甘糖酯对脂质过氧化损伤红细胞变形能力和膜收缩蛋白变化的影响
作者：刘成玉 纪新强 段建华 谭润鸾
单位：刘成玉 纪新强 段建华 谭润鸾(青岛大学医学院，青岛 266021)
关键词：甘糖酯，红细胞膜，过氧化脂质类，红细胞变形能力，收缩蛋白类
中国海洋药物000206 摘要 本文采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白介素-1(IL-1)所诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖模型，以MTT法观察了海洋硫酸多糖DPS对VSMC增殖的影响。大鼠血管平滑肌细胞在DPS浓度为0.001μg/ml～100μg/ml的培养液中孵育24h后，分别加入bFGF(50ng/ml)或IL-1(50U/ML)再孵育24h,用MTT法测定海洋硫酸多糖DPS对VSMC增殖的影响。结果表明，DPS在0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml浓度下，对bFGF或IL-1所致的VSMC增殖均有明显的抑制作用(P<0.01)，最佳抑制浓度为1μg/ml，且DPS对VSMC增殖的抑制作用随着bFGF或IL-1浓度的增加而减弱。
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INHIBITORY EFFECTS OF D-POLYMANNURONIC SULFATE ON THE PROLIFERATION OF RAT SMOOTH MUSCLE CELLS
Zhu Haibo，Geng Meiyu，Guan Huashi
(Department of Marine Pharmacology,Marine Drugs and Food Institute,Ocean University of Qingdao,Qingdao,266003)
ABSTRACT The effects of D-polymannuronic sulfate(DPS)on the proliferation of rat vascular smooth muscle cells (VSMC)induced by basic fibroblast growth factor(bFGF)or interleukin-1(IL-1)were studied in this paper.Pretreatment with DPS in concentrations ranging from 0.001 μg/ml up to 100 μg/ml to rat aortic smooth muscle cells incubated at 37℃ for 24 hours,followed by addition of bFGF(50ng/ml)or IL-1(50U/ml)for another 24 hours,respectively.The effects of DPS on the proliferation of VSMC was determined by MTT assays.The results indicated that anti-roliferative effects of DPS were observed at concentrations of 0.01 μg/ml,0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml,with its maximal effect observed at concentration of 1μg/ml.Moreover,the suppressing actions of DPS on the proliferation of VSMC were diminished by increasing the concentrations of bFGF or Il-1,implicating that DPS is capable of producing an inhibitory effect on rat aortic smooth muscle cells proliferation induced by bFGF or IL-1.
, 百拇医药
KEY WORDS D-polymannuronic sulfate，Vascular smooth muscle cells proliferation，BFGF，IL-1
海洋硫酸多糖DPS(D-polymannuronic sulfate,DPS)是一种从褐藻中提取分离并经化学结构修饰后获得的硫酸多糖类化合物，我们已有实验证明可显著降低肾性高血压大鼠的动脉压，其降压机制与DPS促进体内一氧化氮(NO)的合成或释放及降低血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)和内皮素-1(ET-1)的生成有关。然而，DPS的降压作用机制是否与其抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖有关尚不清楚。迄今已证实，肝素等硫酸多糖类物质的降压作用与其促进体内皮细胞NO的增多介导的抑制血管平滑肌细胞增殖和拮抗ET-1作用密切相关。因此推测，DPS对肾性高血压大鼠的降压作用可能与其抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖有关。故本文旨在用bFGF和IL-1所诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖模型，观察DPS对血管平滑肌细胞增殖的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
海洋硫酸多糖DPS由青岛海洋大学海洋药物与食品研究所提供。M199干粉培养基(Medium 199)：美国Hyclone公司产品。新生小牛血清(Fetal calf serum,FCS):美国Whittaker生物公司产品。L-谷氨酰胺购于上海试剂厂。青霉素和硫酸链霉素为哈尔滨药厂。胶原酶Ⅰ型(Collagnase type Ⅰ),胰蛋白酶(Trypsin),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),白介素-1(IL-1)购于美国Sigmawc公司。平滑肌α肌蛋白为美国Costa公司产品。2，5—二甲基—四溴盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)：美国AMRESCO公司生产。其它试剂均为国产分析纯。
