点种法同种异体兔软骨移植修复关节软骨缺损的研究
作者：陈义泉 雍宜民 胡怀建 沈惠良
单位：陈义泉(深圳龙岗布吉人民医院)；雍宜民 胡怀建 沈惠良(首都医科大学宣武医院骨科)
关键词：点种法移植术；同种异体软骨；关节软骨缺损；修复；软骨下骨钻孔术
首都医科大学学报000215 提要： 将30只新西兰纯种兔共60个膝关节随机分为3组：软骨块点种法移植组、软骨细胞点种法移植组和对照组。分别于术后2、4、12、24周取标本行大体、光镜、电镜的组织学动态观察，并同时对修复组织进行组织学和组织化学质量评估，观察点种法软骨移植术修复透明软骨的效果。结果显示：2种点种法移植组均能获得透明软骨修复，而对照组缺损区仅为纤维组织填充，并且点种法移植组兔各期平均组织学和组织化学得分均高于对照组(P<0.01)。提示：点种法软骨移植能获得透明软骨修复，尤其适用于大面积软骨缺损。
中图分类号： R687.3+4
, http://www.100md.com
Study on Point Implantation with
Allograft Rabbit Cartilage for
Repairing Articular Cartilage Defects
Yong Yimin Hu Huaijian Shen Huiliang
(Department of Orthopaedics, Xuanwu Hospital,Affiliated of Capital University of Medical Sciences)
Cheng Yiquan
(Shenzhen Longgang Buji People′s Hospital)
, 百拇医药
Abstract: A novel method of cartilage transplantation, point implantation, have been developed for repairing articular cartilage defects. 30 New Zealand rabbits were divided into three groups randomly: In group Ⅰ, the new born allograft cartilage masses were transplanted into the holes in the defect which was made previously. In group Ⅱ, The cultured new born allograft chondrocytes were transplanted like group Ⅰ, and then the holes were covered by collagen gel. In group Ⅲ, The holes in the defect were left empty. Healing of the defects was assessed by gross examination、 light microscopy、 histological-histochemical scoring and electron microscopy at 2、4、12 and 24 weeks. Twenty-four weeks after the transplantation, the defects were filled with hyaline cartilage, while the defects without transplantation healed with fiber tissue and fibrocartilage. The histologic quality scores of the repair tissue were significantly better in all knees in which defects were treated with point implantation compared to knees in which defects were treated with drilling only. Point Implantation can obtain satisfactory hyaline cartilage repair when used in some large area defects.
, 百拇医药
Key words: point implantation; allograft cartilage; articular cartilage defects; repair; subchondral drilling
关节软骨因其修复力有限，目前临床上还没有满意的修复关节软骨缺损的方法。为此我们于1997年10月至1998年5月设计出一种新型软骨移植方法：点种法，包括软骨下骨钻孔术和软骨移植术。
1 材料和方法
实验动物与分组：健康新西兰纯种成熟兔30只共60个膝关节(北京市药检所提供)，分成3组：软骨块点种法移植组(21只)；软骨细胞点种法移植组(21只)；单纯钻孔对照组(18只)。另外10只新西兰新生兔(出生1～3 d)作为关节软骨供体。
新生同种异体软骨细胞的分离与培养：在无菌条件下取出10只新生兔的关节软骨，修剪成1 mm3块大小。一部分放置PBS液中待用，另一部分依次用0.25%胰蛋白酶消化30 min和0.1% Ⅱ型胶原酶消化120 min。将制得的软骨细胞悬液取样计数，按1×106 mL-1接种到培养瓶中，再依次加入10%胎牛血清(FCS)和IMDM培养基，混匀后置入37 ℃，5% CO2培养箱内培养2周。
, 百拇医药
