免疫-PCR实验技术条件的探讨
作者：黄松 牛春 姜洪杰
单位：(首都医科大学寄生虫学教研室)
关键词：
首都医科大学学报000225 ELISA是免疫学检测经典实验技术，多年来已广泛用于检测各种疾病，其检测抗原/抗体的灵敏度可达pg级。但对于早期、轻症患者及产生抗体滴度较低的疾病，其检测阳性率仍不能令人满意。1992年Sano等创立了免疫-PCR方法[1]，此方法将ELISA反应的灵敏度至少提高了103倍，可检测到0.5 fg的小鼠ApoE抗原。然而我们在应用中发现，由于免疫-PCR反应需在0.5 mL小离心管中进行，而离心管的包被效果远逊于ELISA反应板(酶标板)，制约了免疫-PCR灵敏度优势的发挥。为克服这一难题，我们分别观察了硅化、紫外线照射、戊二醛浸泡以及增大抗原质量浓度4种处理方法对包被效果的影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
硅化和未硅化处理的0.5 mL聚乙烯塑料离心管均由经科生物工程公司提供。
紫外线照射采用上海顾村电光仪器厂生产的UV-1型三用紫外分析仪，波长3 560 nm，离心管开口向上垂直放置于距光源15 cm处，分别照射0、0.5、1、2、3、4、6 h，按蒋成淦方法包被[2]、进行ELISA反应。
采用1%戊二醛浸泡，50 μL/管，分别浸泡0、0.5、1、2、3、4、6 h，弃液，PBS洗3次，同上包被、进行ELISA反应。包被用小鼠IgG由邦定生物工程公司提供，批号9804，包被质量浓度分别为1和10 mg/L。
包被效果用ELISA反应的吸光度值(OD值)表示，每种处理方法测5管，每管重复测3次，取吸光度平均值。
, 百拇医药
统计分析采用SPSS软件，数据处理采用t检验及单因素方差分析。
2 结果
硅化、紫外线照射、戊二醛浸泡对低抗原质量浓度(1 mg/L)包被效果影响见表1，对高抗原质量浓度(10 mg/L)包被效果影响见表2。不同包被质量浓度时，高抗原质量浓度包被效果明显优于低抗原质量浓度(P<0.01)，但OD值的增加与包被质量浓度的提高不成正比。紫外线照射0.5 h后高抗原质量浓度包被硅化管OD值优于未照射硅化管(P<0.05) ，紫外线照射2 h后低抗原质量浓度包被未硅化管OD值也优于未照射的未硅化管(P<0.05)。戊二醛浸泡0.5～6 h后，不论高抗原质量浓度包被或低抗原质量浓度包被，OD值均明显低于未浸泡组(P<0.05)。紫外线照射0.5、1、6 h或戊二醛浸泡1、4 h再用10 mg/L抗原包被组及戊二醛浸泡3 h再用1 mg/L 抗原包被组，硅化管效果优于未硅化管(P<0.01)；而紫外线照射6 h或戊二醛浸泡1、2 h后用1 mg/L包被组及戊二醛浸泡0.5 h后用10 mg/L包被组，硅化管效果低于未硅化管(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 不同作用条件对低抗原质量浓度(1 mg/L)包被效果(OD值)的影响 条件
t(照射)/h
0
0.5
1
2
3
4
6
硅化管
0.913±0.114
0.838±0.085
, 百拇医药
0.859±0.070
0.969±0.234
0.879±0.045
0.932±0.109
0.884±0.149
未硅化管
0.863±0.078
0.814±0.072
0.905±0.109
1.009±0.158
0.832±0.060
, 百拇医药
0.938±0.072
0.956±0.099
条件
t(浸泡)/h
0
0.5
1
2
3
4
6
硅化管
0.913±0.114
, 百拇医药
0.407±0.114
0.276±0.045
0.280±0.080
0.291±0.077
0.502±0.182
0.325±0.021
未硅化管
0.863±0.078
0.358±0.062
0.333±0.046
0.485±0.094
, 百拇医药
0.222±0.057
0.437±0.110
0.397±0.096
表2 不同作用条件对高抗原质量浓度(10 mg/L)包被效果(OD值)的影响 条件
t(照射)/h
0
0.5
1
2
3
4
6
, 百拇医药
硅化管
2.264±0.152
2.478±0.092
2.308±0.163
2.296±0.159
2.388±0.123
2.258±0.190
2.355±0.144
未硅化管
2.364±0.056
2.133±0.075
, 百拇医药 2.199±0.148
2.365±0.334
2.345±0.152
2.235±0.313
2.196±0.093
条件
t(浸泡)/h
0
0.5
1
2
3
4
, http://www.100md.com
6
硅化管
2.264±0.152
