、12周无论SEA或ConA都不能诱导IL-2 mRNA的转录。表明IL-2表达的动态变化与肉芽肿的形成、发展及调节相平行，提示IL-2可能在肉芽肿形成和调节过程中起重要作用。
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中图分类号： R383.2
Experimental Observation of in Vitro
IL-2 Transcription on the Spleen Cells of
Mice Infected by Schistosoma japonicum
Tian Xiaojun Xue Yanping Huang Minjun
(Beijing Tropical Medicine Research Institute)
Zhu Xinping
(Capital University of Medical Sciences)
, 百拇医药
Abstract: In the present study, IL-2 mRNA levels was observed on the spleen cells of mice infected with Schistosoma japonicum by RT-PCR in order to find out how relevant the dynamics of the gene expression of the cytokines to granulomatous inflammation. It was found that the expression of IL-2 could not be detected in SEA or ConA treated spleen cells from both uninfected and 3 week infected mice. IL-2 mRNA could be found obviously expressed at 5 week infection, significantly increased at 8 week infection, However, neither 10 and 12 infected mice indicating the modulated expression of mRNA of the cytokine. The observation revealed that the dynamic of IL-2 gene expression paralleled to the granuloma formation and modulation in S. japonicum infected BALB/c mice and that IL-2 may play an important role in the modulation of granuloma formation in schistosomiasis japonica.
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Key words: Schistosoma japonicum; soluble egg antigen; Interleukin-2; RT-PCR
血吸虫病是以虫卵肉芽肿为主要病变的一种免疫性疾病，由虫卵肉芽肿最终导致的肝纤维化严重危害人们的身体健康。近年来，对曼氏血吸虫虫卵肉芽肿的免疫病理研究发现，有多种细胞因子参与了肉芽肿的形成与调节过程。IL-2作为一种重要的细胞因子，在虫卵肉芽肿形成与调节中的作用已受到重视。Boros对曼氏血吸虫的研究结果显示[1]，IL-2的产生出现于感染后4～6周；感染后8周，随着虫卵肉芽肿体积达到峰值，IL-2的水平也最高，推测IL-2可能与曼氏血吸虫虫卵肉芽肿的成熟与维持有关。而有关日本血吸虫在这方面的研究还较少。
1999年5月至11月我们对感染日本血吸虫小鼠不同感染时期的脾细胞在体外经特异性日本血吸虫虫卵抗原(SEA)或有丝分裂原(ConA)刺激产生的IL-2，从mRNA转录水平进行了调查，以进一步探讨IL-2在虫卵肉芽肿形成与调节过程中的可能作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
实验动物为6～8周龄雄性BALB/c小鼠(购自中科院实验动物繁育场)，经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴20条/只(阳性钉螺由浙江省寄生虫病研究所提供)，未感染的同龄小鼠作为正常对照。
小鼠肝病理学检查：取感染后不同时期(3、5、8、10和12周)的小鼠解剖取肝脏，10%甲醛固定，常规石蜡切片，行HE染色。显微镜下测量所有含有单个虫卵且结构清晰的新生成的肉芽肿大小，以每个肉芽肿横径与纵径的均值作为直径，分别计算各感染期肉芽肿的平均直径。同时对每一肉芽肿直径取对数，所得数据应用Newman-Keuls方法进行统计学分析，P<0.05认为有显著性差异。
小鼠脾细胞培养与细胞总RNA提取：未感染的正常小鼠及感染后3、5、8、10和12周的小鼠，每组3～4只，处死后，无菌操作取出脾脏。按常规方法制备单细胞悬液，然后用RPMI 1640培养基将细胞数调整为2×106 mL-1，并分别加入SEA(7 mg/L)5 μL或Con A(5 mg/L)7 μL，置二氧化碳培养箱(37 ℃，5%CO2)培养4 h后，参照文献[2]的异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。用紫外分光光度计测定RNA的产量及纯度，OD 260/280>1.7，OD 260/230>2.0时方可使用。
, http://www.100md.com
逆转录PCR：按逆转录试剂盒(美国Promega公司生产)说明操作。每20 μL反应体系内含4 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL 10×逆转录缓冲液，2 μL 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μL RNA 酶抑制剂，15 U AMV逆转录酶，0.5 μg Oligo(dT)引物，1 μg RNA模板。以上试剂混匀后于42 ℃反应60 min，然后于99 ℃加热5 min灭活生物酶活性，立即置冰浴10 min。
