以紫菜为原料制备高纯度二十碳五烯酸乙酯的有效方法
作者：周仲飞 严杏珍 张家玉 朱兰 张乐乐 卢振海
单位：周仲飞 严杏珍 张家玉 朱兰 张乐乐 卢振海(上海医药工业研究院中药研究室，上海 200040)
关键词：紫菜Porphyra yezoensis，二十碳五烯酸乙酯，反相硅胶层析
中国海洋药物000210 摘要 本文报道了以紫菜为原料大量制备90%的二十碳五烯酸乙酯，应用了尿素包合法及反相硅胶层析法并报道了二十碳五烯酸乙酯的IR，CIMS，1HNMR及13CNMR的波谱。
AN EFFECTIVE PROCESS FOR ISOLATION OF EICOSAPENTAENOIC ACID ETHYL ESTER IN QUANTITY FROM PORPHYRA YEZOENSIS
, 百拇医药
Zhou Zhongfei,Yan Xingzhen, Zhang Jiayu,et al.
(Depatrtment of Chinese traditional pharmaceutical Shanghai Institute of Pharmceutical Industry 200040)
ABSTRACT Prepertion of an 90% eicosapentaenoic acid ethyl ester (EPA-E)from Porphyra yezoensis is described.The urea inclusion compound method and column chromatography on reversed phased silical gel was used and IR,CIMS,1HNMR,13CNMR specture of EPA-E are reported.
, 百拇医药
KEY WORDS Porphyra yezoensis,EPA-E;Reversed phased silical gel
条斑紫菜Porphyra yezoensis含有蛋白质、酶、多肽、氨基酸、核酸、糖类、纤维类、脂肪(脂质成分中有亚麻酸、次亚麻酸、二十碳五烯酸)、β-胡萝卜素、甾醇类、VB1、VB2、VB5、VB6、VB12、VE、VD、VK、VC、叶绿素、类叶绿素、无机元素有K、Na、Mg、Cu、Pb、Zn、Cd、Cr、Ni、Fe、Mn[1～6]。
二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid简称EPA)近来研究报道具有降血脂，抗血栓和抗动脉粥样硬化等作用[7]，并对动物肿瘤有抑制作用[8]，临床上，日本已把二十碳五烯酸乙酯简称EPA-E制成药物用于治疗闭塞性动脉硬化症[9]。关于提取EPA的原料，很多文献报道是以海洋鱼油为原料，由于海洋渔业资源日益紧张，各国学者都在探索从海藻，微生物转基因工程[10]及酶转化[11]等方面，寻找获得EPA，关于获得高纯度EPA-E的方法，文献报道有减压分馏和分子蒸馏法[12]，硝酸银硅胶柱层析法[13]，超临界流二氧化碳液体萃取法[14]，碘内酯化法[15]等方法，在上述中有的存在昂贵的设备投资费用，有的由于高温处理容易使高度不饱和脂肪酸分解，有的提取规模扩大受到限制等问题[14]。本文报道以条斑紫菜为原料，采用尿素包合法结合反相硅胶层析法能大量获得纯度为90%以上的二十碳五烯酸乙酯。
, 百拇医药
1 材料
1.1 原料的采集
原料为条斑紫菜Porphyra yezoensis (Ueda)采自江苏省通南市。春季采集，品种由上海水产大学养殖系马家海教授鉴定。
1.2 试剂
1.2.1 95%乙醇，无水乙醇(AR)，氢氧化钾(CP)，盐酸(CP)，稀盐酸(取23.4ml HCl用水稀释至100ml即得)，汽油(无毒)，硫酸(AR)，氮气(普氮)。
1.2.2 EPA-E(E=乙基)对照品(纯度为99.79%)，上海医药工业研究院中药研究室制备。
1.2.3 反相硅胶RP-18(40μm)美国产品。
1.2.4 设备仪器
, 百拇医药
1.2.4.1 索氏提取器
1.2.4.2 旋转蒸发器
