HIV-1 p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析
作者：童贻刚 杜勇 徐静 李敬云 鲁晏希 鲍作义 王海涛
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071
关键词：人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)；p24蛋白；基因表达；大肠杆菌
中国病毒学000204 摘要：合成引物扩增HIV-1 p24基因，并将其克隆到pQE-30质粒中，使其在大肠杆菌E.coli M15中以IPTG诱导高效表达，经SDS-PAGE分析，该表达产物约占菌体总蛋白20%，并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化，洗脱产物中p24蛋白纯度达95%。ELISA分析表明，该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B，亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体，用所得抗体与HIV确认试剂反应，发现该纯化抗体仅与确认试剂中的p24蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV-1 p24蛋白，该蛋白具有良好的抗原性。
, 百拇医药
中图分类号：R512.91 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0116-06
High Level Soluble Expressiion,One-Step Purification and Characterization of HIV-1 p24 Protein
TONG Yi-gang,DU Yong,XU Jing,et al
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071,China)
Abstract:The HIV-1 p24 gene (gag gene) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into an E.coli expression vehicle pQE30 between BamH I and Kpn I sites.After induction with IPTG,the transformed E.coli strain M15 expressed the HIV-1 p24 gene efficiently.The recombinant p24 protein was expressed as a soluble protein,composing 20% of the total protein.After onestep purification with Ni-NTA+ affinity chromatography,the protein was purified to almost homogeneity.When applied to ELISA,the p24 protein exhibited good specific reactivity with sera of HIV-infected individuals.The antibodies against recombinant p24 protein from HIV infected plasma were purified and confirmed with HIV Western blot kit that the purified antibodies can only react with HIV-1 p24 antigen.It suggests that the recombinant HIV-1 p24 protein is suitable for assembling the HIV diagnostic kits.
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Key words:Human immunodeficiency virus type-1; p24 protein; Gene expression; E.coli
原核表达系统是生产蛋白抗原的一种最为经济的手段，目前许多诊断试剂所用的抗原都是由大肠杆菌表达的。但是在高效表达的同时，目的蛋白往往会形成包涵体，这对蛋白的天然结构和抗原活性造成很大的破坏，而使包涵体中的变性蛋白溶解和复性往往是一个非常费时且效率很低的过程，经常会导致重组蛋白的大量损失。本文报道了在大肠杆菌中高效表达完整的可溶性HIV-1 p24蛋白，并且经一步纯化即可得到纯品。这为大规模生产HIV诊断试剂用p24蛋白提供了可靠保障。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌种 含HIV-1全长基因组的质粒pHIV由本室保存，该HIV-1基因组为HIV-1毒株NY5和LAV重组的前病毒基因组[1]。质粒pQE30及其受体菌E.coli M15购自Qiagen公司。
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1.2 血清和血浆来源 所有血清和血浆均由全军艾滋病检测中心提供，其艾滋病感染状况经过该中心的鉴定。这些血清和血浆均来自河北省固安县献血员。
1.3 引物设计及PCR扩增 根据HIV-1的序列，用OLIGO 4.0软件辅助设计一对引物，正向引物prm12:GAGGATCCCCCATAGTGCAGAACCTC。反向引物prm13:CCGGTACCTTAGAAAACTCTTGCTTTATG。PCR反应参照《分子克隆》[2]进行，反应总体积50μL，含50mmol/L KCl,10mmol/L Tris。Cl(室温下pH8.0)，15mmol/L MgCl2,0.2mg/mL牛血清白蛋白，0.1%NP40，dNTP各200μmol/L，引物各1μmol/L，模板质粒pHIV 10ng，Taq DNA聚合酶2单位。94℃预变性3min后，按如下方式进行30次循环：94℃ 60s，58℃ 60s,72℃ 90s，最后在72℃延伸5min。
