人胚成骨细胞体外培养三维实验模型的建立
作者：李德华 刘宝林
单位：第四军医大学口腔医学院颌面外科 710032
关键词：
实用口腔医学杂志000205 〔摘要〕 目的：利用成骨细胞体外培养条件下向生物材料表面移行、贴附和 方向性排列的特性，建立骨内种植材料—人胚成骨细胞培养的三维实验模型。方法：将钛片放入长满的人胚成骨细胞层表面，给予钙化条件，即DMEM培 养液中加体积分数为10%胎牛血清、50 mg/LL-抗坏血酸、10 nmol/L地塞米松和10 mmol/L β-甘油磷酸钠。结果:活细胞跟踪观察揭示钛片放入细胞层表面后 即有细胞自细胞层表面向钛片侧壁移行、贴附，并在二者之间形成细胞桥。随着培养时间的 延长，移行贴附的细胞逐渐增多，在钛片侧壁与成骨细胞之间的界面处形成复层细胞层，进 而建立起生物材料—成骨细胞体外培养的三维实验模型。相差显微镜下复层细胞表现为折光 带，这反映生物材料引导细胞贴附并保持细胞贴附的能力。界面的组织学观察则揭示出生物 材料与细胞之间的界面关系。结论:这模型是一种理想的体外研究种 植体骨界面的研究方法。
, 百拇医药
关键词 生物相容性材料；成骨细胞；细胞培养
中图分类号：R783.1 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0099-03
A three-dimensional experimental model of endosseous implant material-human fe tal osteoblasts culture
Li Dehua,Liu Baolin
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatological College,Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
〔Abstract〕 Objective: To set up a three-dimensional model of endos seous implant material-human fetal osteoblast culture, based on the capacities o f osteoblasts cultured in vitro to migrate, attach and orient to the surface of biomaterials. Methods: Ti disc was placed on to the c onfluent cellular layer of human fetal osteoblasts, cultured in DMEM added with 100 ml/L fetal bovine serum, 50 mg/L L-ascorbic acid, 10 nmol/L dexamethasone and 10 mmol/L Na-glycerophosphate. Results: Follow-up ob servation of living cells revealed that upon the Ti disc there were cells migra ting from the cellular layer and attaching to the rim of it, forming cells bridg es between them, and then more cells were found to attach and orient as the cult ure went on. Eventually multi-layer of the cells was formed and resulted in t he three-dimensional model. Under the phase-contract microscope, cell multi-l ayer was shown to be a refractile sheet, which means the capacities of biomateri al to attract cell and maintain the cell attachment. Histological observation wi th microscope and TEM demonstrated the interfacial relation between biomaterial and cells. Conclusion:The model can be used to study the implant-bone interface in vitro.
, 百拇医药
Key words Biomaterial; Osteoblasts; Cell culture.
种植体骨界面的早期愈合过程，是决定种植体成功与否的关键性阶段，主要表现为细胞 的行为变化〔1〕，具体包括未分化间充质细胞、骨母细胞以及成骨细胞在种植体的 影响下自周围松质骨内膜向其表面移行、贴附，同时细胞出现增殖、分化、合成并分泌骨基 质。目前所采用的骨内种植材料体外实验模型及评价指标，基本上为一维实验模型。它撇开 了细胞在体内的三维空间因素，直接研究成骨细胞的自身反应，揭示细胞的生长特征、分化 程度及功能状态，使研究具体化、简单化。但对种植材料影响界面骨愈合机制的认识却仅仅 局限在细胞的一维水平〔2，3〕。然而，在界面愈合过程中，成骨细胞始终处于由细 胞外基质构成的三维立体结构之中，体内细胞的各种生物学表现均是在这种特定的生活环境 下实现的。因此，建立生物材料-成骨细胞体外培养的三维实验模型非常必要。在此基础上 ，可以深入细致地研究成骨细胞在骨愈合过程中的行为特点、影响因素以及种植体-成骨细 胞的界面关系。可目前尚未见此类三维实验模型的明确提出和实验报道。本实验将利用成骨 细胞体外培养条件下的生物学特性，建立生物材料-成骨细胞界面相互作用的体外三维实验 模型。
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1 材料与方法
1.1 钛片制备
切取直径2.5 mm、厚1.0 mm的纯钛片(TA2)，中央有一直径为1.0 mm之孔洞钛片周磨光 ，至晶相砂纸800目，清洗、钝化、消毒，备用。
1.2 成骨细胞培养