1.2.4.3 1H核磁共振仪，型号GEMINT-300，溶剂CDCl3,内标TMS
1.2.4.4 13C核磁共振仪，型号6M-400,溶剂CDCl3,内标TMS
1.2.4.5 质谱，型号DB5 CI源，反应气体为甲烷
1.2.4.6 红外光谱仪，型号P-E683
1.2.4.7 气相色谱仪，型号日本岛津GC-9A,C-R3A数据处理机，1M×3mm玻璃柱，火焰离子化检测器(用内标法测定含量)[16]。
, http://www.100md.com
2 实验方法
2.1 油脂提取 把1000g干紫菜粗粉(含水分5.82%)装于尼龙袋，索氏提取器中并在提取器上口倒入混合溶剂(汽油：乙醇=2:1)，然后把索氏提取器置于80℃的恒温水浴锅中进行回流提取直至色淡为止，过滤提取液，滤液经旋转蒸发器减压浓缩即得油脂。
2.2 皂化 将所得油指置入烧瓶中加入1NKOH/乙醇液(配置方法为1NKOH：乙醇1:5)，置于水浴锅中80℃恒温，搅拌回流2h，瓶中通氮气。反应结束后把皂化液冷却至室温，倒入分液漏斗中，加入汽油后振摇，静置分层，弃去汽油层，反复萃取3次(除去不皂化物)，即得皂化液。
2.3 脂肪酸提取 把皂化液用稀盐酸调节PH1～2静置后倒入分液漏斗中再加汽油萃取，反复萃取1次合并萃取的汽油，在40℃的恒温水浴锅中旋转蒸发减压浓缩，回收汽油后即得脂肪酸。
2.4 脂肪酸乙酯化 将所得脂肪酸用无水乙醇溶解，加1.5%(V/V)硫酸乙醇液，在80℃的恒温水浴锅回流2h，反应瓶中通氮气酯化，反应完全后冷却至室温，用汽油萃取3次，合并萃取液，于40℃的恒温减压浓缩，然后加少量活性炭于浓缩液中脱色即得EPA-E粗品。
, 百拇医药
2.5 EPA-E粗品的精制
2.5.1 形成尿素复合物 在EPA-E粗品中加入尿素(其加入量比例为EPA-粗品(g)：尿素量(g)=1:3)，接着加甲醇溶解尿素后再加入少量汽油，反应瓶中通氮气并置于60℃恒温回流2h。反应结束后，冷却至室温并把反应瓶置于0℃ 18h，然后过滤除去析出的尿素包合复合物，滤液于旋转蒸发器减压浓缩除去甲醇和汽油即得尿素包合后纯化的EPA-E。
2.5.2 反相硅胶柱层析纯化 将上述经尿素包合纯化的EPA-E浓缩液加少量反相硅胶拌和后干燥，放入装有反相硅胶柱的上端(反相硅胶装量(g)：样品量(g)=1:2)，用混合洗脱液(水：甲醇：丙酮=15：60：25)进行洗脱，硅胶薄层层析检查洗脱液(展开剂为正己烷：乙醚：甲酸=16：4：0.4)从出现EPA-E斑点显色为止，合并洗脱液减压浓缩即得微黄色的EPA-E(油状物，含量为90%以上)
3 结果
, 百拇医药
3.1 1000g紫菜投料，用本方法提取EPA-E(连续3次)在提取各步其得量，收率，含量的稳定性，结果见表1～3，从表中实验数据表明本方法制备EPA-E在得量，收率及含量基本是稳定的。
表1 EPA-E粗品得量，收率，含量 编号
投料量(g)
得量(g)
收率‰
含量%
B1
B2
B3
1000
, 百拇医药 1000
1000
6.1
6.5
7.2
6.1
6.5
7.2
50.02
48.28
48.96
平均
1000
, http://www.100md.com
6.6
6.4
49.06
表2 尿素包合处理后EPA-E得量，收率，含量 编号
投料量(g)
得量(g)
收率‰
含量%
B1
B2
B3
1000
1000
, http://www.100md.com
1000
3
3.2
3.3
3
3.2
3.3
74.4
80.34
79.67
平均
1000
3.17
, 百拇医药
3.17
78.16
表3 反相硅胶柱层析精制尿素处理的EPA-E得量，收率，含量 编号
投料量(g)
得量(g)
收率‰
含量%
B1
B2
B3
1000
1000
, 百拇医药
1000
1.6
2.1
2.1
1.6
2.1
2.1
90.31
90.43
90.03
平均
1000
1.9
, 百拇医药
1.9
90.25
3.2 本品EPA-E的IR，1HNMR，13CNMR，CIMS波谱
IRυ max cm-1(NaCl) 1735(C=O),1650(C=C).