每50 μL反应体系内含10×PCR缓冲液5 μL，25 mmol/L MgCl2 4 μL，10 mmol/L dNTP混合物4 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL(2.5 U)，40 pmol/L引物，逆转录产物1 μL。在基因扩增仪上进行PCR反应，扩增条件为：模板变性94 ℃ 5 min后进入循环，即模板变性94 ℃ 1 min，退火50 ℃ 1 min，引物 延伸72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。
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每批模板均同时进行β-actin mRNA的扩增作为阳性对照。实验中所用引物序列及扩增片段长度参见文献[3，4]。
电泳：将2%琼脂糖内加入溴乙锭至终质量浓度为0.5 mg/L。在电压80 V，电流强度60 mA条件下，在紫外检测仪上观察结果。
2 结果
对日本血吸虫小鼠感染后不同时期由SEA诱导形成的肝脏虫卵肉芽肿体积测量的结果见表1。表1显示，感染后3周未见肉芽肿形成，感染后5周，肉芽肿开始形成，但体积较小。感染后8周，肉芽肿体积明显增大，达到峰值。感染后10周，肉芽肿体积明显减小，表明虫卵肉芽肿炎性反应免疫调节开始于感染后第10周。感染后第12周尽管肉芽肿体积较第10周进一步减小，但与感染后10周并未显示显著性差异(P>0.05)。
表1 感染BALB/c小鼠肝脏肉芽肿测量结果 t(感染)/周
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测量个数
d(平均)/μm
lg(d/μm)
+5
33
74.5
6.19±11.5
8
52
247.8
, http://www.100md.com 7.92±32.4*
10
64
171.2
7.39±31.7△
12
57
168.1
7.37±35.2
*与感染后5周比较P<0.05；△与感染后8周比较P<0.05 不同感染时期SEA诱导脾细胞产生IL-2 mRNA转录水平见图1。正常小鼠及感染后3周的小鼠脾细胞经SEA刺激，不产生IL-2的特异性条带，而在这个时期却有β-actin mRNA的表达(图2)。感染后5周，SEA能诱导脾细胞产生IL-2相应的特异扩增条带(扩增片段长度为441 bp)。感染后8周，SEA诱导的IL-2表达明显增强。感染后10周，SEA诱导脾细胞产生的IL-2水平也显著下降，IL-2特异性条带消失。
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图1 正常小鼠及感染后不同时期小鼠脾细
胞经SEA诱导后IL-2扩增产物比较
图2 正常小鼠及感染后不同时期小
鼠脾细胞β-actin扩增产物比较
显示各时期β-actin扩增条带亮度基本相同
ConA在感染不同时期刺激产生的IL-2 mRNA转录水平的升高与降低的趋势与SEA结果一致，在感染后第10周同样未能发现IL-2的表达(图3)。
图3 正常小鼠及感染后不同时期小鼠脾细
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胞经ConA诱导后IL-2扩增产物比较
3 讨论
本实验对IL-2在日本血吸虫虫卵肉芽肿形成与调节中的作用进行了研究。对感染后不同时期的日本血吸虫小鼠脾细胞体外经ConA与SEA诱导，在不同时期IL-2 mRNA水平的动态研究结果显示，感染后5周出现IL-2的表达，感染后8周IL-2的水平明显升高，感染后10周IL-2显著下降。表明SEA诱导的IL-2 mRNA转录的出现、高峰及下降的动态变化与SEA诱导和虫卵肉芽肿的形成、发展、调节的变化相平行，提示IL-2可能与日本血吸虫虫卵肉芽肿的形成与免疫调节有关。考虑到IL-2具有能诱导成熟T细胞增殖分化并能诱导和促进某些炎性因子(IFN-γ、MAF和CSF等)的产生等生物活性[5，6]，推测IL-2可能直接促进T细胞的增殖和炎性因子的产生，从而促进虫卵肉芽肿的形成。
UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases资助课题
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参 考 文 献
1，Boros D L. The role of cytokines in the formation of the schistosome egg granuloma. Immunobiology, 1994,191:441～450
2，Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156～159
3，Montgomery R A. Analysis of cytokine gene expression during fetal thymic ontogeny using the polymerase chain reaction. J Immunol, 1991,147:554～560
, 百拇医药
4，Gorczynski R M. Altered patterns of migration of cytokine-producing T lymphocytes in skin-grafted naive or immune mice following in vivo administration of anti-VCAM-1 or ICAM-1. Immunology, 1996,87:573～580
5，Von Beohmer M A. Absence of growth by most recepter-expressing fetal thymocytes in the presence of interleukin-2. Nature, 1985,314:539～540
6，Kelso A. Secretion of interleukin 2, macrophage-activating factor, interferon, and colony-stimulating factor by alloreactive T lymphocyte clones. J Immunol, 1984,132:2924～2931
收稿日期：1999-12-29, http://www.100md.com