1.2 血管平滑肌细胞培养
用胶原酶消化法培养雄性Wistar大鼠(8～10w)胸主动脉平滑肌细胞。(大鼠由青岛市实验动物中心提供，证号980201)。细胞成“峰-谷”交错状生长，用平滑肌α肌蛋白证实为VSMC原代。待细胞铺满瓶底后即用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA以1∶2比例进行传代培养。实验用5～8代细胞。
, 百拇医药
每次实验所用细胞皆以1×104/每孔接种于96孔板内在37℃下含10%小牛血轻M199培养液中孵育。
1.3 用MTT法观察DPS对bFGF或IL-1介导的血管平滑肌细胞增殖的影响
1.3.1 细胞以1×104细胞/孔，接种于96孔板内在37℃下孵育24h。细胞在含有DPS终浓度0.01μg/ml～100μg/ml)培养液中孵育。24h后，除空白对照组细胞，均加入含bFGF 50ng/ml或IL-1 50 U/ml的含或不含DPS的培养液中继续培养24h。DPS抗增殖活性以MTT法评价。细胞生长抑制百分率＝(1-经DPS处理的细胞吸光度/经bFGF或IL-1处理的细胞吸光度)
1.3.2 向含有DPS(1μg/ml)的培养液中孵育的细胞加入含有不同浓度的bFGF(30，50，70，90 ng/ml)或IL-1(30，50，70，100 U/ml)后再孵育24h，DPS抗增殖活性用MTT法测定同上。
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1.4 统计学处理
本实验中所有数据均采用
±s表示，组间分析采用t检验。
2 结果
2.1 DPS对bFGF或 IL-1所致血管平滑肌细胞增殖的影响
为测定DPS抗VSMC增殖作用，细胞在于DPS已定的浓度下孵育24h后，加入50ng/ml bFGF或50 U/ml IL-1。与正常对照组相比，加入bFGF(50ng/ml)或IL-1(50 U/ml)的两组，VSMC吸光度分别增加了32%和30%，VSMC分别在含有DPS浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml的培养液中孵育24h后，其生长明显受到抑制(P<0.01)，其最佳抑制浓度为1μg/ml。而DPS在0.01μg/ml和 100μg/ml浓度下则未观察到其对VSMC增殖有抑制作用(见图1和图2)。
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Fig 1. Effects of DPS on basic fibroblast growth factor (bFGF)-induced proliferation of VSMC.
Fig 2.Effects of DPS on Interleukin-1(IL-1)-induced proliferation of VSMC.
2.2 DPS对不同浓度的bFGF或IL-1所致大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响
DPS在终浓度为1μg/m下对VSMC的抑制作用随bFGF或IL-1的浓度增加而减弱。DPS 1μg/ml对b FGF在30，50，70ng/ml或IL-1在30，50，70U/ml的浓度下所致的VSMC增殖有明显抑制作用，但DPS对b FGF在90ng/ml或IL-1 90U/ml浓度下所致VSMC的增殖则未见抑制作用(见表1和表2)。
, 百拇医药
Tab 1 Effects of DPS on the proliferation of VSMC
induced by bFGF at different concentrations Group
Absorbance(MTT:570～630nm)
bFGF concentration(ng/ml)
30
50
70
90
control
DPS
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0.430±0.009
0.544±0.022
0.463±0.024**
0.572±0.012
0.530±0.014**
0.676±0.017
0.650±0.013*
0.767±0.032
0.745±0.016
n＝5，±s，*P<0.05，**P<0.01 vs FGF-treated groupTab 2 Effects of DPS on the proliferation of VSMC
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induced by IL-1 at different concentrations Group
Absorbance(MTT:570～630nm)
Il-1 concentration(ng/ml)
30
50
70
90
control
DPS
0.419±0.011
0.586±0.009
, 百拇医药
0.455±0.014**
0.554±0.019
0.482±0.009**
0.608±0.019
0.552±0.012*
0.689±0.018
0.659±0.019
n＝5，±s，*P<0.05，**P<0.01 vs IL-1-treated group。
, 百拇医药
3 讨论
本文探讨了DPS对由bFGF or IL-1所致VSMC增殖的抑制作用。血管平滑肌细胞(VSMC)在体内通常处于静止状态。然而在病理状态下，如高血压病或动脉粥样硬化，促使增殖的VSMC成为血管壁的主要成份。大量研究表明，在体内VSMC增殖的调控与正负调控因子之间存在着精细平衡密切相关。在众多促生长因子中，bFGF已成为当前研究的热点。许多研究证实，bFGF在体内、体外实验中均能刺激VSMC增殖，且该作用可被bFGF的抗体拮抗。我们在实验中发现，DPS对bFGF所致的VSMC增殖有较好的抑制作用，推测可能与DPS拮抗bFGF促增殖作用有关。并且DPS对bFGF促VSMC增值的抑制作用随着bFGF浓度的增加而减弱。Lindner等报道，肝素抑制VSMC增殖作用与其阻止bFGF与VSMC细胞表面上的位点结合有关[5]。但DPS与肝素是否存在相似的作用机制,还有待于进一步研究。目前认为IL-1促VSMC增殖的机制是通过刺激VSMC释放内源性血小板衍生生长因子(PDGF)及单核细胞衍生的生长因子，增加VSMC释放bFGF和/或增强细胞表面bFGF受体的表达来完成的，与其直接作用无关。但DPS的具体作用环节是通过直接拮抗IL-1的促增殖作用，还是抑制由IL-1激活内源性促生长因子释放目前尚不清楚。
, 百拇医药
本文首次发现DPS抑制VSMC增殖作用，此亦可能是DPS降压作用机制。