1HNMR(CDCl3):δ5.37(m,10H,olefinic H),4.10(q,2H,-OCH2),2.85(m,8H,7,10,13,16-CH2),12.29(t,2H,2-CH2),2.10(m,4H,4,19-CH2),1.70(m,2H,3-CH2),1.24(t,3H,-OCH2CH3),0.95
, 百拇医药
(t,3H,20-CH3)该谱中δ1.51峰为溶剂水峰。
13CNMR：δ173.604(C),132.007(CH),128.985(CH),128.747(CH),128.527(CH),128.211(2CH),128.071(2CH),127.838(CH),126.937(CH),60.235(-OCH2),33.733(CH2),26.569(CH2)，25.621(2CH2),24.814(CH2),20.567(CH2),14.267(2CH3)。
CIMS m/z 330.13Z(M+),331.20(M+1)。
此外，本品与日本EPA-E产品在同样的气相色谱条件下其保留时间tR相同。
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4 讨论
实验数据表明本方法制备EPA-E在得量，收率及含量上基本是稳定的。
4.1 从表1，2实验数据中可看出经尿素包合纯化后EPA-E的得量及收率降低，有待进一步改进尿素包合纯化方法。
4.2 尿素包合法用于EPA纯化已有文献报道，由于尿素包合主要是用尿素包合除去饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸，但不能分离高度不饱和脂肪酸的混合物，故文献报道一般采用二种分离技术相结合进行EPA纯化，如有溶媒法加尿素包合法[17]，高真空蒸馏法加尿素包合法[18]得到高纯度EPA，本文报道了采用尿素包合法加反相硅胶柱层析法得到高纯度EPA，并有利于大量获得高纯度EPA。
4.3 经初步实验证明，在本方法基础上经高效液相色谱分离可得到99%以上含量的EPA-E[19]。
, http://www.100md.com
致谢：本实验的条斑紫菜原料供应得到了上海水产大学养殖系马家海教授的帮助，在此表示感谢!
参考文献
[1]范晓.中国海洋药物，1993，4：32
[2]Ide Teruhiku.Agrie Biol Chem.1987，51(12)：3391
[3]YoKoYama，zeniki，et al.Biosci Biotedchnol biochem. 1994,58(6)：1172
[4]Takaiwa,Fumio,et al.Nucleic Acids Res， 1982,10(19)：6037
[5]TaKaYi，Toru，et al.Nucleic Acids Res，1982,10(19)：6037
, 百拇医药
[6]Ilias AM.et al.Fette,Seifen Anstrichm 1985,87(9)：345
[7]尚雪原.中国海洋药物，1995，4：6
[8]曾晓雄.天然产物研究与开发，1997，9(1)65
[9]袁藤将光り脉管学.1992，32：233
[10]矢泽一良バィォサィェンスとィンダストリ-，1994，52：633
[11]CA.104:205535r
[12]WO 93/09210
[13]Bulletin of the Japanese society of scientific Fisheries，1978，44(8)：927
, 百拇医药
[14]WB Nilsson， J Am Chem Soc，65(1)：109
[15]Stephen W，Wright，J org Chem，1987，52：4399
[16]严杏珍，“气相色谱法测定EPA乙酯”上海医药工业研究院药物分析研究室资料，1998
[17]特开昭60-133094
[18]特开平4-41457
[19]上海医药工业研究院中药研究室资料1998
收稿时间：1999-09-26, 百拇医药
单位：周仲飞 严杏珍 张家玉 朱兰 张乐乐 卢振海(上海医药工业研究院中药研究室，上海 200040)
关键词：紫菜Porphyra yezoensis，二十碳五烯酸乙酯，反相硅胶层析
中国海洋药物000210 摘要 本文报道了以紫菜为原料大量制备90%的二十碳五烯酸乙酯，应用了尿素包合法及反相硅胶层析法并报道了二十碳五烯酸乙酯的IR，CIMS，1HNMR及13CNMR的波谱。
AN EFFECTIVE PROCESS FOR ISOLATION OF EICOSAPENTAENOIC ACID ETHYL ESTER IN QUANTITY FROM PORPHYRA YEZOENSIS
, 百拇医药
Zhou Zhongfei,Yan Xingzhen, Zhang Jiayu,et al.