采用组织块法原代分离培养人胚成骨细胞，经权威的鉴定方法鉴定证实〔4〕。细胞 传至第10代长满后，2.5 g/L胰酶消化，制取细胞悬液(2×104个/ml)，接种6孔培养板 内(3 ml/孔)。DMEM培养液含体积分数为10%胎牛血清、10 mol/L地塞米松、50 mg/L L- 抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠，37 ℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件下培 养(图1)。至第7 天，成骨细胞已铺满培养板，形成均匀的细胞层。
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1.3 放入钛 片
在已长满人胚成骨细胞的6孔培养板内小心放入直径2.5 mm的钛片,每个钛片相距1 cm，换新 鲜培养液。以后每3 天换培养液一次，每次换液时，注意防止移动钛片。自放入钛片起开始 计算培养时间，培养时间为1个月。
1.4倒置显微镜观察
1.5组织切片观察
培养1个月后，细胞及钛片原位固定、脱水、Epon812包埋，分切包埋块，经液氮冷冻断裂法 将钛片侧壁表面的细胞完整转移至包埋块内，以水平方向进行二次包埋，超薄切片机切取细 胞厚片(厚度1.0 μm)，以美兰—碱性复红染色，光学显微镜观察。
1.6 细胞界面的透射电镜观察
细胞培养及切片制作同方法1.5，但固定与染色按常规透射电镜标本的制作方法进行。
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2 结 果
2.1 活细胞跟踪观察
放入钛片后第1天，已有散在的细胞自细胞层向钛片周边移行，并与侧壁表面贴附，形成细 胞复层，在钛片与细胞层之间可见细胞桥。细胞桥与钛片周边垂直或成一定的锐角，而移至 钛片侧壁表面的细胞则与表面周边平行贴附。第3天，相差显微镜下移行细胞呈现为折光带 ，分布于钛片周围。折光带相互连接，几乎占据整个钛片周边(图2)。高倍镜下见钛片— 成骨细胞界面处细胞与钛片侧壁紧密贴附，折光带区的移行细胞排列规则，平行于钛表面。第7天，钛片周围的折光带进一步扩大，增宽，且亮度增强。高倍镜下所见同培养第3 天。第14 天，折光带高倍镜下见细胞间出现少量颗粒状物质，散在分布。培养至1个月，细胞间 颗粒连接成片，分布于整个钛片周边移行细胞区，肉眼见呈白色，不透光。
2.2 细胞界面切片的光镜观察
水平方向组织切片光镜观察，可见弧形细胞带由 数十层细胞组成，钛片—细胞界面在内侧，结构完整。细胞核呈紫红色，以卵圆形为主，细 胞浆呈粉红色淡染(图3)。
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图1 第11代人胚成骨细胞传代第2 天(倒置显微镜，×200)图2 钛片-成骨细胞体外立体培养第3 天(相差显微镜，×40)图3 钛片 -成骨细胞体外立体培养第30 天(细胞界面原位切片，(光学显微镜，× 400)图4 钛片-成骨细胞体外立体培养第30 天细胞界面原位切片，(TEM)
2.3 细胞界面的透射电镜观察
细胞与钛片之间的界面由一层长梭形的细胞组成，胞浆内含有较丰富的线粒体和粗面内质网 ，并可见胶原纤维自胞膜向外的分泌现象(图4)。
3 讨 论
体外培养的成骨细胞是一种贴壁细胞，很难进行立体培养，目前尚无理想的立体培养模型。 一般多采用胶原作为细胞培养基底物，将其制成凝胶，使胶原纤维水合化，交织成网状立体 结构，引导细胞由胶原表面向内部移行并分布于网状结构内〔5〕。方法复杂，且三 维状态下的细胞数量有限，故不适用于模拟研究种植体骨界面的早期愈合过程。本实验则根 据体内种植体骨界面愈合早期成骨细胞的行为变化，利用体外培养条件下成骨细胞具有移行 、贴壁等特点，而建立起一种研究种植体植入早期成骨细胞的生物学反应以及种植体-成骨 细胞界面关系的实验模型。
, 百拇医药
将钛片放在成骨细胞层表面，打破了原已稳定的细胞培养体系 ，同时培养液胎牛血清中存在的大量生物大分子物质吸附于钛片表面〔6，7〕，引导 成骨细胞向钛片侧壁主动移行，并发生贴附〔8〕，在钛片侧壁与细胞层之间形成细 胞桥〔9〕。随着培养时间的延长，移行、贴附的细胞逐渐增多，形成复层细胞结构 ，细胞呈方向性排列。其中一部分细胞完全贴附于钛表面，这样就构建出成骨细胞的立体生 存环境。尽管本实验光滑表面周围细胞的透射电镜观察尚未见到明显的骨样结构，但在同类 研究中，粗糙钛表面与细胞界面处的透射电镜观察却发现典型的基质矿化过程和骨细胞的形 成。这说明此模型具有体外研究种植体骨界面的可靠性和真实性，是一个较为理想的立体模 型。它与在钛片表面直接接种细胞进行培养的方法相比，能够更真实地从动态和静态两方面 反映出体内骨愈合的早期变化过程。采用此模型并结合钛片表面直接细胞培养的一维实验模 型，即可较全面地反映出种植体对骨界面愈合早期细胞学方面的影响。
参考文献
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1，Marks SC, Popoff SN. Bone cell biology: The regulation of development, structure, and function in the skeleton. Am J Anat, 1988,183:1
2，Itakura Y, Kosugi A, Sudo H, et al. Development of a new system for evalua ting the biocompatibility of implant materials using an osteogenic cell line (MC 3T3-E1). J Biomed Mater Res, 1988,22:613
3，Davies JE, Lowenberg B, Shiga A. The bone-titanium interface in vitro. J Biomed Mater Res, 1990,24:1289
, 百拇医药
4，李德华，刘宝林，吴军正,等. 人胚成骨细胞体外原代培养和鉴定. 牙体牙髓牙周病学杂 志, 1998,8(2): 92
5，Schor SL, Schor AM, Bazill GW. The effects of fibronectin on the migration of human foreskin fibroblasts and Syrian hamster melanoma cells into three-dimensi onal gels of native collagen fibres. J Cell Sci, 1981,48:301