参考文献
[1]Mandal ak,Lyden TW,Saklayen MG.Heparin lowers blood pressure:bological and clinical perspectives.Kidney Int,1995，47:1017
[2]Castellot JJ,Wright TC,Karnovsky MJ.Regulation of vascular smooth muscle cell growth by heparin and heparan sulfates.Semin Thromb Hemost,1987，13:489
[3]Campbell J H,Campbell G R.Culture techniques and their applications to studies of vascular smooth muscle.Clinical Science,1993，85:501
, 百拇医药
[4]Rosenberg R D.Vascular smooth muscle cell proliferation:basic investigations and new therapeutic approaches.Thromb Haemostasis,1993，70:10
vascular injury is inhibited by antibody against basic fibroblast growth factor.Proc Natl Acad Sci U S A,1991，88：3739
[7]Lindner V,Olson NE,Clowes AW,Reidy MA.Inhibition of smooth muscle cell proliferation in injured rat arteries :interaction of heparin with basic fibroblast growth factor.J Clin Invest,1992，90：2044
[8]Wang GS.Progress on studies on effects of interleukin on arterial smooth muscle cells.J Foreign Medicine:Cardiovascular Disease.1997,24(5):6
收稿时间：2000-03-24, http://www.100md.com
单位：刘成玉 纪新强 段建华 谭润鸾(青岛大学医学院，青岛 266021)
关键词：甘糖酯，红细胞膜，过氧化脂质类，红细胞变形能力，收缩蛋白类
中国海洋药物000206 摘要 本文采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白介素-1(IL-1)所诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖模型，以MTT法观察了海洋硫酸多糖DPS对VSMC增殖的影响。大鼠血管平滑肌细胞在DPS浓度为0.001μg/ml～100μg/ml的培养液中孵育24h后，分别加入bFGF(50ng/ml)或IL-1(50U/ML)再孵育24h,用MTT法测定海洋硫酸多糖DPS对VSMC增殖的影响。结果表明，DPS在0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml浓度下，对bFGF或IL-1所致的VSMC增殖均有明显的抑制作用(P<0.01)，最佳抑制浓度为1μg/ml，且DPS对VSMC增殖的抑制作用随着bFGF或IL-1浓度的增加而减弱。
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INHIBITORY EFFECTS OF D-POLYMANNURONIC SULFATE ON THE PROLIFERATION OF RAT SMOOTH MUSCLE CELLS
Zhu Haibo，Geng Meiyu，Guan Huashi
(Department of Marine Pharmacology,Marine Drugs and Food Institute,Ocean University of Qingdao,Qingdao,266003)
ABSTRACT The effects of D-polymannuronic sulfate(DPS)on the proliferation of rat vascular smooth muscle cells (VSMC)induced by basic fibroblast growth factor(bFGF)or interleukin-1(IL-1)were studied in this paper.Pretreatment with DPS in concentrations ranging from 0.001 μg/ml up to 100 μg/ml to rat aortic smooth muscle cells incubated at 37℃ for 24 hours,followed by addition of bFGF(50ng/ml)or IL-1(50U/ml)for another 24 hours,respectively.The effects of DPS on the proliferation of VSMC was determined by MTT assays.The results indicated that anti-roliferative effects of DPS were observed at concentrations of 0.01 μg/ml,0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml,with its maximal effect observed at concentration of 1μg/ml.Moreover,the suppressing actions of DPS on the proliferation of VSMC were diminished by increasing the concentrations of bFGF or Il-1,implicating that DPS is capable of producing an inhibitory effect on rat aortic smooth muscle cells proliferation induced by bFGF or IL-1.