(Depatrtment of Chinese traditional pharmaceutical Shanghai Institute of Pharmceutical Industry 200040)
ABSTRACT Prepertion of an 90% eicosapentaenoic acid ethyl ester (EPA-E)from Porphyra yezoensis is described.The urea inclusion compound method and column chromatography on reversed phased silical gel was used and IR,CIMS,1HNMR,13CNMR specture of EPA-E are reported.
, 百拇医药
KEY WORDS Porphyra yezoensis,EPA-E;Reversed phased silical gel
条斑紫菜Porphyra yezoensis含有蛋白质、酶、多肽、氨基酸、核酸、糖类、纤维类、脂肪(脂质成分中有亚麻酸、次亚麻酸、二十碳五烯酸)、β-胡萝卜素、甾醇类、VB1、VB2、VB5、VB6、VB12、VE、VD、VK、VC、叶绿素、类叶绿素、无机元素有K、Na、Mg、Cu、Pb、Zn、Cd、Cr、Ni、Fe、Mn[1～6]。
二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid简称EPA)近来研究报道具有降血脂，抗血栓和抗动脉粥样硬化等作用[7]，并对动物肿瘤有抑制作用[8]，临床上，日本已把二十碳五烯酸乙酯简称EPA-E制成药物用于治疗闭塞性动脉硬化症[9]。关于提取EPA的原料，很多文献报道是以海洋鱼油为原料，由于海洋渔业资源日益紧张，各国学者都在探索从海藻，微生物转基因工程[10]及酶转化[11]等方面，寻找获得EPA，关于获得高纯度EPA-E的方法，文献报道有减压分馏和分子蒸馏法[12]，硝酸银硅胶柱层析法[13]，超临界流二氧化碳液体萃取法[14]，碘内酯化法[15]等方法，在上述中有的存在昂贵的设备投资费用，有的由于高温处理容易使高度不饱和脂肪酸分解，有的提取规模扩大受到限制等问题[14]。本文报道以条斑紫菜为原料，采用尿素包合法结合反相硅胶层析法能大量获得纯度为90%以上的二十碳五烯酸乙酯。
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1 材料
1.1 原料的采集
原料为条斑紫菜Porphyra yezoensis (Ueda)采自江苏省通南市。春季采集，品种由上海水产大学养殖系马家海教授鉴定。
1.2 试剂
1.2.1 95%乙醇，无水乙醇(AR)，氢氧化钾(CP)，盐酸(CP)，稀盐酸(取23.4ml HCl用水稀释至100ml即得)，汽油(无毒)，硫酸(AR)，氮气(普氮)。
1.2.2 EPA-E(E=乙基)对照品(纯度为99.79%)，上海医药工业研究院中药研究室制备。
1.2.3 反相硅胶RP-18(40μm)美国产品。
1.2.4 设备仪器
, 百拇医药
1.2.4.1 索氏提取器
1.2.4.2 旋转蒸发器
1.2.4.3 1H核磁共振仪，型号GEMINT-300，溶剂CDCl3,内标TMS
1.2.4.4 13C核磁共振仪，型号6M-400,溶剂CDCl3,内标TMS
1.2.4.5 质谱，型号DB5 CI源，反应气体为甲烷
1.2.4.6 红外光谱仪，型号P-E683
1.2.4.7 气相色谱仪，型号日本岛津GC-9A,C-R3A数据处理机，1M×3mm玻璃柱，火焰离子化检测器(用内标法测定含量)[16]。
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2 实验方法
2.1 油脂提取 把1000g干紫菜粗粉(含水分5.82%)装于尼龙袋，索氏提取器中并在提取器上口倒入混合溶剂(汽油：乙醇=2:1)，然后把索氏提取器置于80℃的恒温水浴锅中进行回流提取直至色淡为止，过滤提取液，滤液经旋转蒸发器减压浓缩即得油脂。