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1.4 HIV-1 p24基因的克隆 将上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用低熔点胶进行纯化[2]，然后以BamH I/Kpn I双酶切，与以BamH I/Kpn I双酶切的载体pQE30连接，转化E.coli M15。快速筛选阳性克隆的方法如下：预先制备PCR反应液(配方同上，含缓冲液，dNTP,prm12,prm13,Taq酶，但不含模板DNA)，分装成小管，每管25μL。在转化平皿背面给待筛选的克隆标记号码，以吸头挑取菌落冲洗到PCR反应管中，按照上述的PCR方法进行PCR反应。
1.5 HIV-1 p24基因在大肠肝菌中的表达 取阳性克隆接种于6mL LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素和35μg/mL卡那霉素)中，37℃过夜培养，然后以1∶100稀释于200mL LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素和35μg/mL卡那霉素)中，于37℃振荡培养5h，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续于37℃振荡培养5h，离心收集细菌。
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1.6 重组p24蛋白的分离纯化 用PBS(pH 8.0)悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度0.1mg/mL，室温放置20min，超声破碎，10000g离心10min(4℃)，分别收集上清和沉淀。参照Qiagen公司说明书，利用自该公司购买的镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)进行亲和层析。
1.7 SDS-PAGE以及ELISA分析 SDS-PAGE参照《分子克隆》[2]进行。ELISA分析方法如下：将纯化的p24蛋白稀释到2μg/mL，包被酶联板，每孔100μL，4℃过夜，以2%牛血清白蛋白封闭，4℃过夜，加入不同稀释度的血清，37℃孵育2h，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，37℃孵育2h后，以TMP显色。
1.8 重组p24蛋白的特异性分析 取500mL经诱导表达p24蛋白的菌液，离心收集细菌，超声破碎后，再离心收集上清，以镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化p24蛋白，然后以此蛋白交联Sepharose 4B(CNBr-activated Sepharose 4B Lab Pack,Pharmacia Biotech)，操作参见产品说明。以此交联填料1克装柱，纯化250mL HIV感染者血浆中的抗体。用洗脱下来的抗体与HIV确认试剂HIV BLOT 2.2(Genelabs Diagnostics,western blot assay)反应，以未经纯化的同一HIV感染者血清作为对照。操作参见产品说明书。
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2 结果
2.1 HIV-1 p24基因的克隆
用HIV-1 p24引物prm12和prm13从质粒pHIV上扩增HIV-1 p24基因序列，电泳检测表明：该扩增产物仅含一条带，长约0.7kb。用低熔点琼脂糖法回收，以BamH I/Kpn I双酶切，与双酶切的载体pQE30连接，转化E.coli M15菌株，随机挑选11个克隆，以prm12和prm13进行快速PCR筛选，结果7个克隆为阳性。进一步提取其中1号和5号质粒(分别命名为pQE24.1和pQE24.5)进行酶切鉴定，结果表明这两个质粒中BamH I/Kpn I之间有插入片段，其大小与HIV-1 p24 PCR片段的大小相当。根据p24基因的序列及载体pQE30的序列，可推测重组蛋白的氨基酸序列。图1比较了该重组蛋白与Gupta等人[3]用pQE30表达的不可溶p24蛋白之间的序列差异。
2.2 HIV-1 p24基因的表达及重组蛋白的可溶性分析
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取上述克隆QE24.1和QE24.5，以1∶100接种到3mL含双抗的LB培养基中，37℃培养4h，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养4h，离心后弃上清，加入100μL蛋白载样液，100℃水浴3min，取20μL进行SDS-PAGE电泳，结果表明：与含空载体pQE30的细菌相比，重组子QE24.1和QE24.5有一条较强的特异表达带，其分子量约为24kDa，薄层扫描分析表明：该蛋白含量占菌体总蛋白的20.4%(图2)。取克隆QE24.1进行放大培养，收集细菌，超声破碎，离心分离上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE分析，结果表明：重组蛋白主要存在于上清中，沉淀中几乎看不见p24蛋白带(图2)，说明该重组蛋白主要以可溶的形式存在。由于表达载体pQE30不带信号肽，因此重组蛋白应存在于胞浆中。
图1 可溶性和包涵体HIV-1 p24蛋白的氨基酸序列比较
, 百拇医药 A，本文表达的可溶性p24蛋白的氨基酸序列； B，Gupta等人表达的包涵体p24蛋白的氨基酸序列[3]；
*表示两序列不同； #表示半胱氨酸所在位置； 人工序列以下画线表示。
Fig.1 Sequence comparison between soluble and insoluble p24 protein synthesized in E.coli
A,Sequence of the soluble p24 protein in this paper; B,Sequence of the insoluble p24 protein reported by Gupta[3].