移植方法：30只实验兔用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)行静脉麻醉后，无菌操作下行膝内侧切口，逐层切开达关节腔，将髌骨导向外侧脱位，显露股骨髁关节面，于髌骨沟处，用利刀片作6 mm×4 mm大小的全层关节软骨缺损，肉眼见缺损处无软骨组织残余后，以自制的6孔模具为标准，用手摇钻打孔，每孔直径1 mm，深度约7 mm，达松质骨。软骨块点种移植组兔于各孔中分别植入已准备好的1 mm3大小的新生同种异体兔软骨块，见固定牢固便可。软骨细胞点种移植组兔分别于各孔中注入经过培养2周后的新生同种异体兔软骨细胞悬液(约1×107 mL-1)，注射完后，于缺损内平抹一层胶原凝胶(0.3%胶原0.001 mol/L乙酸溶液)，以防止植入的细胞丢失。对照组兔钻孔后，不作处理。完毕，复回髌骨，逐层关闭伤口，下肢不固定，笼中自由喂养。
组织学观察与评估：分别于术后2、4、12、24周处死动物，取出标本，对修复组织进行大体观察后，立即将标本浸入10%甲醛中固定，然后将标本浸入0.3 mol/L EDTA中脱钙3周，再用石蜡包埋标本，沿矢状面垂直于缺损区内的孔进行切片，作常规HE染色和甲苯胺蓝染色以观察软骨基质分泌情况。2个移植组兔各送1份标本行透射电镜观察。
, http://www.100md.com
对修复组织的组织学和组织化学的质量评分，采用Pineda等描述的标准[1]，包括6项内容：细胞形态(1～5分)、基质染色(1～4分)、表面光滑度(1～4分)、与邻近软骨对合情况(1～3分)、有无退变发生(1～2分)、潮标是否形成(1～2分)，共6～20分。评分后数据作方差分析，P<0.05为有显著性意义。
2 结果
大体观察：软骨块点种法移植组移植后2周见缺损内各孔植入的新生同种异体软骨块已存活，4周时植入的软骨块增大，呈蘑菇状，12周已完全融合为一整体，表面渐趋光滑，24周时修复组织已完全填充缺损区，与周围软骨界线已分辨不清，色泽、质地均和正常软骨一致。软骨细胞点种法移植组移植2～4周时，见缺损区内一些散在的白色点状修复组织及少量残留的胶原凝胶，12周白色修复组织逐渐扩大，并出现孔与孔间的融合，至24周，修复组织才融为一体，但与周围软骨分界仍依稀可辨。对照组兔2周时见缺损区内仅有一薄层的粉红色肉芽组织填充，4～12周时肉芽组织逐渐转为灰白色的纤维组织，直至24周修复组织仍为纤维组织，表面低于周围软骨且不规则，质地柔软，压之有明显的凹陷感。
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光镜观察：软骨块点种移植组兔4周时修复组织已呈透明软骨样特点，细胞数明显增多，基质染色深于正常软骨组织，12周时，细胞逐渐分层排列，基底层有血管长入，形成软骨下骨，潮标已开始形成，24周的修复组织已完全呈透明软骨特点。软骨细胞点种移植组兔术后2～4周时，仅见一些散在的软骨细胞，很少成簇出现，基质染色较淡，直到12周修复组织内细胞数才明显增加，并聚集成簇，24周时修复组织显示有透明软骨的特点，基质染色显示与正常软骨接近。对照组兔术后2周见孔内有呈楔形的肉芽样结构，4～12周时修复组织主要为纤维组织，内含丰富的纤维和少量的细胞，24周时发现有4例为纤维组织修复，基质染色为阴性，仅有1例获得纤维软骨修复。
标本切片的组织学和组织化学评分结果见表1。表1结果表明，移植组各期得分均明显优于对照组(P<0.01)，软骨块移植组各期得分均高于软骨细胞移植组，但2组间无显著性差异(P>0.05)。
表1 关节软骨的组织学和组织化学评分 组别
, 百拇医药
2周
4周
12周
24周
n
±s
n±s
n±s
n±s
, http://www.100md.com
软骨块移植组
6
7.80±0.84**
5
14.20±1.30**
5
17.40±0.55**
5
18.00±1.23**
软骨细胞移植组
6
, http://www.100md.com
7.40±0.55**
5
12.40±1.34**
5
16.40±1.57**
5
16.80±2.17**
对照组
4
6.20±0.45
6
, 百拇医药 9.40±1.14
4
12.60±1.14
4
12.00±1.87
与对照组比较**P<0.01
电镜观察：移植组24周兔各送去1份标本行透射电镜观察。电镜下可见大量的正常软骨细胞，主要表现为：细胞周围存在着1圈电子密度较低的周晕或“疆界质”，是软骨基质的1个特殊区带，主要是由纤细的微丝和淡染的蛋白质组成[2]。细胞膜完整，呈微绒毛状，胞质内可见丰富的粗面内质网、Golgi体、线粒体以及少量的糖原和脂滴。
3 讨论
, 百拇医药 软骨下骨钻孔修复关节软骨缺损，修复组织的细胞来源为骨髓腔内的间充质细胞，它具有向软骨细胞分化的可能，但对修复组织的性质却众说不一[3，4]。本研究中，24周对照组兔中有4例为纤维组织修复，1例为纤维软骨修复，与文献报道相符[4]。可见，软骨下骨钻孔修复关节软骨缺损时，修复组织多为纤维组织，在结构、成分及功能上均与正常软骨相差甚远，无法达到真正意义上的修复。
以前的实验已证实，新生同种异体兔软骨具有细胞多、分裂能力强、合成及分泌基质能力旺盛及更低的免疫原性等特点。但在实验中还存在2个主要问题：①移植时的固定问题，②大面积缺损时很难找到同样大小的移植源。为此本实验采用新生同种异体软骨行点种法移植到大面积缺损区内的各孔中，利用新生兔软骨自身分裂增生能力强的特点，向四周进行扩张、融合，最后达到填充缺损的目的。同时还发现悬浮的软骨细胞在移植到新环境后，有一段适应过程，细胞处于静止状态，然后再接受周围环境传来的信号进行分裂增生。也与Itay应用包埋移植鸡胚软骨细胞的过程不一致[5]。
, 百拇医药
通过本实验证实，点种法软骨移植术修复关节软骨缺损具有以下优点：①通过在缺损区内先钻孔再移植，可以有效地固定被移植的软骨块和软骨细胞；②应用小块软骨或软骨细胞修复大面积软骨缺损，能减少移植源匮乏的问题；③操作简单而又实用，并可在关节镜下进行；④为修复组织提供了真正的软骨细胞来源，效果明显优于单纯软骨下骨钻孔术；⑤尤其适用于临床上一些大面积缺损的患者。