2.2 皂化 将所得油指置入烧瓶中加入1NKOH/乙醇液(配置方法为1NKOH：乙醇1:5)，置于水浴锅中80℃恒温，搅拌回流2h，瓶中通氮气。反应结束后把皂化液冷却至室温，倒入分液漏斗中，加入汽油后振摇，静置分层，弃去汽油层，反复萃取3次(除去不皂化物)，即得皂化液。
2.3 脂肪酸提取 把皂化液用稀盐酸调节PH1～2静置后倒入分液漏斗中再加汽油萃取，反复萃取1次合并萃取的汽油，在40℃的恒温水浴锅中旋转蒸发减压浓缩，回收汽油后即得脂肪酸。
2.4 脂肪酸乙酯化 将所得脂肪酸用无水乙醇溶解，加1.5%(V/V)硫酸乙醇液，在80℃的恒温水浴锅回流2h，反应瓶中通氮气酯化，反应完全后冷却至室温，用汽油萃取3次，合并萃取液，于40℃的恒温减压浓缩，然后加少量活性炭于浓缩液中脱色即得EPA-E粗品。
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2.5 EPA-E粗品的精制
2.5.1 形成尿素复合物 在EPA-E粗品中加入尿素(其加入量比例为EPA-粗品(g)：尿素量(g)=1:3)，接着加甲醇溶解尿素后再加入少量汽油，反应瓶中通氮气并置于60℃恒温回流2h。反应结束后，冷却至室温并把反应瓶置于0℃ 18h，然后过滤除去析出的尿素包合复合物，滤液于旋转蒸发器减压浓缩除去甲醇和汽油即得尿素包合后纯化的EPA-E。
2.5.2 反相硅胶柱层析纯化 将上述经尿素包合纯化的EPA-E浓缩液加少量反相硅胶拌和后干燥，放入装有反相硅胶柱的上端(反相硅胶装量(g)：样品量(g)=1:2)，用混合洗脱液(水：甲醇：丙酮=15：60：25)进行洗脱，硅胶薄层层析检查洗脱液(展开剂为正己烷：乙醚：甲酸=16：4：0.4)从出现EPA-E斑点显色为止，合并洗脱液减压浓缩即得微黄色的EPA-E(油状物，含量为90%以上)
3 结果
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3.1 1000g紫菜投料，用本方法提取EPA-E(连续3次)在提取各步其得量，收率，含量的稳定性，结果见表1～3，从表中实验数据表明本方法制备EPA-E在得量，收率及含量基本是稳定的。
表1 EPA-E粗品得量，收率，含量 编号
投料量(g)
得量(g)
收率‰
含量%
B1
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B3
1000
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6.1
6.5
7.2
6.1
6.5
7.2
50.02
48.28
48.96
平均
1000
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6.6
6.4
49.06
表2 尿素包合处理后EPA-E得量，收率，含量 编号
投料量(g)
得量(g)
收率‰
含量%
B1
B2
B3
1000
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1000
3
3.2
3.3
3
3.2
3.3
74.4
80.34
79.67
平均
1000
3.17
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3.17
78.16
表3 反相硅胶柱层析精制尿素处理的EPA-E得量，收率，含量 编号
投料量(g)
得量(g)
收率‰
含量%
B1
B2
B3
1000
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2.1
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1.6
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90.43
90.03
平均
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1.9
90.25
3.2 本品EPA-E的IR，1HNMR，13CNMR，CIMS波谱
IRυ max cm-1(NaCl) 1735(C=O),1650(C=C).