6，Henck LL, Pasechall HA. Direct chemical bond of bioactive glass-ceramic mater ials to bone and muscle. J Biomed Mater Res, 1973,7:25
, http://www.100md.com
7，Steel JG, Johnson G, Underwood PA. Role of serum vitronectin and fibronectin i n adhesion of fibroblasts following seeding onto tissue culture polystyrene. J B iomed Mater Res, 1992,26:861
8，Ziats NP, Miller KM, Anderson JM. in vitro and in vivo interactions ce lls with biomaterials. Biomaterials, 1988,9:5
9，Inoue T, Cox JE, Pilliar RM, et al. Effect of the surface geometry of smoo th and porous-coated titanium alloy on the orientation of fibroblasts in vitr o. J Biomed Mater Res, 1987,21:107
(收稿：1999-11-30), http://www.100md.com
单位：第四军医大学口腔医学院颌面外科 710032
关键词：
实用口腔医学杂志000205 〔摘要〕 目的：利用成骨细胞体外培养条件下向生物材料表面移行、贴附和 方向性排列的特性，建立骨内种植材料—人胚成骨细胞培养的三维实验模型。方法：将钛片放入长满的人胚成骨细胞层表面，给予钙化条件，即DMEM培 养液中加体积分数为10%胎牛血清、50 mg/LL-抗坏血酸、10 nmol/L地塞米松和10 mmol/L β-甘油磷酸钠。结果:活细胞跟踪观察揭示钛片放入细胞层表面后 即有细胞自细胞层表面向钛片侧壁移行、贴附，并在二者之间形成细胞桥。随着培养时间的 延长，移行贴附的细胞逐渐增多，在钛片侧壁与成骨细胞之间的界面处形成复层细胞层，进 而建立起生物材料—成骨细胞体外培养的三维实验模型。相差显微镜下复层细胞表现为折光 带，这反映生物材料引导细胞贴附并保持细胞贴附的能力。界面的组织学观察则揭示出生物 材料与细胞之间的界面关系。结论:这模型是一种理想的体外研究种 植体骨界面的研究方法。
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关键词 生物相容性材料；成骨细胞；细胞培养
中图分类号：R783.1 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0099-03
A three-dimensional experimental model of endosseous implant material-human fe tal osteoblasts culture
Li Dehua,Liu Baolin
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatological College,Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
〔Abstract〕 Objective: To set up a three-dimensional model of endos seous implant material-human fetal osteoblast culture, based on the capacities o f osteoblasts cultured in vitro to migrate, attach and orient to the surface of biomaterials. Methods: Ti disc was placed on to the c onfluent cellular layer of human fetal osteoblasts, cultured in DMEM added with 100 ml/L fetal bovine serum, 50 mg/L L-ascorbic acid, 10 nmol/L dexamethasone and 10 mmol/L Na-glycerophosphate. Results: Follow-up ob servation of living cells revealed that upon the Ti disc there were cells migra ting from the cellular layer and attaching to the rim of it, forming cells bridg es between them, and then more cells were found to attach and orient as the cult ure went on. Eventually multi-layer of the cells was formed and resulted in t he three-dimensional model. Under the phase-contract microscope, cell multi-l ayer was shown to be a refractile sheet, which means the capacities of biomateri al to attract cell and maintain the cell attachment. Histological observation wi th microscope and TEM demonstrated the interfacial relation between biomaterial and cells. Conclusion:The model can be used to study the implant-bone interface in vitro.