0.551±0.113
0.964±0.108
0.742±0.506
0.535±0.157
0.508±0.083
0.457±0.174
未硅化管
2.364±0.056
0.744±0.095
, 百拇医药
0.455±0.183
0.539±0.287
0.598±0.115
0.387±0.081
0.463±0.136
3 讨论
抗原包被是影响免疫-PCR反应效果的关键步骤，带负电荷的抗原分子一般通过非特异性吸附力与固相载体结合[2]。一般认为紫外线照射和戊二醛浸泡可使载体表面带正电荷，因而使吸附力增强[3]。硅化反应在经典PCR实验中常用于稳定容器表面，减少管壁对试剂的沾染，可能因此使抗原对载体的吸附力减弱，降低包被效果。实验表明，在未经紫外线照射、戊二醛浸泡处理前，硅化与否对包被效果影响不明显(P>0.05)。紫外线照射一段时间后，配合一定抗原质量浓度的包被，确可使包被效果增强。而1%戊二醛浸泡却使硅化、未硅化管的包被效果均降低；抗原质量浓度提高10倍还不能消除这种不利影响，而且包被效果的降低与戊二醛作用时间并不成线性关系，可能戊二醛化学性质活泼，与固相载体表面的作用受多种因素影响所致。综合各项实验结果，紫外线照射未硅化管2 h应是在节省抗原的前提下简便经济的提高包被效果的好方法。
, 百拇医药
值得注意的是，在处理方法和处理时间相同的前提下，增加抗原包被浓度10倍，并不能使包被效果成比例的提高。说明用增大抗原量的方法来改善包被效果是事倍功半，在抗原来源稀缺或制备不易时更不可取。
本实验观察的紫外线照射方法，既适用于离心管，也可用于ELISA反应板，因此不失为一条简便、快速提高ELISA反应效率的途径。同时也为优化免疫-PCR反应条件，使该技术更快应用于流行区检测提供了实验依据。
北京市自然科学基金资助项目
参 考 文 献
1，Sano T, Smith C L, Cantor C R. Immuno-PCR very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Sciences, 1992,258:120～125
2，蒋成淦.酶免疫测定法.北京:人民卫生出版社,1984.75～85,133～135
3，徐肇华.戊二醛前处理的聚苯乙烯塑料小孔在二点一步酶免疫法中的应用.上海医学检验杂志,1989,2:104～106
收稿日期：2000-03-15, 百拇医药
单位：(首都医科大学寄生虫学教研室)
关键词：
首都医科大学学报000225 ELISA是免疫学检测经典实验技术，多年来已广泛用于检测各种疾病，其检测抗原/抗体的灵敏度可达pg级。但对于早期、轻症患者及产生抗体滴度较低的疾病，其检测阳性率仍不能令人满意。1992年Sano等创立了免疫-PCR方法[1]，此方法将ELISA反应的灵敏度至少提高了103倍，可检测到0.5 fg的小鼠ApoE抗原。然而我们在应用中发现，由于免疫-PCR反应需在0.5 mL小离心管中进行，而离心管的包被效果远逊于ELISA反应板(酶标板)，制约了免疫-PCR灵敏度优势的发挥。为克服这一难题，我们分别观察了硅化、紫外线照射、戊二醛浸泡以及增大抗原质量浓度4种处理方法对包被效果的影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
硅化和未硅化处理的0.5 mL聚乙烯塑料离心管均由经科生物工程公司提供。
紫外线照射采用上海顾村电光仪器厂生产的UV-1型三用紫外分析仪，波长3 560 nm，离心管开口向上垂直放置于距光源15 cm处，分别照射0、0.5、1、2、3、4、6 h，按蒋成淦方法包被[2]、进行ELISA反应。
采用1%戊二醛浸泡，50 μL/管，分别浸泡0、0.5、1、2、3、4、6 h，弃液，PBS洗3次，同上包被、进行ELISA反应。包被用小鼠IgG由邦定生物工程公司提供，批号9804，包被质量浓度分别为1和10 mg/L。
包被效果用ELISA反应的吸光度值(OD值)表示，每种处理方法测5管，每管重复测3次，取吸光度平均值。
, 百拇医药
统计分析采用SPSS软件，数据处理采用t检验及单因素方差分析。
2 结果
硅化、紫外线照射、戊二醛浸泡对低抗原质量浓度(1 mg/L)包被效果影响见表1，对高抗原质量浓度(10 mg/L)包被效果影响见表2。不同包被质量浓度时，高抗原质量浓度包被效果明显优于低抗原质量浓度(P<0.01)，但OD值的增加与包被质量浓度的提高不成正比。紫外线照射0.5 h后高抗原质量浓度包被硅化管OD值优于未照射硅化管(P<0.05) ，紫外线照射2 h后低抗原质量浓度包被未硅化管OD值也优于未照射的未硅化管(P<0.05)。戊二醛浸泡0.5～6 h后，不论高抗原质量浓度包被或低抗原质量浓度包被，OD值均明显低于未浸泡组(P<0.05)。紫外线照射0.5、1、6 h或戊二醛浸泡1、4 h再用10 mg/L抗原包被组及戊二醛浸泡3 h再用1 mg/L 抗原包被组，硅化管效果优于未硅化管(P<0.01)；而紫外线照射6 h或戊二醛浸泡1、2 h后用1 mg/L包被组及戊二醛浸泡0.5 h后用10 mg/L包被组，硅化管效果低于未硅化管(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 不同作用条件对低抗原质量浓度(1 mg/L)包被效果(OD值)的影响 条件