参 考 文 献
1，Pineda S, Pollack A, Stevenson S, et al. A semequantitative scale for histologic grading of articular cartiliage repair. Acta Anat, 1992,143:335～340
2，毕五蝉,王亦璁.膝关节载荷传导紊乱所致关节软骨退变.中华骨科杂志,1991,11(4):303～305
, http://www.100md.com
3，葛志强,冯传汉,吕厚山,等.骨膜移植和钻孔术修复关节软骨缺损的实验比较.中华骨科杂志,1995,15(7):454～457
4，Mitchell N, Shepard N. The resurfacing of adult rabbit articular cartilage by multiple perforations through the subchondral bone. J Bone Joint Surg, 1976,58A:230～233
5，Itay S, Abramovici A, Nevo Z. Use of cultured embryonal chick epiphyseal chondrocytes as grafts for defects in chick articular cartilage. Clin Orthop, 1987,220:284～303
收稿日期：1999-04-07, 百拇医药
单位：陈义泉(深圳龙岗布吉人民医院)；雍宜民 胡怀建 沈惠良(首都医科大学宣武医院骨科)
关键词：点种法移植术；同种异体软骨；关节软骨缺损；修复；软骨下骨钻孔术
首都医科大学学报000215 提要： 将30只新西兰纯种兔共60个膝关节随机分为3组：软骨块点种法移植组、软骨细胞点种法移植组和对照组。分别于术后2、4、12、24周取标本行大体、光镜、电镜的组织学动态观察，并同时对修复组织进行组织学和组织化学质量评估，观察点种法软骨移植术修复透明软骨的效果。结果显示：2种点种法移植组均能获得透明软骨修复，而对照组缺损区仅为纤维组织填充，并且点种法移植组兔各期平均组织学和组织化学得分均高于对照组(P<0.01)。提示：点种法软骨移植能获得透明软骨修复，尤其适用于大面积软骨缺损。
中图分类号： R687.3+4
, http://www.100md.com
Study on Point Implantation with
Allograft Rabbit Cartilage for
Repairing Articular Cartilage Defects
Yong Yimin Hu Huaijian Shen Huiliang
(Department of Orthopaedics, Xuanwu Hospital,Affiliated of Capital University of Medical Sciences)
Cheng Yiquan
(Shenzhen Longgang Buji People′s Hospital)
, 百拇医药
Abstract: A novel method of cartilage transplantation, point implantation, have been developed for repairing articular cartilage defects. 30 New Zealand rabbits were divided into three groups randomly: In group Ⅰ, the new born allograft cartilage masses were transplanted into the holes in the defect which was made previously. In group Ⅱ, The cultured new born allograft chondrocytes were transplanted like group Ⅰ, and then the holes were covered by collagen gel. In group Ⅲ, The holes in the defect were left empty. Healing of the defects was assessed by gross examination、 light microscopy、 histological-histochemical scoring and electron microscopy at 2、4、12 and 24 weeks. Twenty-four weeks after the transplantation, the defects were filled with hyaline cartilage, while the defects without transplantation healed with fiber tissue and fibrocartilage. The histologic quality scores of the repair tissue were significantly better in all knees in which defects were treated with point implantation compared to knees in which defects were treated with drilling only. Point Implantation can obtain satisfactory hyaline cartilage repair when used in some large area defects.