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Key words Biomaterial; Osteoblasts; Cell culture.
种植体骨界面的早期愈合过程，是决定种植体成功与否的关键性阶段，主要表现为细胞 的行为变化〔1〕，具体包括未分化间充质细胞、骨母细胞以及成骨细胞在种植体的 影响下自周围松质骨内膜向其表面移行、贴附，同时细胞出现增殖、分化、合成并分泌骨基 质。目前所采用的骨内种植材料体外实验模型及评价指标，基本上为一维实验模型。它撇开 了细胞在体内的三维空间因素，直接研究成骨细胞的自身反应，揭示细胞的生长特征、分化 程度及功能状态，使研究具体化、简单化。但对种植材料影响界面骨愈合机制的认识却仅仅 局限在细胞的一维水平〔2，3〕。然而，在界面愈合过程中，成骨细胞始终处于由细 胞外基质构成的三维立体结构之中，体内细胞的各种生物学表现均是在这种特定的生活环境 下实现的。因此，建立生物材料-成骨细胞体外培养的三维实验模型非常必要。在此基础上 ，可以深入细致地研究成骨细胞在骨愈合过程中的行为特点、影响因素以及种植体-成骨细 胞的界面关系。可目前尚未见此类三维实验模型的明确提出和实验报道。本实验将利用成骨 细胞体外培养条件下的生物学特性，建立生物材料-成骨细胞界面相互作用的体外三维实验 模型。
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1 材料与方法
1.1 钛片制备
切取直径2.5 mm、厚1.0 mm的纯钛片(TA2)，中央有一直径为1.0 mm之孔洞钛片周磨光 ，至晶相砂纸800目，清洗、钝化、消毒，备用。
1.2 成骨细胞培养
采用组织块法原代分离培养人胚成骨细胞，经权威的鉴定方法鉴定证实〔4〕。细胞 传至第10代长满后，2.5 g/L胰酶消化，制取细胞悬液(2×104个/ml)，接种6孔培养板 内(3 ml/孔)。DMEM培养液含体积分数为10%胎牛血清、10 mol/L地塞米松、50 mg/L L- 抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠，37 ℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件下培 养(图1)。至第7 天，成骨细胞已铺满培养板，形成均匀的细胞层。
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1.3 放入钛 片
在已长满人胚成骨细胞的6孔培养板内小心放入直径2.5 mm的钛片,每个钛片相距1 cm，换新 鲜培养液。以后每3 天换培养液一次，每次换液时，注意防止移动钛片。自放入钛片起开始 计算培养时间，培养时间为1个月。
1.4倒置显微镜观察
1.5组织切片观察
培养1个月后，细胞及钛片原位固定、脱水、Epon812包埋，分切包埋块，经液氮冷冻断裂法 将钛片侧壁表面的细胞完整转移至包埋块内，以水平方向进行二次包埋，超薄切片机切取细 胞厚片(厚度1.0 μm)，以美兰—碱性复红染色，光学显微镜观察。
1.6 细胞界面的透射电镜观察
细胞培养及切片制作同方法1.5，但固定与染色按常规透射电镜标本的制作方法进行。
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2 结 果
2.1 活细胞跟踪观察
放入钛片后第1天，已有散在的细胞自细胞层向钛片周边移行，并与侧壁表面贴附，形成细 胞复层，在钛片与细胞层之间可见细胞桥。细胞桥与钛片周边垂直或成一定的锐角，而移至 钛片侧壁表面的细胞则与表面周边平行贴附。第3天，相差显微镜下移行细胞呈现为折光带 ，分布于钛片周围。折光带相互连接，几乎占据整个钛片周边(图2)。高倍镜下见钛片— 成骨细胞界面处细胞与钛片侧壁紧密贴附，折光带区的移行细胞排列规则，平行于钛表面。第7天，钛片周围的折光带进一步扩大，增宽，且亮度增强。高倍镜下所见同培养第3 天。第14 天，折光带高倍镜下见细胞间出现少量颗粒状物质，散在分布。培养至1个月，细胞间 颗粒连接成片，分布于整个钛片周边移行细胞区，肉眼见呈白色，不透光。
2.2 细胞界面切片的光镜观察
水平方向组织切片光镜观察，可见弧形细胞带由 数十层细胞组成，钛片—细胞界面在内侧，结构完整。细胞核呈紫红色，以卵圆形为主，细 胞浆呈粉红色淡染(图3)。
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图1 第11代人胚成骨细胞传代第2 天(倒置显微镜，×200)图2 钛片-成骨细胞体外立体培养第3 天(相差显微镜，×40)图3 钛片 -成骨细胞体外立体培养第30 天(细胞界面原位切片，(光学显微镜，× 400)图4 钛片-成骨细胞体外立体培养第30 天细胞界面原位切片，(TEM)
2.3 细胞界面的透射电镜观察
细胞与钛片之间的界面由一层长梭形的细胞组成，胞浆内含有较丰富的线粒体和粗面内质网 ，并可见胶原纤维自胞膜向外的分泌现象(图4)。
3 讨 论