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KEY WORDS D-polymannuronic sulfate，Vascular smooth muscle cells proliferation，BFGF，IL-1
海洋硫酸多糖DPS(D-polymannuronic sulfate,DPS)是一种从褐藻中提取分离并经化学结构修饰后获得的硫酸多糖类化合物，我们已有实验证明可显著降低肾性高血压大鼠的动脉压，其降压机制与DPS促进体内一氧化氮(NO)的合成或释放及降低血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)和内皮素-1(ET-1)的生成有关。然而，DPS的降压作用机制是否与其抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖有关尚不清楚。迄今已证实，肝素等硫酸多糖类物质的降压作用与其促进体内皮细胞NO的增多介导的抑制血管平滑肌细胞增殖和拮抗ET-1作用密切相关。因此推测，DPS对肾性高血压大鼠的降压作用可能与其抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖有关。故本文旨在用bFGF和IL-1所诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖模型，观察DPS对血管平滑肌细胞增殖的影响。
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1 材料与方法
1.1 药品与试剂
海洋硫酸多糖DPS由青岛海洋大学海洋药物与食品研究所提供。M199干粉培养基(Medium 199)：美国Hyclone公司产品。新生小牛血清(Fetal calf serum,FCS):美国Whittaker生物公司产品。L-谷氨酰胺购于上海试剂厂。青霉素和硫酸链霉素为哈尔滨药厂。胶原酶Ⅰ型(Collagnase type Ⅰ),胰蛋白酶(Trypsin),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),白介素-1(IL-1)购于美国Sigmawc公司。平滑肌α肌蛋白为美国Costa公司产品。2，5—二甲基—四溴盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)：美国AMRESCO公司生产。其它试剂均为国产分析纯。
1.2 血管平滑肌细胞培养
用胶原酶消化法培养雄性Wistar大鼠(8～10w)胸主动脉平滑肌细胞。(大鼠由青岛市实验动物中心提供，证号980201)。细胞成“峰-谷”交错状生长，用平滑肌α肌蛋白证实为VSMC原代。待细胞铺满瓶底后即用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA以1∶2比例进行传代培养。实验用5～8代细胞。
, 百拇医药
每次实验所用细胞皆以1×104/每孔接种于96孔板内在37℃下含10%小牛血轻M199培养液中孵育。
1.3 用MTT法观察DPS对bFGF或IL-1介导的血管平滑肌细胞增殖的影响
1.3.1 细胞以1×104细胞/孔，接种于96孔板内在37℃下孵育24h。细胞在含有DPS终浓度0.01μg/ml～100μg/ml)培养液中孵育。24h后，除空白对照组细胞，均加入含bFGF 50ng/ml或IL-1 50 U/ml的含或不含DPS的培养液中继续培养24h。DPS抗增殖活性以MTT法评价。细胞生长抑制百分率＝(1-经DPS处理的细胞吸光度/经bFGF或IL-1处理的细胞吸光度)
1.3.2 向含有DPS(1μg/ml)的培养液中孵育的细胞加入含有不同浓度的bFGF(30，50，70，90 ng/ml)或IL-1(30，50，70，100 U/ml)后再孵育24h，DPS抗增殖活性用MTT法测定同上。
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1.4 统计学处理
本实验中所有数据均采用
±s表示，组间分析采用t检验。2 结果
2.1 DPS对bFGF或 IL-1所致血管平滑肌细胞增殖的影响
为测定DPS抗VSMC增殖作用，细胞在于DPS已定的浓度下孵育24h后，加入50ng/ml bFGF或50 U/ml IL-1。与正常对照组相比，加入bFGF(50ng/ml)或IL-1(50 U/ml)的两组，VSMC吸光度分别增加了32%和30%，VSMC分别在含有DPS浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml的培养液中孵育24h后，其生长明显受到抑制(P<0.01)，其最佳抑制浓度为1μg/ml。而DPS在0.01μg/ml和 100μg/ml浓度下则未观察到其对VSMC增殖有抑制作用(见图1和图2)。
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Fig 1. Effects of DPS on basic fibroblast growth factor (bFGF)-induced proliferation of VSMC.
Fig 2.Effects of DPS on Interleukin-1(IL-1)-induced proliferation of VSMC.