*indicates the amino acid difference.#indicates the Cys residue.The artificial regions are underlined.
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图2 重组HIV-1 p24蛋白的SDS-PAGE分析结果
1，蛋白质分子量标准； 2～3，含空载体pQE30的受体菌全细胞； 4～5，在IPTG诱导前后工程菌全细胞(4，诱导前；5，诱导后)； 6～7，经IPTG诱导的工程菌细胞提取物(6，上清；7，沉淀)； 8，工程菌裂解液上清经一步纯化所得到的HIV-1 p24蛋白。
Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant p24 protein
1,Protein molecular marker; 2～3,E.coli whole cell harboring empty plasmid pQE30; 4～5,E.coli whole cell harboring pQE24.1 (4,before induction; 5,after induction with IPTG); 6～7,Cell extract of E.coli harboring pQE24.1 (6,supernatant,7,precipitate); 8,The recombinant p24 protein purified by affinity chromatograpphy.
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2.3 重组HIV-1 p24蛋白的分离纯化
根据上述结果，我们采取了可溶性蛋白的纯化策略，用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行了分离纯化，分步收集洗脱成分，每管2.5mL，然后对各管进行SDS-PAGE分析，结果显示，仅前3管含有蛋白成分，重组蛋白绝大部分分布在第2管，且其纯度超过95%。
2.4 重组p24蛋白的抗原活性分析
将该蛋白稀释到2μg/mL包被酶联板，以1∶80稀释的HIV感染者血清及正常人血清与其反应，加酶标二抗及底物显色，结果表明：7份正常人血清无一与其反应，5份HIV感染者血清中有4份发生特异性免疫反应。以艾滋病人混合血清与其反应，当血清稀释度达到1∶3200时，仍然表现出较强的反应。
2.5 重组p24蛋白的特异性
, 百拇医药 用纯化的p24蛋白交联CNBr活化的Sepharose 4B，亲和层析纯化HIV感染者血浆中的抗体，再以此抗体与HIV确认试剂HIV BLOT 2.2(GenelabsDiagnostics)进行Western blot分析，结果表明：纯化抗体只能与HIV-1 p24蛋白反应，而未经纯化的同一血清可与HIV-1的多种蛋白发生反应(图3)，说明所表达和纯化的蛋白确实是HIV-1 p24蛋白，能够特异性地结合HIV感染者血清中的抗-p24抗体。
3 讨论
原核表达系统的一个主要缺点就是产物容易形成包涵体。包涵体的形成机制至今尚不完全清楚。一般认为：包涵体的产生主要是由于表达产物的不正确折叠所致，细菌中高效合成的目的蛋白不能及时折叠，造成折叠中间物的聚集，从而形成包涵体。影响包涵体形成的因素主要有：细胞内伴侣蛋白(chaperone)和折叠酶(foldase)的活性、细菌培养温度、目的蛋白的表达量、细胞内环境的pH值，此外还有一个重要因素，那就是蛋白质的一级结构即氨基酸序列。蛋白质中某些氨基酸(尤其是半胱氨酸)的改变可能会显著改变蛋白质的整体构象，从而使其容易受细胞内折叠机制的影响而顺利进行折叠。Strandberg[13]和Wetzel等[14]研究表明，重组蛋白中少数氨基酸的改变可以大大改变表达产物的可溶性，而Rinas等人[15]的研究显示，蛋白序列中某个半胱氨酸的改变即可改变整个蛋白分子的可溶性。
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到目前为止已有不少文献报道用大肠杆菌表达p24蛋白[3～12]，有人用间接的办法表达Gag-Pol融合蛋白，利用其中Pol基因编码的蛋白酶的活性对融合蛋白进行翻译后加工，结果也得到了可溶性的p24蛋白[4，10]，但是尚没有人直接高效表达可溶性p24蛋白。Gupta等[3]用与我们几乎完全相同的办法表达了HIV-1 p24蛋白，其所用载体也是pQE30，但是他们表达的产物形成了包涵体。图1比较了Gupta等表达的蛋白与我们表达的蛋白的氨基酸序列。他们所用的p24基因片段比我们用的略短，而人工序列却比我们的长，二者在序列上也有一些差异(同源性为95%，半胱氨酸的位置不同)。本研究所表达的p24蛋白的可溶性很可能与羧基端的半胱氨酸Cys230有密切的关系，Cys230很可能与Cys210形成链内二硫键，产生一个小的环形结构。Gupta等去掉了p24蛋白羧基端的Cys230，却在氨基端人为地引入了一个Cys14，它可能与Cys210形成二硫键，产生一个大的环形结构，使蛋白更加紧凑，这可能是其所表达的蛋白不溶的主要原因。
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图3 重组HIV-1 p24蛋白的特异性分析
以重组HIV-1 p24蛋白交联Sepharose 4B，亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体，用所得抗体与HIV确认试剂HIV BLOT2.2(Genelabs Diagnostics,Western blot assay)反应。Lane 26:亲和层析纯化抗体。Lane 21:未经纯化的同一血清。
Fig.3 Specificity analysis of recombinant HIV-1 p24 protein
Lane 26.Antibodies of HIV infected plasma purified by affinity chromatography with recombinant HIV-1 p24 protein linked Sepharose 4B; Lane 21.The same serum without purification.