t(照射)/h
0
0.5
1
2
3
4
6
硅化管
0.913±0.114
0.838±0.085
, 百拇医药
0.859±0.070
0.969±0.234
0.879±0.045
0.932±0.109
0.884±0.149
未硅化管
0.863±0.078
0.814±0.072
0.905±0.109
1.009±0.158
0.832±0.060
, 百拇医药
0.938±0.072
0.956±0.099
条件
t(浸泡)/h
0
0.5
1
2
3
4
6
硅化管
0.913±0.114
, 百拇医药
0.407±0.114
0.276±0.045
0.280±0.080
0.291±0.077
0.502±0.182
0.325±0.021
未硅化管
0.863±0.078
0.358±0.062
0.333±0.046
0.485±0.094
, 百拇医药
0.222±0.057
0.437±0.110
0.397±0.096
表2 不同作用条件对高抗原质量浓度(10 mg/L)包被效果(OD值)的影响 条件
t(照射)/h
0
0.5
1
2
3
4
6
, 百拇医药
硅化管
2.264±0.152
2.478±0.092
2.308±0.163
2.296±0.159
2.388±0.123
2.258±0.190
2.355±0.144
未硅化管
2.364±0.056
2.133±0.075
, 百拇医药 2.199±0.148
2.365±0.334
2.345±0.152
2.235±0.313
2.196±0.093
条件
t(浸泡)/h
0
0.5
1
2
3
4
, http://www.100md.com
6
硅化管
2.264±0.152
0.551±0.113
0.964±0.108
0.742±0.506
0.535±0.157
0.508±0.083
0.457±0.174
未硅化管
2.364±0.056
0.744±0.095
, 百拇医药
0.455±0.183
0.539±0.287
0.598±0.115
0.387±0.081
0.463±0.136
3 讨论
抗原包被是影响免疫-PCR反应效果的关键步骤，带负电荷的抗原分子一般通过非特异性吸附力与固相载体结合[2]。一般认为紫外线照射和戊二醛浸泡可使载体表面带正电荷，因而使吸附力增强[3]。硅化反应在经典PCR实验中常用于稳定容器表面，减少管壁对试剂的沾染，可能因此使抗原对载体的吸附力减弱，降低包被效果。实验表明，在未经紫外线照射、戊二醛浸泡处理前，硅化与否对包被效果影响不明显(P>0.05)。紫外线照射一段时间后，配合一定抗原质量浓度的包被，确可使包被效果增强。而1%戊二醛浸泡却使硅化、未硅化管的包被效果均降低；抗原质量浓度提高10倍还不能消除这种不利影响，而且包被效果的降低与戊二醛作用时间并不成线性关系，可能戊二醛化学性质活泼，与固相载体表面的作用受多种因素影响所致。综合各项实验结果，紫外线照射未硅化管2 h应是在节省抗原的前提下简便经济的提高包被效果的好方法。
, 百拇医药
值得注意的是，在处理方法和处理时间相同的前提下，增加抗原包被浓度10倍，并不能使包被效果成比例的提高。说明用增大抗原量的方法来改善包被效果是事倍功半，在抗原来源稀缺或制备不易时更不可取。
本实验观察的紫外线照射方法，既适用于离心管，也可用于ELISA反应板，因此不失为一条简便、快速提高ELISA反应效率的途径。同时也为优化免疫-PCR反应条件，使该技术更快应用于流行区检测提供了实验依据。
北京市自然科学基金资助项目
参 考 文 献
1，Sano T, Smith C L, Cantor C R. Immuno-PCR very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Sciences, 1992,258:120～125
2，蒋成淦.酶免疫测定法.北京:人民卫生出版社,1984.75～85,133～135
3，徐肇华.戊二醛前处理的聚苯乙烯塑料小孔在二点一步酶免疫法中的应用.上海医学检验杂志,1989,2:104～106
收稿日期：2000-03-15, 百拇医药