2.2 DPS对不同浓度的bFGF或IL-1所致大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响
DPS在终浓度为1μg/m下对VSMC的抑制作用随bFGF或IL-1的浓度增加而减弱。DPS 1μg/ml对b FGF在30，50，70ng/ml或IL-1在30，50，70U/ml的浓度下所致的VSMC增殖有明显抑制作用，但DPS对b FGF在90ng/ml或IL-1 90U/ml浓度下所致VSMC的增殖则未见抑制作用(见表1和表2)。
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Tab 1 Effects of DPS on the proliferation of VSMC
induced by bFGF at different concentrations Group
Absorbance(MTT:570～630nm)
bFGF concentration(ng/ml)
30
50
70
90
control
DPS
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0.430±0.009
0.544±0.022
0.463±0.024**
0.572±0.012
0.530±0.014**
0.676±0.017
0.650±0.013*
0.767±0.032
0.745±0.016
n＝5，
±s，*P<0.05，**P<0.01 vs FGF-treated groupTab 2 Effects of DPS on the proliferation of VSMC, http://www.100md.com
induced by IL-1 at different concentrations Group
Absorbance(MTT:570～630nm)
Il-1 concentration(ng/ml)
30
50
70
90
control
DPS
0.419±0.011
0.586±0.009
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0.455±0.014**
0.554±0.019
0.482±0.009**
0.608±0.019
0.552±0.012*
0.689±0.018
0.659±0.019
n＝5，
±s，*P<0.05，**P<0.01 vs IL-1-treated group。, 百拇医药
3 讨论
本文探讨了DPS对由bFGF or IL-1所致VSMC增殖的抑制作用。血管平滑肌细胞(VSMC)在体内通常处于静止状态。然而在病理状态下，如高血压病或动脉粥样硬化，促使增殖的VSMC成为血管壁的主要成份。大量研究表明，在体内VSMC增殖的调控与正负调控因子之间存在着精细平衡密切相关。在众多促生长因子中，bFGF已成为当前研究的热点。许多研究证实，bFGF在体内、体外实验中均能刺激VSMC增殖，且该作用可被bFGF的抗体拮抗。我们在实验中发现，DPS对bFGF所致的VSMC增殖有较好的抑制作用，推测可能与DPS拮抗bFGF促增殖作用有关。并且DPS对bFGF促VSMC增值的抑制作用随着bFGF浓度的增加而减弱。Lindner等报道，肝素抑制VSMC增殖作用与其阻止bFGF与VSMC细胞表面上的位点结合有关[5]。但DPS与肝素是否存在相似的作用机制,还有待于进一步研究。目前认为IL-1促VSMC增殖的机制是通过刺激VSMC释放内源性血小板衍生生长因子(PDGF)及单核细胞衍生的生长因子，增加VSMC释放bFGF和/或增强细胞表面bFGF受体的表达来完成的，与其直接作用无关。但DPS的具体作用环节是通过直接拮抗IL-1的促增殖作用，还是抑制由IL-1激活内源性促生长因子释放目前尚不清楚。
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本文首次发现DPS抑制VSMC增殖作用，此亦可能是DPS降压作用机制。
参考文献
[1]Mandal ak,Lyden TW,Saklayen MG.Heparin lowers blood pressure:bological and clinical perspectives.Kidney Int,1995，47:1017
[2]Castellot JJ,Wright TC,Karnovsky MJ.Regulation of vascular smooth muscle cell growth by heparin and heparan sulfates.Semin Thromb Hemost,1987，13:489
[3]Campbell J H,Campbell G R.Culture techniques and their applications to studies of vascular smooth muscle.Clinical Science,1993，85:501
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[4]Rosenberg R D.Vascular smooth muscle cell proliferation:basic investigations and new therapeutic approaches.Thromb Haemostasis,1993，70:10
vascular injury is inhibited by antibody against basic fibroblast growth factor.Proc Natl Acad Sci U S A,1991，88：3739
[7]Lindner V,Olson NE,Clowes AW,Reidy MA.Inhibition of smooth muscle cell proliferation in injured rat arteries :interaction of heparin with basic fibroblast growth factor.J Clin Invest,1992，90：2044
[8]Wang GS.Progress on studies on effects of interleukin on arterial smooth muscle cells.J Foreign Medicine:Cardiovascular Disease.1997,24(5):6
收稿时间：2000-03-24, http://www.100md.com