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本研究采用目前比较先进的原核表达系统，使HIV-1 p24蛋白不仅能够高效可溶性表达，而且由于该蛋白的N末端含有6个组氨酸，可以与金属Ni离子形成鳌合物，从而可以用亲和层析的办法一步进行纯化。经一步纯化的p24蛋白纯度达95%以上，直接用于包被酶联板，无需使用细菌蛋白对一抗和二抗进行封闭，即可得到很低的背景，这对于HIV诊断试剂非常合适。虽然所表达的p24蛋白N末端11个氨基酸不属于p24蛋白，但是由于其长度短，抗原性弱，不足以导致非特异性反应，因此它将不会影响诊断试剂的特异性。结果显示，该p24蛋白能特异地识别HIV感染者血浆中的抗-p24抗体，而且可以和多数HIV感染者的血清发生反应，但不与正常人血清反应。在试验的5份HIV感染者血清中，有一份不与该蛋白反应，可能是由于该血清中不存在或仅存在极低浓度的抗-p24抗体。
童贻刚(1966年-),男,汉族,湖北武汉人,助理研究员,在读博士生,研究方向免疫学.
参考文献
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1999-01-07
1999-07-19, http://www.100md.com
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071
关键词：人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)；p24蛋白；基因表达；大肠杆菌
中国病毒学000204 摘要：合成引物扩增HIV-1 p24基因，并将其克隆到pQE-30质粒中，使其在大肠杆菌E.coli M15中以IPTG诱导高效表达，经SDS-PAGE分析，该表达产物约占菌体总蛋白20%，并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化，洗脱产物中p24蛋白纯度达95%。ELISA分析表明，该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B，亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体，用所得抗体与HIV确认试剂反应，发现该纯化抗体仅与确认试剂中的p24蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV-1 p24蛋白，该蛋白具有良好的抗原性。
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中图分类号：R512.91 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0116-06
High Level Soluble Expressiion,One-Step Purification and Characterization of HIV-1 p24 Protein
TONG Yi-gang,DU Yong,XU Jing,et al
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071,China)
Abstract:The HIV-1 p24 gene (gag gene) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into an E.coli expression vehicle pQE30 between BamH I and Kpn I sites.After induction with IPTG,the transformed E.coli strain M15 expressed the HIV-1 p24 gene efficiently.The recombinant p24 protein was expressed as a soluble protein,composing 20% of the total protein.After onestep purification with Ni-NTA+ affinity chromatography,the protein was purified to almost homogeneity.When applied to ELISA,the p24 protein exhibited good specific reactivity with sera of HIV-infected individuals.The antibodies against recombinant p24 protein from HIV infected plasma were purified and confirmed with HIV Western blot kit that the purified antibodies can only react with HIV-1 p24 antigen.It suggests that the recombinant HIV-1 p24 protein is suitable for assembling the HIV diagnostic kits.