, 百拇医药
Key words: point implantation; allograft cartilage; articular cartilage defects; repair; subchondral drilling
关节软骨因其修复力有限，目前临床上还没有满意的修复关节软骨缺损的方法。为此我们于1997年10月至1998年5月设计出一种新型软骨移植方法：点种法，包括软骨下骨钻孔术和软骨移植术。
1 材料和方法
实验动物与分组：健康新西兰纯种成熟兔30只共60个膝关节(北京市药检所提供)，分成3组：软骨块点种法移植组(21只)；软骨细胞点种法移植组(21只)；单纯钻孔对照组(18只)。另外10只新西兰新生兔(出生1～3 d)作为关节软骨供体。
新生同种异体软骨细胞的分离与培养：在无菌条件下取出10只新生兔的关节软骨，修剪成1 mm3块大小。一部分放置PBS液中待用，另一部分依次用0.25%胰蛋白酶消化30 min和0.1% Ⅱ型胶原酶消化120 min。将制得的软骨细胞悬液取样计数，按1×106 mL-1接种到培养瓶中，再依次加入10%胎牛血清(FCS)和IMDM培养基，混匀后置入37 ℃，5% CO2培养箱内培养2周。
, 百拇医药
移植方法：30只实验兔用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)行静脉麻醉后，无菌操作下行膝内侧切口，逐层切开达关节腔，将髌骨导向外侧脱位，显露股骨髁关节面，于髌骨沟处，用利刀片作6 mm×4 mm大小的全层关节软骨缺损，肉眼见缺损处无软骨组织残余后，以自制的6孔模具为标准，用手摇钻打孔，每孔直径1 mm，深度约7 mm，达松质骨。软骨块点种移植组兔于各孔中分别植入已准备好的1 mm3大小的新生同种异体兔软骨块，见固定牢固便可。软骨细胞点种移植组兔分别于各孔中注入经过培养2周后的新生同种异体兔软骨细胞悬液(约1×107 mL-1)，注射完后，于缺损内平抹一层胶原凝胶(0.3%胶原0.001 mol/L乙酸溶液)，以防止植入的细胞丢失。对照组兔钻孔后，不作处理。完毕，复回髌骨，逐层关闭伤口，下肢不固定，笼中自由喂养。
组织学观察与评估：分别于术后2、4、12、24周处死动物，取出标本，对修复组织进行大体观察后，立即将标本浸入10%甲醛中固定，然后将标本浸入0.3 mol/L EDTA中脱钙3周，再用石蜡包埋标本，沿矢状面垂直于缺损区内的孔进行切片，作常规HE染色和甲苯胺蓝染色以观察软骨基质分泌情况。2个移植组兔各送1份标本行透射电镜观察。
, http://www.100md.com
对修复组织的组织学和组织化学的质量评分，采用Pineda等描述的标准[1]，包括6项内容：细胞形态(1～5分)、基质染色(1～4分)、表面光滑度(1～4分)、与邻近软骨对合情况(1～3分)、有无退变发生(1～2分)、潮标是否形成(1～2分)，共6～20分。评分后数据作方差分析，P<0.05为有显著性意义。
2 结果
大体观察：软骨块点种法移植组移植后2周见缺损内各孔植入的新生同种异体软骨块已存活，4周时植入的软骨块增大，呈蘑菇状，12周已完全融合为一整体，表面渐趋光滑，24周时修复组织已完全填充缺损区，与周围软骨界线已分辨不清，色泽、质地均和正常软骨一致。软骨细胞点种法移植组移植2～4周时，见缺损区内一些散在的白色点状修复组织及少量残留的胶原凝胶，12周白色修复组织逐渐扩大，并出现孔与孔间的融合，至24周，修复组织才融为一体，但与周围软骨分界仍依稀可辨。对照组兔2周时见缺损区内仅有一薄层的粉红色肉芽组织填充，4～12周时肉芽组织逐渐转为灰白色的纤维组织，直至24周修复组织仍为纤维组织，表面低于周围软骨且不规则，质地柔软，压之有明显的凹陷感。
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光镜观察：软骨块点种移植组兔4周时修复组织已呈透明软骨样特点，细胞数明显增多，基质染色深于正常软骨组织，12周时，细胞逐渐分层排列，基底层有血管长入，形成软骨下骨，潮标已开始形成，24周的修复组织已完全呈透明软骨特点。软骨细胞点种移植组兔术后2～4周时，仅见一些散在的软骨细胞，很少成簇出现，基质染色较淡，直到12周修复组织内细胞数才明显增加，并聚集成簇，24周时修复组织显示有透明软骨的特点，基质染色显示与正常软骨接近。对照组兔术后2周见孔内有呈楔形的肉芽样结构，4～12周时修复组织主要为纤维组织，内含丰富的纤维和少量的细胞，24周时发现有4例为纤维组织修复，基质染色为阴性，仅有1例获得纤维软骨修复。