体外培养的成骨细胞是一种贴壁细胞，很难进行立体培养，目前尚无理想的立体培养模型。 一般多采用胶原作为细胞培养基底物，将其制成凝胶，使胶原纤维水合化，交织成网状立体 结构，引导细胞由胶原表面向内部移行并分布于网状结构内〔5〕。方法复杂，且三 维状态下的细胞数量有限，故不适用于模拟研究种植体骨界面的早期愈合过程。本实验则根 据体内种植体骨界面愈合早期成骨细胞的行为变化，利用体外培养条件下成骨细胞具有移行 、贴壁等特点，而建立起一种研究种植体植入早期成骨细胞的生物学反应以及种植体-成骨 细胞界面关系的实验模型。
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将钛片放在成骨细胞层表面，打破了原已稳定的细胞培养体系 ，同时培养液胎牛血清中存在的大量生物大分子物质吸附于钛片表面〔6，7〕，引导 成骨细胞向钛片侧壁主动移行，并发生贴附〔8〕，在钛片侧壁与细胞层之间形成细 胞桥〔9〕。随着培养时间的延长，移行、贴附的细胞逐渐增多，形成复层细胞结构 ，细胞呈方向性排列。其中一部分细胞完全贴附于钛表面，这样就构建出成骨细胞的立体生 存环境。尽管本实验光滑表面周围细胞的透射电镜观察尚未见到明显的骨样结构，但在同类 研究中，粗糙钛表面与细胞界面处的透射电镜观察却发现典型的基质矿化过程和骨细胞的形 成。这说明此模型具有体外研究种植体骨界面的可靠性和真实性，是一个较为理想的立体模 型。它与在钛片表面直接接种细胞进行培养的方法相比，能够更真实地从动态和静态两方面 反映出体内骨愈合的早期变化过程。采用此模型并结合钛片表面直接细胞培养的一维实验模 型，即可较全面地反映出种植体对骨界面愈合早期细胞学方面的影响。
参考文献
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1，Marks SC, Popoff SN. Bone cell biology: The regulation of development, structure, and function in the skeleton. Am J Anat, 1988,183:1
2，Itakura Y, Kosugi A, Sudo H, et al. Development of a new system for evalua ting the biocompatibility of implant materials using an osteogenic cell line (MC 3T3-E1). J Biomed Mater Res, 1988,22:613
3，Davies JE, Lowenberg B, Shiga A. The bone-titanium interface in vitro. J Biomed Mater Res, 1990,24:1289
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4，李德华，刘宝林，吴军正,等. 人胚成骨细胞体外原代培养和鉴定. 牙体牙髓牙周病学杂 志, 1998,8(2): 92
5，Schor SL, Schor AM, Bazill GW. The effects of fibronectin on the migration of human foreskin fibroblasts and Syrian hamster melanoma cells into three-dimensi onal gels of native collagen fibres. J Cell Sci, 1981,48:301
6，Henck LL, Pasechall HA. Direct chemical bond of bioactive glass-ceramic mater ials to bone and muscle. J Biomed Mater Res, 1973,7:25
, http://www.100md.com
7，Steel JG, Johnson G, Underwood PA. Role of serum vitronectin and fibronectin i n adhesion of fibroblasts following seeding onto tissue culture polystyrene. J B iomed Mater Res, 1992,26:861
8，Ziats NP, Miller KM, Anderson JM. in vitro and in vivo interactions ce lls with biomaterials. Biomaterials, 1988,9:5
9，Inoue T, Cox JE, Pilliar RM, et al. Effect of the surface geometry of smoo th and porous-coated titanium alloy on the orientation of fibroblasts in vitr o. J Biomed Mater Res, 1987,21:107
(收稿：1999-11-30), http://www.100md.com