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Key words:Human immunodeficiency virus type-1; p24 protein; Gene expression; E.coli
原核表达系统是生产蛋白抗原的一种最为经济的手段，目前许多诊断试剂所用的抗原都是由大肠杆菌表达的。但是在高效表达的同时，目的蛋白往往会形成包涵体，这对蛋白的天然结构和抗原活性造成很大的破坏，而使包涵体中的变性蛋白溶解和复性往往是一个非常费时且效率很低的过程，经常会导致重组蛋白的大量损失。本文报道了在大肠杆菌中高效表达完整的可溶性HIV-1 p24蛋白，并且经一步纯化即可得到纯品。这为大规模生产HIV诊断试剂用p24蛋白提供了可靠保障。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌种 含HIV-1全长基因组的质粒pHIV由本室保存，该HIV-1基因组为HIV-1毒株NY5和LAV重组的前病毒基因组[1]。质粒pQE30及其受体菌E.coli M15购自Qiagen公司。
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1.2 血清和血浆来源 所有血清和血浆均由全军艾滋病检测中心提供，其艾滋病感染状况经过该中心的鉴定。这些血清和血浆均来自河北省固安县献血员。
1.3 引物设计及PCR扩增 根据HIV-1的序列，用OLIGO 4.0软件辅助设计一对引物，正向引物prm12:GAGGATCCCCCATAGTGCAGAACCTC。反向引物prm13:CCGGTACCTTAGAAAACTCTTGCTTTATG。PCR反应参照《分子克隆》[2]进行，反应总体积50μL，含50mmol/L KCl,10mmol/L Tris。Cl(室温下pH8.0)，15mmol/L MgCl2,0.2mg/mL牛血清白蛋白，0.1%NP40，dNTP各200μmol/L，引物各1μmol/L，模板质粒pHIV 10ng，Taq DNA聚合酶2单位。94℃预变性3min后，按如下方式进行30次循环：94℃ 60s，58℃ 60s,72℃ 90s，最后在72℃延伸5min。
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1.4 HIV-1 p24基因的克隆 将上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用低熔点胶进行纯化[2]，然后以BamH I/Kpn I双酶切，与以BamH I/Kpn I双酶切的载体pQE30连接，转化E.coli M15。快速筛选阳性克隆的方法如下：预先制备PCR反应液(配方同上，含缓冲液，dNTP,prm12,prm13,Taq酶，但不含模板DNA)，分装成小管，每管25μL。在转化平皿背面给待筛选的克隆标记号码，以吸头挑取菌落冲洗到PCR反应管中，按照上述的PCR方法进行PCR反应。
1.5 HIV-1 p24基因在大肠肝菌中的表达 取阳性克隆接种于6mL LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素和35μg/mL卡那霉素)中，37℃过夜培养，然后以1∶100稀释于200mL LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素和35μg/mL卡那霉素)中，于37℃振荡培养5h，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续于37℃振荡培养5h，离心收集细菌。
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1.6 重组p24蛋白的分离纯化 用PBS(pH 8.0)悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度0.1mg/mL，室温放置20min，超声破碎，10000g离心10min(4℃)，分别收集上清和沉淀。参照Qiagen公司说明书，利用自该公司购买的镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)进行亲和层析。
1.7 SDS-PAGE以及ELISA分析 SDS-PAGE参照《分子克隆》[2]进行。ELISA分析方法如下：将纯化的p24蛋白稀释到2μg/mL，包被酶联板，每孔100μL，4℃过夜，以2%牛血清白蛋白封闭，4℃过夜，加入不同稀释度的血清，37℃孵育2h，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，37℃孵育2h后，以TMP显色。