1HNMR(CDCl3):δ5.37(m,10H,olefinic H),4.10(q,2H,-OCH2),2.85(m,8H,7,10,13,16-CH2),12.29(t,2H,2-CH2),2.10(m,4H,4,19-CH2),1.70(m,2H,3-CH2),1.24(t,3H,-OCH2CH3),0.95
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(t,3H,20-CH3)该谱中δ1.51峰为溶剂水峰。
13CNMR：δ173.604(C),132.007(CH),128.985(CH),128.747(CH),128.527(CH),128.211(2CH),128.071(2CH),127.838(CH),126.937(CH),60.235(-OCH2),33.733(CH2),26.569(CH2)，25.621(2CH2),24.814(CH2),20.567(CH2),14.267(2CH3)。
CIMS m/z 330.13Z(M+),331.20(M+1)。
此外，本品与日本EPA-E产品在同样的气相色谱条件下其保留时间tR相同。
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4 讨论
实验数据表明本方法制备EPA-E在得量，收率及含量上基本是稳定的。
4.1 从表1，2实验数据中可看出经尿素包合纯化后EPA-E的得量及收率降低，有待进一步改进尿素包合纯化方法。
4.2 尿素包合法用于EPA纯化已有文献报道，由于尿素包合主要是用尿素包合除去饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸，但不能分离高度不饱和脂肪酸的混合物，故文献报道一般采用二种分离技术相结合进行EPA纯化，如有溶媒法加尿素包合法[17]，高真空蒸馏法加尿素包合法[18]得到高纯度EPA，本文报道了采用尿素包合法加反相硅胶柱层析法得到高纯度EPA，并有利于大量获得高纯度EPA。
4.3 经初步实验证明，在本方法基础上经高效液相色谱分离可得到99%以上含量的EPA-E[19]。
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致谢：本实验的条斑紫菜原料供应得到了上海水产大学养殖系马家海教授的帮助，在此表示感谢!
参考文献
[1]范晓.中国海洋药物，1993，4：32
[2]Ide Teruhiku.Agrie Biol Chem.1987，51(12)：3391
[3]YoKoYama，zeniki，et al.Biosci Biotedchnol biochem. 1994,58(6)：1172
[4]Takaiwa,Fumio,et al.Nucleic Acids Res， 1982,10(19)：6037
[5]TaKaYi，Toru，et al.Nucleic Acids Res，1982,10(19)：6037
, 百拇医药
[6]Ilias AM.et al.Fette,Seifen Anstrichm 1985,87(9)：345
[7]尚雪原.中国海洋药物，1995，4：6
[8]曾晓雄.天然产物研究与开发，1997，9(1)65
[9]袁藤将光り脉管学.1992，32：233
[10]矢泽一良バィォサィェンスとィンダストリ-，1994，52：633
[11]CA.104:205535r
[12]WO 93/09210
[13]Bulletin of the Japanese society of scientific Fisheries，1978，44(8)：927
, 百拇医药
[14]WB Nilsson， J Am Chem Soc，65(1)：109
[15]Stephen W，Wright，J org Chem，1987，52：4399
[16]严杏珍，“气相色谱法测定EPA乙酯”上海医药工业研究院药物分析研究室资料，1998
[17]特开昭60-133094
[18]特开平4-41457
[19]上海医药工业研究院中药研究室资料1998
收稿时间：1999-09-26, 百拇医药