标本切片的组织学和组织化学评分结果见表1。表1结果表明，移植组各期得分均明显优于对照组(P<0.01)，软骨块移植组各期得分均高于软骨细胞移植组，但2组间无显著性差异(P>0.05)。
表1 关节软骨的组织学和组织化学评分 组别
, 百拇医药
2周
4周
12周
24周
n
±sn
±sn
±sn
±s, http://www.100md.com
软骨块移植组
6
7.80±0.84**
5
14.20±1.30**
5
17.40±0.55**
5
18.00±1.23**
软骨细胞移植组
6
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7.40±0.55**
5
12.40±1.34**
5
16.40±1.57**
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16.80±2.17**
对照组
4
6.20±0.45
6
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4
12.60±1.14
4
12.00±1.87
与对照组比较**P<0.01
电镜观察：移植组24周兔各送去1份标本行透射电镜观察。电镜下可见大量的正常软骨细胞，主要表现为：细胞周围存在着1圈电子密度较低的周晕或“疆界质”，是软骨基质的1个特殊区带，主要是由纤细的微丝和淡染的蛋白质组成[2]。细胞膜完整，呈微绒毛状，胞质内可见丰富的粗面内质网、Golgi体、线粒体以及少量的糖原和脂滴。
3 讨论
, 百拇医药 软骨下骨钻孔修复关节软骨缺损，修复组织的细胞来源为骨髓腔内的间充质细胞，它具有向软骨细胞分化的可能，但对修复组织的性质却众说不一[3，4]。本研究中，24周对照组兔中有4例为纤维组织修复，1例为纤维软骨修复，与文献报道相符[4]。可见，软骨下骨钻孔修复关节软骨缺损时，修复组织多为纤维组织，在结构、成分及功能上均与正常软骨相差甚远，无法达到真正意义上的修复。
以前的实验已证实，新生同种异体兔软骨具有细胞多、分裂能力强、合成及分泌基质能力旺盛及更低的免疫原性等特点。但在实验中还存在2个主要问题：①移植时的固定问题，②大面积缺损时很难找到同样大小的移植源。为此本实验采用新生同种异体软骨行点种法移植到大面积缺损区内的各孔中，利用新生兔软骨自身分裂增生能力强的特点，向四周进行扩张、融合，最后达到填充缺损的目的。同时还发现悬浮的软骨细胞在移植到新环境后，有一段适应过程，细胞处于静止状态，然后再接受周围环境传来的信号进行分裂增生。也与Itay应用包埋移植鸡胚软骨细胞的过程不一致[5]。
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通过本实验证实，点种法软骨移植术修复关节软骨缺损具有以下优点：①通过在缺损区内先钻孔再移植，可以有效地固定被移植的软骨块和软骨细胞；②应用小块软骨或软骨细胞修复大面积软骨缺损，能减少移植源匮乏的问题；③操作简单而又实用，并可在关节镜下进行；④为修复组织提供了真正的软骨细胞来源，效果明显优于单纯软骨下骨钻孔术；⑤尤其适用于临床上一些大面积缺损的患者。
参 考 文 献
1，Pineda S, Pollack A, Stevenson S, et al. A semequantitative scale for histologic grading of articular cartiliage repair. Acta Anat, 1992,143:335～340
2，毕五蝉,王亦璁.膝关节载荷传导紊乱所致关节软骨退变.中华骨科杂志,1991,11(4):303～305
, http://www.100md.com
3，葛志强,冯传汉,吕厚山,等.骨膜移植和钻孔术修复关节软骨缺损的实验比较.中华骨科杂志,1995,15(7):454～457
4，Mitchell N, Shepard N. The resurfacing of adult rabbit articular cartilage by multiple perforations through the subchondral bone. J Bone Joint Surg, 1976,58A:230～233
5，Itay S, Abramovici A, Nevo Z. Use of cultured embryonal chick epiphyseal chondrocytes as grafts for defects in chick articular cartilage. Clin Orthop, 1987,220:284～303
收稿日期：1999-04-07, 百拇医药