1.8 重组p24蛋白的特异性分析 取500mL经诱导表达p24蛋白的菌液，离心收集细菌，超声破碎后，再离心收集上清，以镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化p24蛋白，然后以此蛋白交联Sepharose 4B(CNBr-activated Sepharose 4B Lab Pack,Pharmacia Biotech)，操作参见产品说明。以此交联填料1克装柱，纯化250mL HIV感染者血浆中的抗体。用洗脱下来的抗体与HIV确认试剂HIV BLOT 2.2(Genelabs Diagnostics,western blot assay)反应，以未经纯化的同一HIV感染者血清作为对照。操作参见产品说明书。
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2 结果
2.1 HIV-1 p24基因的克隆
用HIV-1 p24引物prm12和prm13从质粒pHIV上扩增HIV-1 p24基因序列，电泳检测表明：该扩增产物仅含一条带，长约0.7kb。用低熔点琼脂糖法回收，以BamH I/Kpn I双酶切，与双酶切的载体pQE30连接，转化E.coli M15菌株，随机挑选11个克隆，以prm12和prm13进行快速PCR筛选，结果7个克隆为阳性。进一步提取其中1号和5号质粒(分别命名为pQE24.1和pQE24.5)进行酶切鉴定，结果表明这两个质粒中BamH I/Kpn I之间有插入片段，其大小与HIV-1 p24 PCR片段的大小相当。根据p24基因的序列及载体pQE30的序列，可推测重组蛋白的氨基酸序列。图1比较了该重组蛋白与Gupta等人[3]用pQE30表达的不可溶p24蛋白之间的序列差异。
2.2 HIV-1 p24基因的表达及重组蛋白的可溶性分析
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取上述克隆QE24.1和QE24.5，以1∶100接种到3mL含双抗的LB培养基中，37℃培养4h，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养4h，离心后弃上清，加入100μL蛋白载样液，100℃水浴3min，取20μL进行SDS-PAGE电泳，结果表明：与含空载体pQE30的细菌相比，重组子QE24.1和QE24.5有一条较强的特异表达带，其分子量约为24kDa，薄层扫描分析表明：该蛋白含量占菌体总蛋白的20.4%(图2)。取克隆QE24.1进行放大培养，收集细菌，超声破碎，离心分离上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE分析，结果表明：重组蛋白主要存在于上清中，沉淀中几乎看不见p24蛋白带(图2)，说明该重组蛋白主要以可溶的形式存在。由于表达载体pQE30不带信号肽，因此重组蛋白应存在于胞浆中。
图1 可溶性和包涵体HIV-1 p24蛋白的氨基酸序列比较
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*表示两序列不同； #表示半胱氨酸所在位置； 人工序列以下画线表示。
Fig.1 Sequence comparison between soluble and insoluble p24 protein synthesized in E.coli
A,Sequence of the soluble p24 protein in this paper; B,Sequence of the insoluble p24 protein reported by Gupta[3].
*indicates the amino acid difference.#indicates the Cys residue.The artificial regions are underlined.
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图2 重组HIV-1 p24蛋白的SDS-PAGE分析结果
1，蛋白质分子量标准； 2～3，含空载体pQE30的受体菌全细胞； 4～5，在IPTG诱导前后工程菌全细胞(4，诱导前；5，诱导后)； 6～7，经IPTG诱导的工程菌细胞提取物(6，上清；7，沉淀)； 8，工程菌裂解液上清经一步纯化所得到的HIV-1 p24蛋白。
Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant p24 protein
1,Protein molecular marker; 2～3,E.coli whole cell harboring empty plasmid pQE30; 4～5,E.coli whole cell harboring pQE24.1 (4,before induction; 5,after induction with IPTG); 6～7,Cell extract of E.coli harboring pQE24.1 (6,supernatant,7,precipitate); 8,The recombinant p24 protein purified by affinity chromatograpphy.
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2.3 重组HIV-1 p24蛋白的分离纯化
根据上述结果，我们采取了可溶性蛋白的纯化策略，用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行了分离纯化，分步收集洗脱成分，每管2.5mL，然后对各管进行SDS-PAGE分析，结果显示，仅前3管含有蛋白成分，重组蛋白绝大部分分布在第2管，且其纯度超过95%。
2.4 重组p24蛋白的抗原活性分析
将该蛋白稀释到2μg/mL包被酶联板，以1∶80稀释的HIV感染者血清及正常人血清与其反应，加酶标二抗及底物显色，结果表明：7份正常人血清无一与其反应，5份HIV感染者血清中有4份发生特异性免疫反应。以艾滋病人混合血清与其反应，当血清稀释度达到1∶3200时，仍然表现出较强的反应。
2.5 重组p24蛋白的特异性
, 百拇医药 用纯化的p24蛋白交联CNBr活化的Sepharose 4B，亲和层析纯化HIV感染者血浆中的抗体，再以此抗体与HIV确认试剂HIV BLOT 2.2(GenelabsDiagnostics)进行Western blot分析，结果表明：纯化抗体只能与HIV-1 p24蛋白反应，而未经纯化的同一血清可与HIV-1的多种蛋白发生反应(图3)，说明所表达和纯化的蛋白确实是HIV-1 p24蛋白，能够特异性地结合HIV感染者血清中的抗-p24抗体。
3 讨论
原核表达系统的一个主要缺点就是产物容易形成包涵体。包涵体的形成机制至今尚不完全清楚。一般认为：包涵体的产生主要是由于表达产物的不正确折叠所致，细菌中高效合成的目的蛋白不能及时折叠，造成折叠中间物的聚集，从而形成包涵体。影响包涵体形成的因素主要有：细胞内伴侣蛋白(chaperone)和折叠酶(foldase)的活性、细菌培养温度、目的蛋白的表达量、细胞内环境的pH值，此外还有一个重要因素，那就是蛋白质的一级结构即氨基酸序列。蛋白质中某些氨基酸(尤其是半胱氨酸)的改变可能会显著改变蛋白质的整体构象，从而使其容易受细胞内折叠机制的影响而顺利进行折叠。Strandberg[13]和Wetzel等[14]研究表明，重组蛋白中少数氨基酸的改变可以大大改变表达产物的可溶性，而Rinas等人[15]的研究显示，蛋白序列中某个半胱氨酸的改变即可改变整个蛋白分子的可溶性。
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到目前为止已有不少文献报道用大肠杆菌表达p24蛋白[3～12]，有人用间接的办法表达Gag-Pol融合蛋白，利用其中Pol基因编码的蛋白酶的活性对融合蛋白进行翻译后加工，结果也得到了可溶性的p24蛋白[4，10]，但是尚没有人直接高效表达可溶性p24蛋白。Gupta等[3]用与我们几乎完全相同的办法表达了HIV-1 p24蛋白，其所用载体也是pQE30，但是他们表达的产物形成了包涵体。图1比较了Gupta等表达的蛋白与我们表达的蛋白的氨基酸序列。他们所用的p24基因片段比我们用的略短，而人工序列却比我们的长，二者在序列上也有一些差异(同源性为95%，半胱氨酸的位置不同)。本研究所表达的p24蛋白的可溶性很可能与羧基端的半胱氨酸Cys230有密切的关系，Cys230很可能与Cys210形成链内二硫键，产生一个小的环形结构。Gupta等去掉了p24蛋白羧基端的Cys230，却在氨基端人为地引入了一个Cys14，它可能与Cys210形成二硫键，产生一个大的环形结构，使蛋白更加紧凑，这可能是其所表达的蛋白不溶的主要原因。
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图3 重组HIV-1 p24蛋白的特异性分析
以重组HIV-1 p24蛋白交联Sepharose 4B，亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体，用所得抗体与HIV确认试剂HIV BLOT2.2(Genelabs Diagnostics,Western blot assay)反应。Lane 26:亲和层析纯化抗体。Lane 21:未经纯化的同一血清。
Fig.3 Specificity analysis of recombinant HIV-1 p24 protein
Lane 26.Antibodies of HIV infected plasma purified by affinity chromatography with recombinant HIV-1 p24 protein linked Sepharose 4B; Lane 21.The same serum without purification.
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本研究采用目前比较先进的原核表达系统，使HIV-1 p24蛋白不仅能够高效可溶性表达，而且由于该蛋白的N末端含有6个组氨酸，可以与金属Ni离子形成鳌合物，从而可以用亲和层析的办法一步进行纯化。经一步纯化的p24蛋白纯度达95%以上，直接用于包被酶联板，无需使用细菌蛋白对一抗和二抗进行封闭，即可得到很低的背景，这对于HIV诊断试剂非常合适。虽然所表达的p24蛋白N末端11个氨基酸不属于p24蛋白，但是由于其长度短，抗原性弱，不足以导致非特异性反应，因此它将不会影响诊断试剂的特异性。结果显示，该p24蛋白能特异地识别HIV感染者血浆中的抗-p24抗体，而且可以和多数HIV感染者的血清发生反应，但不与正常人血清反应。在试验的5份HIV感染者血清中，有一份不与该蛋白反应，可能是由于该血清中不存在或仅存在极低浓度的抗-p24抗体。
童贻刚(1966年-),男,汉族,湖北武汉人,助理研究员,在读博士生,研究方向免疫学.
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